Summary
Ce protocole montre étape par étape les détails de la façon d’extraire la première molaire mandibulaire chez la souris. Il fournit une méthode alternative pour les chercheurs qui se concentrent sur la guérison et la régénération des os de la mâchoire.
Abstract
Cette étude introduit le développement d’un modèle d’extraction molaire dans la mandibule murine afin de fournir un modèle pratique pour étudier la régénération osseuse alvéolaire et l’ossification intramembraneuse. Des souris C57/J6 ont été utilisées pour extraire la première molaire mandibulaire afin d’établir ce modèle. Ils ont été euthanasiés et les mandibules bilatérales récoltées, respectivement 1 semaine et 4 semaines après la chirurgie. Une récolte stéréoscopique en série, une évaluation histologique et une coloration par immunofluorescence ultérieures ont été effectuées pour démontrer la réussite de la chirurgie. Immédiatement après la chirurgie, les images stéréoscopiques affichaient une douille d’extraction vide. L’hématoxyline et l’éosine (H & E) à 1 semaine et la coloration de Masson à 4 semaines après la chirurgie ont montré que la zone de la racine d’origine était partiellement et entièrement remplie de trabécules osseuses, respectivement. La coloration par immunofluorescence a montré que, par rapport à l’homéostasie, l’expression de Sp7 augmentait 1 semaine après la chirurgie, suggérant une ostéogenèse vigoureuse de la fosse alvéolaire. Tous ces résultats ont démontré un modèle pratique de guérison par extraction dentaire murale. Des études à venir révélant les mécanismes de cicatrisation des défauts de la mâchoire ou de la cicatrisation des alvéoles pourraient adopter cette méthode.
Introduction
La cicatrisation des alvéoles après extraction dentaire est un scénario clinique courant, qui peut entraîner des complications inconvenantes telles qu’une hémorragie des alvéoles, une cavité sèche ou même une ostéomyélite de la mâchoire sous cicatrisation indésirable 1,2,3. Ces comorbidités peuvent nuire à la qualité de vie des patients et, pire encore, remettre en question de manière vitale la rééducation prothétique en raison d’une perte osseuse massive4. Bien que les étapes de cicatrisation des alvéoles aient été élucidées, elles sont insuffisantes pour diriger les soins cliniques après la chirurgie d’extraction dentaire lorsqu’ils rencontrent divers défis de pronostic4.
De multiples études basées sur des modèles animaux ont été menées pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents du processus de guérison des alvéoles et éviter les situations ci-dessus. Sp7 est un régulateur principal dans la différenciation des ostéoblastes, jouant un rôle essentiel dans le développement du squelette, l’hémostase osseuse et la régénération osseuse 5,6. Les modèles rationnels de guérison des alvéoles pourraient afficher la redondance de Sp7 post-traumatique dans la régénération osseuse. De plus, distinct de la cicatrisation des fractures osseuses longues, un seul processus ostéogénique, l’ossification intramembraneuse, implique le processus de cicatrisation de la cavitéd’extraction 7. Cela rend le modèle d’extraction dentaire animale optimal pour étudier les thérapies implantaires, car l’ostéointégration implantaire obéit à la même règle ostéogénique8.
Pendant des décennies, le modèle d’extraction dentaire a été pratiqué chez les rats, les lapins etles chiens, car ces espèces ont de grandes dents qui sont pratiques à opérer sur 9,10,11. Cependant, compte tenu de la demande florissante de modification génétique et en tant que contexte génétique plus adaptatif aux humains, les souris sont de plus en plus utilisées pour établir un modèle d’extraction dentaire. Dès lors, les chercheurs pourraient démêler le rôle d’une population cellulaire spécifique dans le processus de guérison de l’alvéole en utilisant des souris modifiées par le génome au lieu d’observer les phénotypes seulement12. Parmi les modèles d’alvéoles d’extraction dentaire murine, les études précédentes ont démontré l’établissement et le processus de guérison des douilles d’extraction des dents maxillaires murines et des incisives13,14,15,16. Cependant, le schéma de guérison du pronostic et les points temporels détectives et observatifs peuvent différer d’un protocole à l’autre. Cela fait appel à un critère universel pour les chercheurs d’établir un modèle de guérison de l’alvéole murine.
