Summary
Dit protocol beschrijft grootte-uitsluitingschromatografie, een gemakkelijke en reproduceerbare techniek voor het verrijken van Mycobacterium tuberculosis extracellulaire blaasjes uit kweeksupernatanten.
Abstract
De rol van extracellulaire blaasjes (EV's) in de context van bacteriële infectie is naar voren gekomen als een nieuwe weg voor het begrijpen van microbiële fysiologie. Specifiek spelen Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EV's een rol in de gastheer-pathogeen interactie en reactie op omgevingsstress. Mtb EV's zijn ook zeer antigeen en hebben potentieel als vaccincomponenten. De meest gebruikelijke methode voor het zuiveren van Mtb EV's is ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt. Dit proces heeft verschillende beperkingen, waaronder een lage doorvoer, lage opbrengst, afhankelijkheid van dure apparatuur, technische uitdagingen en het kan een negatieve invloed hebben op de resulterende voorbereiding. Size exclusion chromatography (SEC) is een zachtere alternatieve methode die veel van de beperkingen van ultracentrifugatie bestrijdt. Dit protocol toont aan dat SEC effectief is voor Mtb EV-verrijking en produceert hoogwaardige Mtb EV-preparaten met een verhoogde opbrengst op een snelle en schaalbare manier. Bovendien toont een vergelijking met ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt door kwantificerings- en kwalificatieprocedures de voordelen van SEC aan. Terwijl de evaluatie van ev-kwantiteit (nanodeeltjestrackinganalyse), fenotype (transmissie-elektronenmicroscopie) en inhoud (Western blotting) is afgestemd op Mtb EV's, kan de geleverde workflow worden toegepast op andere mycobacteriën.
Introduction
Extracellulaire vesicle (EV) afgifte door pathogenen kan de sleutel zijn tot het ontsluiten van nieuwe technologieën om infectieziekten te beheersen1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is een ziekteverwekker van hoge betekenis, infecteert ongeveer een derde van de wereldbevolking en eist elk jaar het leven van miljoenen mensen2. Ev-productie door Mtb is goed gedocumenteerd maar ongrijpbaar in de biogenese en gevarieerde rollen (d.w.z. immunostimulerend, immunosuppressief, ijzer- en nutriëntenacquisitie) van deze EV's in de context van infectie 3,4,5. Inspanningen om de samenstelling van Mtb EV's te begrijpen onthulden 50-150 nm lipidemembraan-ingesloten bollen afgeleid van het plasmamembraan met lipiden en eiwitten van immunologische betekenis 3,6. Onderzoek naar de rol van MTB EV's in de bacteriële fysiologie heeft het belang van bacteriële EV-modulatie als reactie op omgevingsstress voor overleving aan het lichtgebracht 5. Gastheer-pathogeen interactiestudies zijn ingewikkelder om te interpreteren, maar er zijn aanwijzingen dat Mtb EV's de immuunrespons van de gastheer kunnen beïnvloeden en mogelijk kunnen dienen als een effectieve vaccinatiecomponent 3,4,7.
De meeste studies van Mtb EV's tot nu toe hebben vertrouwd op dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie voor blaasjesverrijking8. Dit is effectief geweest voor kleinschalige studies; deze techniek heeft echter verschillende technische en logistieke uitdagingen. Alternatieve workflows koppelen meerstaps centrifugatie, voor het verwijderen van hele cellen en groot puin, met een laatste ultracentrifugatiestap naar pellet-EV's. Deze methodologie kan variëren in efficiëntie en resulteert vaak in een lage opbrengst en co-zuivering van oplosbare niet-blaasjes geassocieerde biomoleculen, terwijl het ook de integriteit van blaasjes beïnvloedt9. Bovendien is dit proces tijdrovend, handmatig intensief en zeer beperkt in doorvoer vanwege apparatuurbeperkingen.
