工程细胞透水蛋白
2009年12月28日
蛋白转导使进入细胞的生物活性蛋白的直接传递。相反，如DNA转染或病毒转导的传统方法，这种非侵入性的范式允许在滴定的细胞毒性和永久性的基因改造的致癌转化的风险规避方式高效蜂窝操作。
在过去 15 年中，可以通过 DNA 转染或病毒转导的经典方法实现细胞功能的纵。另一种方法发展了起来。蛋白质转导生物活性蛋白可以使用与目标蛋白质融合的小肽直接递送到哺乳动物细胞中，从而促进细胞摄取。
由于不使用 DNA，因此可以防止劳累性发育不全的风险。与上述经典方法相反。蛋白质转导能够以可滴定的方式递送蛋白质。
此外，小细胞群以及非分裂细胞（如有丝分裂后神经元）都可以被调节。为了以有效的方式表达重组蛋白，我们建议使用 Paciz 载体系统。它是一个模块化的矢量系统，由一个终端和一个 C 终端变体组成。
两种载体都可以轻松插入您的目标基因以进行纯化。整合了一个组氨酸标签以及一个蛋白质转导结构域。在我们的例子中，来自 HI 病毒的触摸促进了细胞摄取以进行细胞分布。
核定位信号完成载体，出于控制原因，可以简单地去除融合标签。此外，这些标签的排列会对融合蛋白的性质产生重大影响。对产量和纯度以及适销性和生物功能的影响是不可预测的。
大家好，我叫 Bernard Mus，在德国邦德重建神经生物学研究所的干细胞工程小组工作。嗨，我叫 Christoph P，也是胡佛实验室的成员。我们的工作组深入利用蛋白质转导技术将生物活性蛋白直接递送到各种哺乳动物细胞中，今天我们想指导您完成在大肠杆菌中表达和纯化的过程。
此后，我们想向您展示如何在细胞培养中应用细胞永久融合蛋白，以举例说明整个过程的表达、纯化和应用。我们利用位点特异性重组 Cree 对小鼠 onic 干细胞进行基因修饰。好的。让我们开始吧。
为了接种过夜培养物，我们利用储存在零下 80 摄氏度的甘油原液中的已转化细菌。这些细菌已经包含编码递减重组的载体。使用吹蛬头，我们在吹蛤头上刮擦少量细菌，然后将其放入装有过夜培养物的烧杯中。
过夜培养物由补充有终浓度为 oh 0.5% 的葡萄糖的 LB 培养基和每毫升 50 微克碳酸胰岛素组成。然后将烧杯放入 37 摄氏度运行的培养箱中，以表达位点特异性重组 Cree。我们正在将战前结核病媒体用于我们的大规模表达文化。
为了加快表达速度，我们建议使用加热至 37 摄氏度的 TB 培养基，这代表重组蛋白表达过程中的温度。接下来，我们将葡萄糖以终浓度 oh 0.5% 的葡萄糖添加到 TB 培养基中，葡萄糖可防止在诱导前表达培养物生长期间融合蛋白的基础表达增加。最后，将氨苄青霉素以 100 μg/ml 的终浓度添加到表达培养物中，以确保纯培养物仅包含仍含有编码 Decree 蛋白质粒的细菌。
我们现在可以获得过夜培养物，并以 1 比 50 的比例接种表达培养物。然后将烧杯转移到 37 摄氏度温度下运行的培养箱中。您应该在整个表达式过程中定期采集样本以测量光密度。
一旦培养物达到 1.5 的光密度，就会用终浓度为 oh 0.5 毫摩尔的 IPTG 诱导细菌。诱导 1 小时后，将表达培养物转移到试管中，然后通过离心收获。为此，我们使用了 SLA 3000 转头。
离心机在顺坡 4 度下以每分钟 5， 000 轮的速度运行 10 分钟。然后丢弃 snat，细菌颗粒可以在零下 20 摄氏度下无限期储存。将冷冻沉淀重悬于 lizza 缓冲液中，该缓冲液对应于 1 升表达培养物。
我们使用 10 ml lizza 缓冲液等待大约 15 分钟，直到溶液变得均匀。然后每毫升悬浮液加入 1 毫克溶菌酶。将溶液混合 20 分钟，让酶打开细菌。
随后，将 Benson Nase 以 1 比 1000 的稀释度再添加 15 分钟，这将切割 DNA，得到非粘性溶液。最后，使用儿子器确保细胞裂解。完成认证后，该程序以 45% 的功率运行一分半钟。
请记住在此处采集每个步骤的样本，粗裂解物或纯化的 SDS 页面分析。现在，每 ML 悬浮液添加 1 ml 冰冷的 TSB 缓冲液非常重要，因为 Decree 蛋白往往会在甘油原液中沉淀。如果您要跳过此步骤，溶液很快就会混合，粗粮现在可以进行离心了。
为此，我们使用 SS 34 转子。离心机在 4 摄氏度下以 17， 000 RPM 的速度运行 30 分钟。完成后，Centrifuge Inc 小心地将 S 上清液转移到新鲜的 50 ml Falcon 管中。
现在将镍抗 A 浆液添加到上清液镍中。抗 A 抗体是正确纯化组氨酸 Tech 融合蛋白的关键试剂。组氨酸与镍离子形成复合物，可实现亲和纯化，现在在 40 摄氏度下轻轻摇动停车管 60 分钟。
1 小时后，您现在可以将悬浮液涂在 20 ML 色谱柱上，并让溶液通过重力流过。对于大规模生产，可以将悬浮液分成几根塔。然后，我们用含有 15 毫摩尔内底的缓冲液洗涤色谱柱两次。
使用的缓冲液量取决于树脂体积。2 MLS 镍 NTA 相当于 1 ml 用于洗涤的树脂。洗涤后，我们将 5 倍填料体积的洗涤缓冲液放到色谱柱上，现在已准备好去除蛋白质。
因此，我们使用浓度为 250 毫摩尔的 immuno 洗脱缓冲液。因此，请注意树脂的颜色是如何变为绿色的。由于 CRE 蛋白的高浓度，OID 部分有时会变得稀疏。
为防止这种情况，混合溶液并添加额外的 lys 缓冲液，所有组分现在被合并并随后转移到裂解管中。裂解将去除 ole 第一个透析器步骤是对含有高浓度盐的缓冲液进行的。1 小时后，更换高盐缓冲液，并进行过夜透析程序。
第二天，将透析管从高盐缓冲液中取出并转移到甘油缓冲液中。3 到 5 小时后，更换甘油缓冲液并再次进行过夜透析。针对甘油缓冲液的裂解将产生至少三倍浓度的储备液。
储备液现在可以在零下 20 摄氏度下储存数年而不会失去活性 为了保证质量，您可以将收集的 SDS 页面样品加载到凝胶上，然后对其进行染色。对于 Kamasi，Cree 融合蛋白在 OID 组分中可检测到一个突出条带。为了使用适当浓度的船员复合，您应该通过 Redford 测定法确定浓度。
