Qdot 标记蛋白与现场特异修饰的λ DNA 在单分子水平上的相互作用可视化
2018年7月17日
在这里, 我们提出了一个协议, 研究 DNA 蛋白相互作用的全内反射荧光显微镜 (TIRFM) 使用一个网站专门修改的λ DNA 基底和量子点标记蛋白。
该方法可以帮助回答 DNA 蛋白质相互作用的单分子成像领域的关键问题，例如 DNA 复制、基因修复和染色体结构的维持。这种技术的主要优点是可以获得修饰的 lambda DNA 高胶原蛋白，然后快速固化标记的蛋白质。这种方法的可视化演示至关重要，因为流通池组装步骤很难学习。
要清洁盖玻片，将 20 个盖玻片放入四个染色罐中，倒入乙醇，并在乙醇中超声处理 30 分钟。然后用超纯水冲洗盖玻片 3 次。接下来，用 1 摩尔氢氧化钾对盖玻片超声处理 30 分钟，然后用超纯水冲洗盖玻片 3 次。
然后重复乙醇和氢氧化钾超声处理一次。用丙酮对盖玻片进行超声处理 30 分钟，然后用超纯水彻底冲洗。现在将盖玻片放入食人鱼溶液中，并在 95 摄氏度下孵育 1 小时。
孵育后，用超纯水冲洗盖玻片五次。然后用超纯水充分清洗每个盖玻片。用纸从其边缘擦干盖玻片，然后将盖玻片放入染色罐中。
在 110 摄氏度的烤箱中彻底干燥盖玻片。现在用甲醇冲洗盖玻片，然后将染色罐放回 110 摄氏度的烘箱中以干燥盖玻片。为了进行盖玻片功能化，向每个罐子中加入 70 毫升硅烷溶液，拧上盖子并将罐子在室温下放置过夜。
使用三个装满超纯水的烧杯清洗盖玻片。使用氮气彻底干燥盖玻片。将 150 毫克甲氧基-PEG 和 6 毫克生物素-PEG 溶解到 1 毫升新鲜制备的 0.1 摩尔碳酸氢钠中。
以 17， 000 倍 g 离心 1 分钟，以去除不溶性 PEG。现在将 100 微升 PEG 溶液移液到硅烷化盖玻片的中心，并将另一个硅烷化盖玻片放在顶部。将盖玻片与 PEG 溶液在黑暗中孵育至少三个小时。
分离盖玻片对并保持功能化表面朝上。使用超纯水充分冲洗盖玻片，并用氮气干燥。现在用记号笔在其中一个角上标记盖玻片的功能化面。
将一个盖玻片放入 50 毫升管中，管盖上钻有一个孔。将试管放入塑料袋中，使用真空封口机密封袋子，并在零下 20 摄氏度下储存。要组装流通池，请使用打孔器在一张双面胶带的中心切出一个通道。
撕下双面胶带的纸张面，将其粘贴到带有两个孔的玻璃面上。与双面胶带的塑料面相比，剥下纸面更容易去除气泡。按压胶带以去除气泡。
然后使用金刚石尖头玻璃划线器将功能化的盖玻片切成四块，并使用氮气去除碎屑，保持功能化的一面朝上。撕下双面胶带的塑料面，将载玻片粘贴在功能化的盖玻片上。轻轻按压以去除盖玻片和胶带之间的气泡。
彻底去除气泡可以保护流通池在泵入缓冲液时不会泄漏。现在将入口管插入小孔中，然后将出口管插入大孔中。使用环氧树脂固定管路。
使用注射器将 20 μL 0.2 mL/mL 链霉亲和素手动泵入流通池中，并在室温下孵育 10 分钟。然后将封闭缓冲液泵入流通池中以替换链霉亲和素并将其保持在室温下。通过使用 532 纳米激光器和 640 纳米激光器同时激发，在荧光显微镜测试载玻片 1 上获得红色和远红与 A5 的焦点对准。
使用分光光学元件生成双波长图像。将流通池放在显微镜上，并将其出口管连接到较长的管路上，该管路连接到安装在自动输液抽取可编程泵上的 10 毫升弹簧。通过注入封闭缓冲液并翻转出口管路来去除流通池中的气泡。
将 0.5 μL 生物素化的 lambda-ARS317 DNA 添加到 80 μL 封闭缓冲液中。以每分钟 25 μL 的速度将制备好的混合物泵入流通池，持续 2 分钟。然后使用 200 μL 封闭缓冲液以每分钟 50 μL 的速率冲洗 lambda-ARS317 DNA。
现在以每分钟 50 μL 的速率泵送 200 μL 结合缓冲液，以去除流通池中的封闭缓冲液。接下来，将 2 μL ORC-Qdot705、1 μL DTT 和 1 μL ATP 加入 96 μL 结合缓冲液中。ORC-Qdot705 的最终浓度为 0.2 纳摩尔。
按照文本方案中详细说明泵送结合缓冲液后，以每分钟 10 微升的速率将 20 微升制备的 ORC-Qdot705 溶液泵入流通池。使用 200 μL 结合缓冲液以每分钟 100 μL 的速率冲洗过量的 ORC-Qdot705。然后将含有 30 纳摩尔 SYTOX Orange 的结合缓冲液泵入流动槽中，以每分钟 100 μL 的速率对 DNA 底物进行染色。
最后，使用 405 纳米激光激发 ORC-Qdot705 信号，并使用 532 纳米激光激发 SYTOX Orange 染色的 DNA 信号。使用四频带通滤波器以每分钟 100 微升的流量同时观察信号。通过 EMCCD 以每帧 100 毫秒的速度录制图像。
此处显示了 lambda-ARS317 DNA 底物的图示。Qdot705 标记的 ORC 被 405 纳米激光激发。SYTOX Orange 染色的 DNA 由 532 纳米激光激发。
合并结果表明 Qdot705 标记的 ORC 在 ARS317 位点结合。ORC 结合分布在 lambda-ARS317 DNA 上的结果表明，ORC 在 ARS317 位点以高丰度结合。按照此程序，可以执行其他方法，如单分子 FRET来回答有关蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质动力学的其他问题。
开发后，这项技术为单分子荧光成像领域的研究人员探索体外 DNA 复制和 DNA 修复重组系统中的 DNA 蛋白质相互作用铺平了道路。不要忘记，使用 Piranha 溶液可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴防护面罩。
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概述
本文介绍了一种使用全内反射荧光显微镜（TIRFM）研究DNA-蛋白相互作用的协议。该方法利用了特定位点修饰的λ DNA底物和量子点标记的蛋白质，以便于单分子成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 分子生物学
背景
- 理解DNA-蛋白相互作用对于洞察DNA复制和基因修复至关重要。
- 单分子成像技术提供了有关分子动力学的详细信息。
- 该协议旨在简化TIRFM流动池的组装。
- 视觉演示增强了方法的学习和应用。
研究目的
- 开发一个可靠的研究DNA-蛋白相互作用的协议。
- 提高对染色体结构维护分子机制的理解。
- 促进单分子成像技术的研究。
使用的方法
- 修饰λ DNA底物的制备。
- 用量子点标记蛋白质。
- TIRFM成像的流动池组装。
- 清洁和准备盖玻片以获得最佳成像条件。
主要结果
- 该协议允许有效地可视化DNA-蛋白相互作用。
- 展示了标记蛋白与DNA相互作用的成功成像。
- 提供了克服流动池组装常见挑战的步骤指南。
- 强调了盖玻片清洁程序的重要性。
结论
- 该方法增强了对DNA-蛋白相互作用的研究。
- 它是分子生物学研究人员的有价值工具。