Het huidige protocol beschrijft een alternatieve techniek voor ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt: grootte-exclusiechromatografie (SEC). Deze methode is gedemonstreerd voor omgevingsmycobacteriën en in het huidige werk is het geëxtrapoleerd naar Mtb10. Een in de handel verkrijgbare kolom en automatische fractiecollector kunnen de consistentie in de vesische bereiding verbeteren en de noodzaak voor specifieke, dure apparatuur verminderen. Het is ook mogelijk om dit protocol in een fractie van de tijd te voltooien in vergelijking met ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt, waardoor de doorvoer toeneemt. Deze techniek is technisch minder uitdagend, waardoor het gemakkelijker te beheersen is en kan de reproduceerbaarheid tussen / intra-laboratoria vergroten. Ten slotte heeft SEC een hoge scheidingsefficiëntie en is zachtaardig, waardoor de integriteit van de blaasjes behouden blijft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het Colorado State University Institutional Biosafety Committee keurde de huidige studie goed (19-046B). De teelt van Mycobacterium tuberculosis en het oogsten van EV-rijke kweeksupernatanten werden uitgevoerd door getraind personeel in een laboratorium met hoge containment. De materialen werden uit het gebied met hoge insluiting verplaatst nadat een geldige inactiveringsmethode was uitgevoerd, bevestigd en goedgekeurd door het institutionele bioveiligheidsbeleid. Hoewel het repliceren van het protocol, als gevalideerde inactivatie of steriele filtratiemethode niet haalbaar is, moeten de volgende procedures worden uitgevoerd in een laboratorium met een hoge containment.
1. Bereiding van ruw MTB EV-concentraat
OPMERKING: Voor gedetailleerde procedures voor de teelt van Mtb en de bereiding van kweekfiltraateiwit (CFP), zie referenties11,12. Het wordt aanbevolen dat bacteriële kweekmedia vrij zijn van groeisupplementen met EV-bevattende of eiwithoudende componenten, zoals Oleic Albumin Dextrose Catalase (OADC) en detergentia zoals Tween. Het wordt ook aanbevolen om de kwaliteit van de bacteriecultuur en het geoogste GVB te screenen om een beperkte celdood en lysis13,14 te garanderen.
- Bereid een 100 kDa moleculair gewichtsafsnijding (MWCO) centrifugaalfilter (zie Materiaaltabel) door de volledige volumecapaciteit van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (1x PBS) toe te voegen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2.800 x g bij 4 °C.
OPMERKING: Als u een filter zonder dead stop volume gebruikt, moet ervoor worden gezorgd dat het monstervolume niet onder het filterniveau daalt, wat resulteert in volledige filterdroging tijdens centrifugatie. - Gooi de doorstroom en eventuele resterende PBS weg voordat u de monsterkamer met Mtb CFP tot de maximale capaciteit vult. Centrifugeer bij 2.800 x g bij 4 °C totdat het volume is teruggebracht tot het minimumvolume van het ultrafiltratieapparaat. Herhaal indien nodig en voeg meer GVB toe aan de eenheid totdat het volledige monster voldoende is verkleind.
OPMERKING: Bewaar indien gewenst een deel van het 100 kDa doorstroommateriaal (100F) voor downstream kwalificatie. Bewaren bij 4 °C. - Voeg 1x PBS toe aan de filtereenheid met het concentraat tot de totale apparaatcapaciteit. Verlaag het volume zoals beschreven in 1.2. Herhaal deze stap vijf keer om te zorgen voor volledig wassen en bufferuitwisseling.
- Herstel het 100 kDa geconcentreerde CFP-retentaat (100R) volgens de specificaties van het ultrafiltratieapparaat (zie Materiaaltabel). Zodra de 100R is hersteld, wast u het filter minstens drie keer met een minimaal volume van 1x PBS en poolt u de was met de 100R om het herstel te maximaliseren.
- Kwantificeer het 100R-materiaal met een bicinchoninische assay (BCA) volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). Gebruik voor het uitvoeren van de test verschillende verdunningen van monsters 1:2, 1:5 en 1:10 in PBS. Test het monster in drievoud.
OPMERKING: Bewaar indien gewenst een deel van het 100R-materiaal voor downstream-kwalificatie. Bewaren bij 4 °C.
2. Grootte-uitsluitingschromatografie voor de verrijking van MTB EV's van CFP
OPMERKING: De volgende procedure is specifiek voor het gebruik van 3 mg 100R Mtb CFP met SEC-kolom en automatische fractiecollector (AFC, zie Materiaaltabel). Het kan worden aangepast voor andere startconcentraties en kolomtypen door de specificaties van de fabrikant te volgen. Bovendien wordt de gebruikers aangeraden om de gebruikershandleiding van de automatische breukverzamelaar te lezen en te begrijpen.