如何将如此永久的蛋白质应用于哺乳动物细胞。首先，准备您的靶细胞以实现最高的蛋白质转导效率。如果您的靶细胞是以紧凑的菌落生长的 Yes 细胞，则在第二天看到导致 80% 至 90% 汇合细胞层的密度的单层细胞。
分离细胞和体细胞，并提前 5 小时在单个细胞悬液中观察它们。在蛋白质转导之前制备单细胞悬液很重要，因为否则只能输注菌落表面的空气细胞。在试穿治疗之前，吸取介质并用 PPS 短暂观察气室。
删除剩余的 Yes， gross media containing serum（是，含血清的毛体培养基）。吸出 PPS 后，滴下细胞，让它们孵育 3 到 5 分钟。现在用显微镜检查是否所有菌落都溶解成单个细胞。
刚才提到的原因，这是蛋白质转导到 Yes 细胞的关键步骤。将分离的细胞转移到试管中。将试管放入工作台中，离心并离心细胞，吸出超级试剂并重悬细胞。
生长培养基中的 P 将细胞稀释成适当的细胞数量。这当然取决于组织培养物的大小。培养皿将空气池再孵育 5 小时。
这将使气室有足够的时间附着在底部并粘附。三级行料可以在零下 20 度下存放两年以上。当使用重组细胞永久融合蛋白时，拥有这样一种可按需使用的储备液是非常有益的。
在等待细胞附着到培养皿上时，可以制备 C 转导培养基，只需将适当体积的细胞永久蠕变蛋白从胆固醇原液中稀释到自身中即可。媒体。由于 Clare 储备溶液尚未无菌，因此在应用前必须对反式培养基进行无菌过滤。我们建议使用可拧到波叶蛋白结合过滤器上的注射器。
最终的小溪浓度取决于细胞类型或培养基补充剂。例如，血清对转导效率有很强的负面影响。这可以通过使用无血清培养基或增加溪流浓度来克服。
我们找到了实现最高复合效率的最佳条件。水合物浓度从 oh 0.5 到 10 μmolar 开始。我们建议在 6 到 18 小时之间测试不同的孵育时间。
孵育 5 小时后，取出目标细胞并吸出交叉培养基。随后，我们用蛋白质转导培养基替换它，孵育过夜后将空气细胞放回培养箱中。用 PPS 短暂洗涤 D 细胞，并将蛋白质转导培养基更换为正常 ES 培养基。
细胞孵育后 48 小时，可通过 xUL 检测 Cree vent 基因表达。具有阳性 bega 表型的染色细胞已成功通过位点特异性重组进行基因工程改造。克里报告。
携带 CRE 的细胞在预先介导的重组时使用 Lae 构建体。切除锁 P 侧翼停止序列，并在团队启动子的驱动下激活 luxe 报告基因。为了评估预处理的报告气细胞中的复合效率，必须固定细胞。
吸出 s 培养基，用 PBS 洗涤细胞两次，用 4% PFA 覆盖细胞，并在室温下孵育细胞 10 分钟。此后，再次用 PBS 洗涤细胞 3 次。将 PBS 从 Xal 染色溶液的最后一个洗涤步骤吸出到孔中后，将细胞在 37 度的培养箱中孵育过夜。
第二天，蓝领细胞可以监测 Beal 活动。重组效率可以通过蓝色菌落的数量来确定。在最佳条件下，您应该能够实现高于 90% 的重组效率好了，今天我们已经向您展示了如何从大肠杆菌中表达和纯化位点特异性查询重组。
在这项原理验证研究中，我们能够在大多数盐中诱导复合。好了，就是这样。祝你的 Experiments.I. 好运。
概述
本文讨论了蛋白质转导作为一种将生物活性蛋白质直接输送至哺乳动物细胞的方法。与传统的DNA转染等方法不同，蛋白质转导是一种非侵入性方法，能够在不涉及永久性遗传修饰的风险的情况下进行高效的细胞操作。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 蛋白质工程
背景
- 传统的细胞操作方法包括DNA转染和病毒转导。
- 蛋白质转导利用小肽增强蛋白质的细胞摄取。
- 该方法对于非分裂细胞（如有丝分裂后的神经元）特别有用。
- 推荐使用Paciz载体系统进行高效的重组蛋白表达。
研究目的
- 展示在大肠杆菌中表达和纯化蛋白质的过程。
- 说明细胞永久融合蛋白在细胞培养中的应用。
- 探索用于干细胞遗传修饰的位点特异性重组的使用。
使用的方法
- 接种转化细菌的过夜培养物。
- 使用LB培养基和TB培养基进行蛋白质表达。
- 使用IPTG诱导蛋白质表达。
- 使用镍亲和层析纯化蛋白质。
主要结果
- 在大肠杆菌中成功表达重组蛋白。
- 高效纯化组氨酸标签融合蛋白。
- 在哺乳动物细胞中展示蛋白质转导。
- 对融合标签对蛋白质性质影响的见解。
结论
- 蛋白质转导是传统遗传修饰方法的可行替代方案。
- Paciz载体系统有助于高效的蛋白质表达和纯化。
- 需要进一步研究以优化融合蛋白性质以用于特定应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Protein transduction enables direct delivery of functional proteins into mammalian cells without genetic modification, offering a titratable and reversible approach for target validation in early discovery. This method supports mechanistic de-risking by allowing rapid interrogation of protein function in disease-relevant systems, including non-dividing cells such as neurons. It provides a scalable platform for assay development and phenotypic screening where genetic tools are limited or undesirable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of target proteins through direct delivery, supporting hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Provides a titratable system to modulate protein activity in a controlled, dose-dependent manner.