Cette étude visait à constituer un modèle pratique de guérison des alvéoles murines pour les problèmes ci-dessus. Les molaires de la mandibule chez la souris ont des traits morphologiques distinctifs par rapport aux molaires maxillaires et aux incisives, apportant des avantages et des inconvénients uniques. Comme les modèles axés sur la mandibule murine sont actuellement basés sur le vide, ce protocole a tenté de fournir une méthode accomplie pour extraire la première molaire mandibulaire chez la souris. Nous espérons que ce protocole éclairera les chercheurs fondamentaux avec de nouvelles idées pour découvrir les mécanismes sous-jacents de la guérison des alvéoles et indiquer les soins cliniques.
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Protocol
Toutes les procédures animales de cette étude ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique de l’École de stomatologie de Chine occidentale de l’Université du Sichuan (WCHSIRB-D-2017-041). Des souris adultes C57BL/6, obtenues d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux), ont été utilisées pour la présente étude.
1. Préparation préchirurgicale
- Préparation des instruments
- Préparer diverses aiguilles de seringues jetables (26G, 25G, 23G; voir le tableau des matières) à utiliser comme ascenseurs. Infléchir la tête de l’aiguille d’environ 20°-40°, comme illustré à la figure 1.
- Préparez des pinces ophtalmiques dentées comme forceps. Assurez-vous qu’il correspond à la taille des molaires des souris et qu’il peut saisir les molaires fermement. La taille idéale de la pince à épiler est illustrée à la figure 1A, B3.
- Procurez-vous un élastique (qui peut être arraché d’un gant médical en latex) à utiliser comme ouvre-bouche, un panneau de mousse ou un tableau de liège comme plate-forme chirurgicale, une lampe frontale pour éclairer la zone chirurgicale et un coussin chauffant pour la reprise postopératoire. Déchirez une boule de coton sèche en petits morceaux et appliquez-la sur le site chirurgical si un saignement se produit pendant la procédure.
- Préparation de l’anesthésie
- La souris peut être anesthésiée par n’importe quel protocole anesthésique approprié qui permet d’obtenir une anesthésie générale confirmée par la méthode du « pincement des orteils ». Après l’anesthésie, appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux de la souris.
REMARQUE : Le protocole anesthésique général préféré pourrait être : induction et entretien avec de la xylazine (10 mg/kg) et de la kétamine (100 mg/kg) par voie intrapéritonéale (IP);
Pour cette étude, l’isoflurane et le pentobarbital sodique à 1 % (50 mg/kg, IP) ont été utilisés pour l’induction et l’entretien de l’anesthésie avec des doses supplémentaires au besoin.
- La souris peut être anesthésiée par n’importe quel protocole anesthésique approprié qui permet d’obtenir une anesthésie générale confirmée par la méthode du « pincement des orteils ». Après l’anesthésie, appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux de la souris.
- Préparation de désinfection et de stérilisation
- Désinfectez la plate-forme d’opération et les frais généraux à l’air libre avec un pulvérisateur d’éthanol à 75%. Avant chaque intervention chez la souris, l’utilisation d’un nouvel ensemble d’aiguilles jetables est recommandée.
REMARQUE: Les pinces à épiler dentées sont réutilisables et peuvent être stérilisées en utilisant n’importe quelle méthode préférée telle que la stérilisation à la vapeur.
- Désinfectez la plate-forme d’opération et les frais généraux à l’air libre avec un pulvérisateur d’éthanol à 75%. Avant chaque intervention chez la souris, l’utilisation d’un nouvel ensemble d’aiguilles jetables est recommandée.
2. Processus chirurgical
- Fixation de la souris et de sa mandibule
- Attachez la souris à une plate-forme chirurgicale en décubitus dorsal à l’aide de ruban adhésif. Épinglez deux aiguilles de 26 G alignées avec le plan orbital de l’oreille et deux autres aiguilles de 26 G à l’aise sous la mandibule.