- Laat de SEC-kolom in evenwicht brengen tot kamertemperatuur.
- Schakel de AFC in met behulp van de aan/uit-schakelaar aan de achterkant van de toreneenheid en pas de instellingen voor de loadcel aan, indien nodig, door op SETUP te drukken op het touchscreen van het hoofdmenu. De loadcel mag alleen worden gekalibreerd bij het eerste gebruik, na elke software-update en als inconsistentie in de volumes van de fractieverzameling wordt opgemerkt.
- Lijn in het scherm SETUP de carrousel uit door CARROUSEL > KALIBREREN te selecteren. Plaats de carrousel met de 13 kleine gaatjes naar boven in de AFC-toren en stel de carrousel zo in dat het vloeistofmondstuk zich direct boven de spoelpositie bevindt door op de knoppen - en / of + te drukken.
- Verwijder de doppen uit de gebalanceerde SEC-kolom. Schuif de SEC-kolom in de juiste kolombevestiging en installeer deze zorgvuldig op de AFC-toren. Zorg ervoor dat de RFID-tag (Radio Frequency Identification) op de kolom naar de AFC is gericht en controleer of de verbinding tussen de kolom en de klep veilig is. Plaats de afvaluitlaatbuis in een opvangbak.
- Selecteer in het scherm SETUP de optie Collectieschema en stel het aantal in op 13 en de grootte op 0,5 ml door op de knoppen - en/of + te drukken. Laat de instelling "Buffervolume" als de standaardinstelling van 2,7 ml en sluit vervolgens het venster "Collectieschema" door op X te drukken.
- Selecteer COLLECTIE STARTEN in het startscherm en bevestig de collectieparameters door JA te selecteren. Laad 13 gelabelde microcentrifugebuizen van 1,7 ml met de deksels open en gericht op het carrouselcentrum.
- Ga verder met de AFC door OK te selecteren, monteer vervolgens het kolomreservoir en ga opnieuw verder door op OK te drukken. Selecteer de optie om de kolom leeg te maken door op JA te drukken en voeg één kolomvolume van 0,2 μm gefilterd PBS toe om eventuele opslagbuffers te verwijderen. Zodra de spoeling is voltooid, gaat u verder met de AFC door op OK te drukken.
- Plaats het carrouseldeksel over de AFC en druk op OK. Bereid één kolomvolume van 0,2 μm gefilterd PBS voor. Gebruik een pipet om overtollige buffer uit de kolom te verwijderen.
- Breng 3 mg 100R monster zoals gekwantificeerd in stap 1,5 tot 500 μL met 1x PBS. Voeg het monster van 3 mg toe aan de bovenkant van de kolom. Zet de AFC vooruit en laat het monster in de friet lopen. Zodra het monster volledig in de kolom is gekomen, voegt u het in stap 2.6 voorbereide PBS toe aan het reservoir.
- Controleer de uitvoering van de AFC terwijl deze eerst het leegtevolume en vervolgens de opgegeven fracties verzamelt. Nadat de run is voltooid en de carrousel terugkeert naar de afvalpositie, verwijdert u de afdekking en verwijdert u de fractiebuizen uit de carrousel. Bewaar de fracties bij 4 °C voorafgaand aan de kwantificering (stap 3) en kwalificatie (stap 4).
- Als de kolom opnieuw moet worden gebruikt, selecteert u de optie om de kolom schoon te maken door op JA te drukken; druk anders op NEE. Volg de instructies op de AFC.
OPMERKING: Zodra de kolom is gewassen en de opslagbuffer is doorgelopen, kan deze worden verwijderd, afgedekt en bewaard bij 4 °C.
3. Kwantificering van de MTB EV's
- Meet de eiwitconcentratie voor elke fractie met behulp van BCA en micro BCA12.
- Gebruik voor 0,5 ml fracties verzameld uit 3 mg 100R Mtb CFP de micro BCA met een 1:3 verdunning voor fracties genummerd 1-7 van elk monster in drievoud.
- Gebruik voor 0,5 ml fracties genummerd 5-13 de BCA zonder verdunning voor elk monster in drievoud.
OPMERKING: Het overlappen van de assays voor breuken 5-7 helpt ervoor te zorgen dat alle fracties een leesbare output hebben.
- Kwantificeer de deeltjesconcentratie voor elke fractie met behulp van nanodeeltjes tracking analyse (NTA).