- 未来应用可能扩展到遗传学研究的各个方面。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single-molecule visualization of DNA-protein interactions using Qdot-labeled proteins and site-specifically modified λ DNA enables direct interrogation of molecular mechanisms underlying replication and repair. This approach enhances predictive confidence in target validation by providing high-resolution, quantitative insights into binding events and spatial localization. The method supports early discovery inflection points where mechanistic de-risking and functional validation are critical for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein-DNA binding specificity and localization at the single-molecule level.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying functional engagement of candidate targets.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of replication and repair pathways relevant to disease models.
- Provides foundational data for triaging targets based on real-time molecular interactions.
Screening & Assay Development
- Establishes validated single-molecule imaging systems for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, high-stability fluorescent labeling with Qdots for extended observation windows.
- Enables quantitative measurement of binding events, supporting assay standardization and scalability.
- Prepares robust platforms for evaluating compound effects on DNA-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mechanistic findings with disease-relevant DNA replication and repair processes.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling detailed molecular characterization.
- Reduces translational risk by providing direct evidence of target engagement and functional relevance.
Pipeline & Workflow Integration
This single-molecule imaging protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation, supporting both target validation and assay development phases.
- Discovery Biology: Provides high-resolution visualization for hypothesis testing and pathway clarification in DNA-protein interaction studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts suitable for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables statistical comparison of binding distributions and localization patterns across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to disease-relevant systems by modeling replication and repair events in vitro.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging platform adaptable to diverse protein-DNA interaction studies across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows with robust, photostable Qdot labeling and reproducible flow cell assembly.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing direct evidence of molecular interactions and target engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence microscopy and flow cell assembly.
- Demands access to TIRFM instrumentation and high-sensitivity EMCCD imaging systems.
- Necessitates rigorous cleaning and functionalization protocols for coverslips to ensure reproducibility.
- Adaptation to other protein-DNA systems may require optimization of labeling and buffer conditions.
- Qdot photostability limits application in quantitative assays requiring dynamic intensity measurements.