- Appliquez l’élastique autour des aiguilles et croisez les incisives pour maintenir la bouche ouverte. Retirez légèrement la languette et fixez-la sous l’élastique opposé au côté chirurgical, pour éviter qu’elle n’obstrue le champ de vision (figure 1C).
- Éliminer la résistance distale
- Tenez la molaire avec une pince à épiler mésialement, enfoncez une aiguille de 23 G dans l’os alvéolaire buccal de la racine distale et faites un intervalle.
REMARQUE: Cette étape doit être prise avec une grande prudence, car une aiguille trop profonde enclenchera probablement la racine. - Ensuite, passez à une aiguille de 25 G pour continuer à élargir l’intervalle et progressez délicatement vers la zone périapicale tout en tournant lentement l’aiguille vers l’avant et lingualement (avec la position anatomique de la souris) pour presser la racine hors de la fosse alvéolaire.
- Tenez la molaire avec une pince à épiler mésialement, enfoncez une aiguille de 23 G dans l’os alvéolaire buccal de la racine distale et faites un intervalle.
- Élimination de la résistance mésiale
- Lorsqu’il y a suffisamment d’espace, utilisez une aiguille de 23 G à insérer dans la fourche radiculaire et soulevez la molaire occlusalement. Après avoir tenu fermement la molaire, prenez une autre aiguille de 23 G et forcez-la dans la membrane parodontale mésiale linguale pour créer un intervalle.
- Ensuite, remplacez par une aiguille de 25 G et tournez lentement vers l’avant et buccally. Si certains obstacles sous-jacents entravent la luxation de la molaire, utilisez une aiguille de 26 G pour pénétrer dans l’apex de la racine et répétez les opérations.
- Extraction finale
- Extrayez la dent et, pendant l’extraction, assurez-vous que la couronne s’élève au-dessus du plan occlusal et que deux racines intactes sont clairement visibles.
REMARQUE: La luxation (luxation) de la dent est considérée comme le moment le plus douloureux et le plus pénible de la procédure. Avant de disloquer la dent, la profondeur anesthésique doit être réévaluée à l’aide du test de pincement des orteils et, par conséquent, une dose modérée d’un agent anesthésique doit être administrée si nécessaire.
- Extrayez la dent et, pendant l’extraction, assurez-vous que la couronne s’élève au-dessus du plan occlusal et que deux racines intactes sont clairement visibles.
- Soins postopératoires
- Après avoir extrait la dent, appliquez du coton sec pour arrêter le saignement, repositionnez la langue, administrez du carprofène (5 mg / kg) par voie sous-cutanée et placez la souris sur un coussin chauffant à température constante jusqu’à la récupération de l’anesthésie.
3. Imagerie de la mandibule de la souris et de la cavité d’extraction
- Préparation des échantillons
- Euthanasier la souris par luxation cervicale. Utilisez des ciseaux ophtalmiques pour couper les muscles squelettiques attachés à la mandibule et à l’arc zygomatique. Couper de la gorge le long du bord inférieur de la mandibule jusqu’à la branche ascendante, puis à l’arrière du condyle, puis tirer la mandibule vers le bas et couper le long de la ligne médiane de l’incisive inférieure. De cette façon, les deux mandibules séparées sont récoltées.
- Effectuer la fixation, la déminéralisation et la déshydratation en suivant la procédure standard17. Lors de l’incorporation17, assurez-vous que le plan occlusal est parallèle au bord de la cassette (voir le tableau des matériaux). Fixez la mandibule sur le fond de la cassette, avec son bord inférieur armé (Figure 2).
REMARQUE: Ce protocole offre le plan sagittal de la zone de la mandibule.
- Fixation de l’échantillon sur le microtome
- Réguler la pince de l’échantillon dans le microtome pour faire saillie du condyle et du côté de la couronne de 5°-20° de plus, afin d’obtenir une image intégrée de la pulpe du collet concomitante à la pulpe racinaire (Figure 2).