- Verdun de monsters in 1 ml 1x PBS met behulp van de volgende voorgestelde startverhoudingen; gebruik voor fracties 1-3 1:100 en gebruik vervolgens voor de resterende fracties een verdunning van 1:10.
- Vortex de verdunde oplossingen en trek het monster vervolgens in een wegwerpspuit van 1 ml. Plaats de spuit in een automatische spuitpomp indien beschikbaar.
- Stel de spuitpomp in op 30 μL/min en gebruik de video-opname-instellingen met een schermversterking van 10-12 en een cameraniveau van 10-12. Pas de focus voor elk monster aan.
- Verzamel minimaal drie video's op 30 s elk met behulp van een constante stroom.
- Voer de analyse uit met de softwaredetectiedrempel ingesteld op vijf.
OPMERKING: Het is mogelijk dat het niet mogelijk is om NTA-gegevens voor de meest recente fracties (>7) te verkrijgen zonder een aanzienlijk monstervolume op te offeren.
4. Kwalificatie van MTB EV's
- Visualiseer het algemene eiwitprofiel van elke fractie met behulp van een zilvergekleurde eiwitgel.
OPMERKING: Gedetailleerde procedures voor SDS-PAGE en zilvervlek zijn te vinden in Referentie15.- Voeg sds-monsterbuffer toe aan 10 μl van elke fractie en 5 μg CFP, 100R en 100F. Kook gedurende 5 minuten bij 100 °C en laad vervolgens op een 4% -12% Bis-Tris Gel met een moleculaire gewichtsladder voor polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) (zie Materiaaltabel).
- Laat de gel draaien met behulp van 1x 2-[N-morpholino]ethaansulfonzuur (MES) lopende buffer (zie Tabel van materialen) en een 200 V stroom gedurende 35 min.
- Verwijder de gel van de cassette en ga verder met zilverkleuring15.
- Evalueer de aan- of afwezigheid van EV-markers in elke fractie door Western blot.
OPMERKING: Gedetailleerde procedures voor Western blotting zijn te vinden in Referentie15.- Voer een SDS-PAGE-gel uit zoals beschreven in stap 4.1.1-4.1.2.
- Verwijder de gel van de cassette en breng de opgeloste eiwitten over naar een nitrocellulosemembraan van 0,2 μm (zie materiaaltabel) door minimaal 1 uur een stroom van 50 V toe te passen.
- Voer Western blot-analyse uit om interessante eiwitten te evalueren. Primaire antilichamen tegen LpqH, lipoarabinomannan (LAM) en GroES (zie Materiaaltabel) worden aanbevolen.
- Poolfracties op basis van de aan- of afwezigheid van markers zoals van toepassing voor de downstreamtoepassing.
- Bevestig de aanwezigheid van intacte blaasjes door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).
- Fixeer 15 μL van het blaasjesmonster door 15 μL 4% EM-klasse paraformaldehyde toe te voegen en bewaar het bij 4 °C 's nachts.
- Bereid een 200 mesh formvar-carbon gecoat koper TEM-rooster voor door het oppervlak te reinigen en een hydrofiel substraat te maken.
OPMERKING: Plasmareiniging met 95% argon, 5% zuurstof en 30% plasmavermogen gedurende 1 minuut wordt aanbevolen. - Laat 10 μL van het vaste monster op het rooster vallen en laat het monster gedurende 10 minuten hechten en veeg vervolgens de overtollige vloeistof weg met filterpapier.
- Drijf het rooster op een druppel ultrapuur water gedurende 30 s en veeg vervolgens overtollige vloeistof weg.
- Laat het rooster gedurende 2 minuten op een d% EM-kwaliteit uranylacetaatdruppel drijven en de overtollige vloeistof vervolgens wegvegen.
- Laat het rooster volledig aan de lucht drogen.
- Afbeelding met een TEM (zie Materiaaltabel) bij 100 kV of iets dergelijks.