- Préparation des sections
NOTE: Le condyle est toujours la première structure anatomique à être coupée. Lorsqu’elle disparaît, la zone molaire peut alors être coupée en plusieurs tranches.- Déplacez la plage de microtomes à 5 μm, collectez toutes les huit tranches et recherchez la dentine dans la dernière tranche. Si la dentine couronne apparaît pour la première fois sans dentine apicale radiculaire, ajustez la pince de l’échantillon pour faire saillir la zone racinaire, et vice versa.
- Collecte des sections
NOTE: L’angle de coupe est approprié jusqu’à ce que la dentine soit également atteinte dans la couronne et la zone apicale.- Coupez dans cette direction et observez les tranches au microscope jusqu’à ce que la pulpe dentaire apparaisse à la fois dans la couronne et les racines. Prélever les coupes lorsqu’un contour obscur de molaires apparaît à la surface de l’échantillon de paraffine17.
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Representative Results
Pour élucider l’utilisation pratique de cette méthode, la première molaire mandibulaire droite de deux souris C57BL/6 saines (âgées de 3 mois, toutes deux femelles) a été extraite et suivie pendant 1 semaine et 4 semaines, respectivement. Les mandibules gauches intactes ont été utilisées comme témoins sains. La figure 1A montre les caractéristiques spécifiques de l’appareil chirurgical, y compris des aiguilles de 26-23 G et une pince à épiler ophtalmique dentée. L’aiguille de 26 G est enlevée et pliée de manière précise. L’aiguille de 25 G est pliée à environ 25° au point d’épingle. Les aiguilles de 23 G sont le pivot de la chirurgie et sont pliées à environ 25° et 35°, respectivement, au point précis (Figure 1B1,B2). La pince à épiler a une dent de 1 mm de long qui épouse la forme des molaires murines (figure 1B3). La figure 1C montre l’état de la souris avant la chirurgie. Les points clés sont l’emplacement des quatre broches autour de la tête et la fixation de la languette sous l’élastique à gauche.
La figure 3A montre la position et la morphologie de la première molaire mandibulaire droite. La figure 3B indique l’alvéole dentaire immédiatement remplie de caillot après l’extraction. À 1 semaine et 2 semaines, les souris ont été euthanasiées et les mandibules ont été déminéralisées, incorporées dans de la paraffine17 et sectionnées en tranches. La figure 4A montre le processus de cicatrisation de la cavité à 1 semaine. Des os trabéculaires ressemblant à des éponges se sont formés, mais le caillot est resté. Dans le processus de guérison à 2 semaines (Figure 4B), l’alvéole était entièrement remplie d’os d’éponge, ce qui signifie que la régénération était à peu près terminée. La coloration par immunofluorescence (IF) a également corroboré les résultats de la coloration histopathologique. Dans la figure 5, le Sp7 a été largement exprimé dans les cellules de la moelle osseuse, en particulier dans la marge, qui est le front formant l’os. Sous l’état d’homéostasie, les os trabéculaires étaient cohérents et confluents, avec des blocs cellulaires de moelle osseuse saupoudrés comme des îles. Cependant, 1 semaine après la chirurgie, de nombreuses cellules exprimant Sp7 ont rempli la cavité d’extraction, avec de l’os trabéculaire nouvellement formé saupoudré autour. 4 semaines après la chirurgie, la condition s’est inversée et s’est transformée en os trabéculaire largement fusionné, et l’activité des cellules exprimant Sp7 a diminué à un niveau proche de l’homéostasie.
Figure 1 : Images d’objets d’appareils chirurgicaux et de souris préparées à la chirurgie. (A) Les appareils chirurgicaux se composaient principalement d’aiguilles de 26, 25 et 23 G et d’une pince à épiler dentée. (B) Les aiguilles ont été pliées à l’extrémité à 20°-40° (B1,2). La pince à épiler doit mesurer environ 1 mm (B3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : L’organigramme de la procédure de l’extraction dentaire à la section. Cette image montre un flux schématique de l’extraction des dents à la section. La première molaire mandibulaire droite a été extraite selon le protocole, puis la souris a été euthanasiée et la mandibule a été récoltée. Lors de la récolte, la mandibule a été trempée dans 4% POM pendant 24 h, puis trempée à nouveau dans 10% EDTA; Le fluide a été renouvelé tous les jours pendant 14 jours. Ensuite, les échantillons ont été déshydratés et incorporés dans de la paraffine selon un protocole universel. Le côté buccal ou lingual doit être face vers le bas, car les tranches planes sagittales sont censées être sectionnées. Enfin, lors de la fixation de l’échantillon sur la pince de l’échantillon, les côtés du condyle et de la couronne doivent faire saillie de 5° à 20°. Abréviations : POM = paraformaldéhyde; EDTA = acide éthylènediamine tétra-acétique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images stéréoscopiques de la première molaire mandibulaire de la souris et de la cavité d’extraction. (A) Image stéréoscopique de la première molaire mandibulaire droite, indiquée par la flèche jaune. (B) La cavité d’extraction de la première molaire mandibulaire droite post-opératoire, indiquée par la flèche jaune. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Coloration H&E. Coloration H&E de l’alvéole d’extraction à (A) 1 semaine et (B) 4 semaines après la chirurgie. Les flèches jaunes indiquent la deuxième molaire mandibulaire à proximité de la première alvéole d’extraction molaire cicatrisant. La ligne rectangulaire pointillée indique la première zone d’alvéole d’extraction molaire cicatrisante. Barres d’échelle: 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Détection de Sp7 par coloration IF. Cette image montre la distribution de l’expression de Sp7 dans les cellules de moelle osseuse de la mandibule de souris et l’os trabéculaire environnant sous un état d’homéostasie (contrôle sain), 1 semaine et 4 semaines après la chirurgie, respectivement. La ligne pointillée blanche contournait l’échelle estimée de l’os trabéculaire. Les flèches jaunes indiquaient les cellules exprimant Sp7 typiques. Barres d’échelle: 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le modèle de guérison de l’alvéole murine est une méthode importante pour démêler les mécanismes sous-jacents de la guérison et de la régénération osseuses, résolvant finalement les défis cliniques. Les études existantes ont démontré la possibilité du modèle d’extraction incisive et du modèle d’extraction molaire maxillaire, alors que les études n’ont pas utilisé le modèle de première molaire mandibulaire13,17,18. Cependant, les incisives sont cruciales pour la vie des rongeurs et leur altération peut être fatale. De plus, comme l’os du maxillaire est plus spongieux que la mandibule, il peut y avoir une certaine dissemblance dans les mécanismes sous-jacents au cours du processus de guérison. Par conséquent, il est nécessaire d’établir un modèle d’extraction de première molaire mandibulaire réalisable.
La considération la plus importante dans l’extraction dentaire est d’éviter les cassures de racines19. Les molaires murines sont petites et vulnérables, et les racines résiduelles de la mandibule ne peuvent pas être extraites. Dans ce protocole, cependant, le risque de rupture des racines existe tout au long de la chirurgie. Ainsi, il est essentiel de tenir la molaire fermement et de contrôler rigoureusement la force. Pour être précis, lors de l’élimination de la résistance distale, il faut faire attention à ne pas frotter la couronne; lors de l’élimination de la résistance mésiale, il faut être prudent afin que l’aiguille ne jaillisse pas de la fourche radiculaire; Lors de l’utilisation d’aiguilles pour rendre les intervalles, il est important de se rappeler que les intervalles sont supposés entre la racine et le processus alvéolaire, il ne faut donc pas appliquer beaucoup de force de rotation, car cela peut entraîner un risque élevé de rupture de la racine.