OPMERKING: Andere EV-kwantificerings- en karakteriseringsmethoden moeten worden gebruikt op basis van downstreamtoepassingen. De minimale informatie voor studies van extracellulaire blaasjes18 moet worden geraadpleegd voor richtlijnen om de striktheid en reproduceerbaarheid van alle EV-onderzoeken te waarborgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kweekfiltraateiwit (CFP) van Mycobacterium tuberculosis (Mtb) werd geconcentreerd, gekwantificeerd en vervolgens werd 3 mg materiaal aangebracht op een sec-kolom (size exclusion chromatography). De eiwit- en deeltjesconcentraties werden opgesomd door respectievelijk BCA en NTA. De verwachte marges voor eiwit- en deeltjesterugwinning plus de exacte waarden die voor deze resultaten zijn verkregen, worden weergegeven in tabel 1. Waarden die veel hoger zijn dan deze bereiken kunnen wijzen op verontreiniging of problemen met de integriteit van de kolom. Waarden die aanzienlijk lager zijn, wijzen op problemen in de ultrafiltratiestappen en daarom moet de doorstroom worden vergeleken met het startende GVB en 100R om te bepalen of er een succesvolle concentratie is opgetreden. Een niet-specifieke eiwitzilvervlek laat zien dat latere fracties meer eiwit bevatten en lijken op het 100R-materiaal (figuur 1).
Western blots van de fracties tonen aan dat lipoarabinomannan (LAM) aanwezig is over de fracties, met latere fracties die een lagere intensiteitsbanding vertonen (figuur 2A, aanvullende figuur 1). De 19 kDa lipoproteïne LpqH, waarvan bekend is dat deze aanwezig is in Mtb EV's 3,19, is verrijkt in de vroegste fracties van de SEC (figuur 2B, aanvullende figuur 1). Het 10 kDa chaperonine-eiwit GroES is afwezig in de vroegste fracties van de SEC (figuur 2C, aanvullende figuur 1); deze bevinding komt overeen met eerder gepubliceerde studies met betrekking tot GroES als een verontreiniging tijdens Mtb EV-verrijking12 en dient als een negatieve controle voor mtb EV-aanwezigheid. Transmission Electron Microscopy (TEM) bevestigt de aanwezigheid van gesloten, membraangebonden blaasjes (figuur 3A). Een vergelijking van Mtb EV's gescheiden door dichtheidsgradiënt ultrafiltratie en deze SEC-methode is weergegeven in tabel 2. SEC biedt een hoger eiwit- en deeltjesherstel voor drie technische replicaties van hetzelfde GVB. Deze resultaten zijn consistent in meerdere batches van CFP (gegevens niet weergegeven). Beide methoden resulteren in gesloten, membraangebonden blaasjes in het verwachte groottebereik, zoals aangetoond door TEM (figuur 3) en NTA (figuur 4).
Al met al tonen deze gegevens verrijking van Mtb EV's in de vroege SEC-fracties. De hoogste NTA-waarden komen voor in fracties 1-3 en het eiwitgehalte neemt toe naarmate het fractiegetal stijgt, wat wijst op de scheiding van oplosbare eiwitten van de EV's (tabel 1). Omdat fractie 4 bewijs van GroES bevat (figuur 2C, aanvullende figuur 1), werd deze fractie niet opgenomen in het gepoolde materiaal voor TEM. Afhankelijk van de downstreamtoepassing moet worden overwogen specifieke fracties voor de poolingstrategie op te nemen of uit te sluiten.