L’extraction de la première molaire mandibulaire murine est ardue et nécessite une formation suffisante pour la maîtriser. Pendant l’opération, des urgences, y compris, mais sans s’y limiter, les suivantes peuvent survenir: (1) les instruments d’extraction dentaire ont tendance à glisser et à poignarder les tissus mous en raison de la mobilité de la mandibule et de la langue, ce qui peut provoquer des saignements légers à graves. Dans ce cas, on peut déposer une boule de coton propre et sèche dans la bouche, libérer l’élastique et la laisser se fermer spontanément pendant un moment. La compression pour arrêter le saignement n’est pas suggérée, car cela peut provoquer des lacérations et des saignements plus larges. (2) Les opérateurs sont souvent confrontés à un choix binaire sur la réservation de la plaque osseuse alvéolaire ou de la racine molaire, car les premières molaires sont étroitement jointes à la mandibule. Pour atténuer cette force de liaison, l’opérateur pourrait casser la plaque osseuse linguale ou buccale; Sinon, une force de rotation féroce dans la cavité entraîne la rupture de la ou des racines. Le choix de préserver la plaque osseuse dépend de l’objectif de la recherche. (3) L’extraction de la première molaire mandibulaire peut être plus traumatisante que la première molaire maxillaire ou l’incisive. Nous vous suggérons de regarder attentivement jusqu’à ce que la souris se réveille après la chirurgie. (4) La racine mésiale de la deuxième molaire mandibulaire est vulnérable en raison de la salle d’opération limitée dans la région buccale; Parfois, même la couronne de la deuxième molaire peut être détruite. Parce que l’absence de la deuxième molaire n’affecte pas l’observation de la première cicatrisation de la douille d’extraction molaire, cet accident peut être ignoré. (5) Surveillez de près la profondeur de l’anesthésie de la souris pendant l’extraction dentaire, car il s’agit d’une procédure douloureuse pour les humains et les rongeurs. Administrer les agents anesthésiques au besoin pour maintenir un plan chirurgical d’anesthésie jusqu’à ce que l’extraction soit terminée. En outre, une pression prolongée de l’élastique peut provoquer une privation d’oxygène dans la langue, caractérisée par des membranes pâles. Les opérations doivent être arrêtées immédiatement dans de tels cas, avec les instruments retirés, permettant à la souris de récupérer.
Pris ensemble, les opérateurs non qualifiés peuvent infliger par inadvertance des blessures involontaires aux souris, comme indiqué au point 1. Afin d’assurer la sécurité et le bien-être de tous les animaux de laboratoire, il est fortement recommandé de pratiquer largement les cadavres murins avant de maîtriser cette compétence et d’effectuer des procédures vivantes sur des souris réelles.
Bien que ce protocole fournisse une méthode alternative pour les chercheurs qui se concentrent sur la guérison et la régénération des os de la mâchoire, il présente plusieurs inconvénients. (1) La mandibule ne peut pas être fixe et a une grande souplesse. En conséquence, les ascenseurs sont difficiles à maintenir un point à action stable sur l’os alvéolaire, ce qui provoque certaines urgences. (2) Les souris mâles adultes ont des os de la mandibule intensifiés, de sorte que l’élimination de la résistance mésiale peut être difficile. (3) Le présent protocole ne s’applique pas à l’extraction de la première molaire mandibulaire gauche.
En conclusion, bien que ce protocole ait démontré les détails de l’extraction de la première molaire mandibulaire murine, les opérateurs ont encore besoin de beaucoup de pratique et de prudence pour effectuer une chirurgie réussie.
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Disclosures
Toutes les données et images originales sont incluses dans ce document. Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine 81825005 (L.Y.), 82201045 (F.Y.) et 82100982 (F.L.), et par le Programme scientifique et technologique de la province du Sichuan 2021JDRC0144 (F.L.), 2022JDRC0130 (F.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23/25/26 G needle | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB1-074(IV) | |
| C57/B6J | Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China | C57/B6J | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | Cat#C1005 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST Scientific | 80106-1100-16 | |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | Biosharp | BL700B | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22-10 | |
| Masson’s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Microtome | Leica | RM2235 | |
| Pentobarbital Sodium | Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd | 2018042001 | |
| Rabbit polyclonal | anti-Sp7 | Abcam Cat# ab22552 | |
| Tweezers | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB2-115 |
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