Figuur 1: Zilvervlek per fractie. Een SDS-PAGE gel gekleurd met zilver toont het algemene eiwitprofiel voor elke fractie. CFP = 5 μg Mtb CFP, 100R = 5 μg 100R, 100F = 5 μg 100F, 1-11 = 10 μL SEC-fracties 1-11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Western blots per fractie. Western blots detecteren (A) LAM, (B) LpqH en (C) GroES, wat eiwitmarkerveranderingen in de fracties aantoont. CFP = 5 μg Mtb CFP, 100R = 5 μg 100R, 100F = 5 μg 100F, 1-11 = 10 μL SEC-fracties 1-11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Transmission Electron Microscopy (TEM) beelden. (A) SEC fracties 1-3 gepoold voorafgaand aan fixatie. (B) De ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt van MTB EV's was negatief gekleurd voor TEM-beeldvorming. Schaalstaven = 200 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) distributie. (A) SEC fracties 1-3. (B) De dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie MTB EV's werden geanalyseerd met nanodeeltjes tracking analyse. De grootteverdeling wordt weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Fractie | Eiwitterugwinningsbereik (μg/μL) | Deeltjesterugwinningsbereik (per μL) | Resultaat eiwitterugwinning (μg/μL) | Resultaat deeltjesterugwinning (per μL) |
| 1 | 0.01-0.03 | 1E8 tot 3E8 | 0.013 | 1,60E+08 |
| 2 | 0.02-0.04 | 2E8 tot 4E8 | 0.026 | 2.10E +08 |
| 3 | 0.02-0.04 | 2e7 - 6e7 | 0.024 | 5,20E+07 |
| 4 | 0.03-0.05 | 7e6 - 2e7 | 0.032 | 1.30E+07 |
| 5 | 0.05-0.09 | 1e6 - 5e6 | 0.053 | 4.20E+06 |
| 6 | 0.09-0.2 | 1e6 - 5e6 | 0.099 | 5,20E+06 |
| 7 | 0.1-0.3 | 1e6 - 3e6 | 0.234 | 2.70E+06 |
| 8 | 0.3-0.5 | 1e6 - 4e6 | 0.398 | 4.20E+06 |
| 9 | 0.4-0.6 | 1e6 - 3e6 | 0.543 | 4.10E+06 |
| 10 | 0.5-0.7 | 1e6 - 3e6 | 0.661 | 1.70E+06 |
| 11 | 0.6-0.8 | 1e6 - 3e6 | 0.736 | 1.40E+06 |
Tabel 1: Eiwit- en deeltjesterugwinning per fractie. Verwacht eiwit- en deeltjesterugwinningsbereik per fractie op basis van 3 mg uitgangsmateriaal. De exacte waarden voor het verkrijgen van het materiaal dat in dit onderzoek wordt gebruikt, zijn opgenomen in de twee meest rechtse kolommen.
| Verrijkingsmethode | Totaal eiwit teruggewonnen (μg) | Totaal aantal teruggewonnen deeltjes |
| Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie | 3.14 | 1.82E+10 |
| 3.88 | 1,93e+10 | |
| 3.20 | 1.65E+10 | |
| Grootte-uitsluiting chromatografie F1-3 | 12.96 | 4,05E+10 |
| 14.14 | 4.15E+10 | |
| 14.74 | 4.35e+10 |
Tabel 2: Methodevergelijking van eiwit- en deeltjesterugwinning. Eiwitopbrengst gemeten met BCA en totaal aantal deeltjes gemeten door NTA voor Mtb EV's afkomstig van 3 mg van hetzelfde 100R-uitgangsmateriaal, verrijkt met behulp van de gerefereerde dichtheidsgradiënt ultracentrifugatiemethode8 of deze SEC-methode (drievoud).
Aanvullende figuur 1: Originele Western blots (niet bijgesneden) uit figuur 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mycobacterium tuberculosis extracellulaire blaasjes zijn zeer antigene reservoirs, die ze presenteren als een aantrekkelijke manier voor het ontwikkelen van diagnostische hulpmiddelen en toekomstige vaccins 4,19,20. Historisch gezien is ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt gebruikt om Mtb EV's te scheiden van ander oplosbaar, uitgescheiden materiaal8. Hoewel dit proces effectief is, is het ook tijdrovend, technisch uitdagend en kan het de integriteit van de resulterende EV-voorbereidingen beïnvloeden 9,10. Het gepresenteerde protocol biedt een alternatieve methode voor Mtb EV-preparaten door middel van grootte-uitsluitingschromatografie (SEC).
Er zijn verschillende kritieke punten voor succes in deze methode. De eerste Mtb CFP-voorbereiding zal de kwaliteit en opbrengst van blaasjes na SEC beïnvloeden. Het wordt aanbevolen om GVB te oogsten op of vóór de mid-log fase van de groei om het niveau van cellulaire lysis op het moment van de oogst te beperken. Late log en stationaire groeifaseculturen kunnen hogere niveaus van cellyse bevatten en kunnen resulteren in de identificatie van intracellulaire eiwitten en artefactuele EV-achtige structuren, spontaan gegenereerd uit de membraanfragmenten van de gelyseerde cellen, als een belangrijke bijdrage aan het verzamelde CFP 12,13,14 . Dit moet worden geëvalueerd voordat met dit protocol wordt begonnen, omdat membraanblaasjes van gelyseerde cellen zullen co-zuiveren met uitgescheiden Mtb EV's en potentiële scheeftrekking downstream-analyses. Tijdens ultrafiltratie moet ervoor worden gezorgd dat het filtermembraan intact en nat blijft. Schade aan het filter kan ervoor zorgen dat het gewenste materiaal doorstroomt. Het opnemen van het oorspronkelijke GVB, 100R en 100F over downstream kwaliteitsevaluaties zal helpen bij de evaluatie van ultrafiltratie-integriteit.
Een goede installatie en het wassen van de SEC-kolom zijn noodzakelijk voor de hoogste kwaliteit EV-voorbereiding. Volg altijd de gebruikershandleidingen voor het instellen en verwijderen. Terwijl fracties worden verzameld, moet u ervoor zorgen dat de AFC niet wordt gestoten of verplaatst, omdat dit het proces kan onderbreken en kan leiden tot overgeslagen of inconsistente fracties. De antilichamen die voor de kwalificatie worden gebruikt, zijn afhankelijk van de downstream-toepassing van de verrijkte blaasjes en moeten een marker bevatten die naar verwachting in Mtb EV's (LpqH) zit en een marker die in CFP wordt aangetroffen, maar niet in Mtb EV's (GroES). Een beperking van de hier gepresenteerde methoden is potentiële variatie in geschikte eiwitcontroles. Dit protocol is ontwikkeld met behulp van standaard kweekmethoden. Werk uitgevoerd met Mycobacterium avium suggereerde dat niveaus van chaperonines zoals GroES veranderen in CFP en EV's op basis van het medium dat wordt gebruikt voor groei21. Naarmate er meer informatie naar voren komt over de samenstelling van mycobacteriële EV' s, kan het aanpassen van de specifieke negatieve controlemarker nodig zijn.
Ten slotte moeten alle kwantificerings- en kwalificatieprocedures en downstreamaanvragen snel worden uitgevoerd. Als materiaalopslag vereist is, wordt 4 °C boven het invriezen aanbevolen om verstoring van de integriteit van blaasjes tijdens het vries-dooiproces te voorkomen. Als het invriezen wordt uitgevoerd, aliquot het materiaal om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen. Verrijkte EV's moeten zowel kwantitatief als kwalitatief opnieuw worden geëvalueerd als er een aanzienlijke hoeveelheid tijd verstrijkt tussen de eerste evaluatie en het gebruik.
Deze methode verrijkt mtb EV's effectief en er is flexibiliteit voor aanpassing aan andere mycobacteriën. Wanneer u deze procedure aanpast voor andere organismen, moet u ervoor zorgen dat de startcultuur een beperkte cellulaire lysis heeft. De hoeveelheid materiaal die op de kolom wordt geladen, moet worden aangepast, omdat de kinetiek van ev-release zal variëren. Overschrijd een maximale eiwitconcentratie van 7 g per 100 ml niet op basis van de specificaties van de fabrikant. Het is ook noodzakelijk om elke fractie afzonderlijk te evalueren op de aanwezigheid van EV-geassocieerde markers en contaminanten. Eiwitconcentratie- en NTA-gegevens kunnen misleidend zijn bij methodeoptimalisatie: een zeer lage eiwitconcentratie betekent niet de afwezigheid van blaasjes in die fracties. Bovendien kan de gebruiker met het wijzigen van SEC-kolommen en parameters voor het verzamelen van breuken het protocol schalen op basis van invoer- en downstreamtoepassingen. Beperkingen van deze methode zijn onder meer de kosten van de AFC en verbruiksartikelen, de verdunde output en, zoals eerder vermeld, de ontwikkeling en optimalisatie van het factiepoolingschema. Hoewel ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt zijn voordelen heeft en misschien meer van toepassing is op bepaalde experimenten, is de verrijking van Mtb EV's door SEC vergelijkbaar in kwaliteit en superieur in toegang en gebruiksgemak, zoals hier gepresenteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen graag de steun erkennen van het College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award en College Research Council Shared Research Program aan NKG en financiering door ATCC (award # 2016-0550-0002) aan KMD. We willen ook Anne Simpson bedanken voor technische ondersteuning en BEI Resources, NIAID, NIH voor de volgende reagentia: Monoklonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (geproduceerd in vitro), NR-13792, Monoklonale Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gen Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (geproduceerd in vitro), NR-49223, en Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (geproduceerd in vitro), NR-13811.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization.
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
- Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Wallace, E., et al.
- Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
- Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
- Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
- Dobos, K. Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols. , Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022).
- Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
- Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
- Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
- Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).