- Predictive Value: Reduces reliance on overexpression artifacts, improving confidence in target engagement and phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively measurable outputs such as recombination efficiency, enabling robust assay readouts for compound or modulator screening.
- Operational Value: Utilizes standardized purification via histidine tag and nickel affinity chromatography, ensuring reproducibility across batches.
- Scalability: Supports large-scale expression in E. coli using TB media and IPTG induction, facilitating consistent reagent supply for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Delivers active Cre recombinase to validate loxP-based reporter systems, enabling preclinical assessment of genetic modification efficiency.
- Disease-Relevant System: Effective in post-mitotic neurons and primary cells, supporting target validation in neurologically relevant models.
- Mechanistic De-risking: Allows temporal control of protein activity to distinguish on-target effects from compensatory mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a chemically inducible, non-genetic tool for target validation, bridging recombinant protein production with functional cellular assays in a scalable format.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven validation of protein function through direct delivery and intracellular activity measurement.
- Screening: Enables standardized, reproducible protein preparation for high-confidence screening of modulators or genetic backgrounds.
- Analytics: Generates quantitative functional readouts (e.g., recombination efficiency via blue-white screening) to compare conditions and guide decision-making.
- Translational Research: Connects in vitro recombination efficiency to preclinical genetic modification outcomes in stem cell models.
- Enterprise Reuse: The Paciz vector system and purification protocol establish a reusable platform for producing diverse cell-permeable proteins across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by avoiding genomic integration and enabling acute, reversible protein modulation.
- Operational Value: Delivers standardized, purified recombinant protein with consistent activity, reducing variability in functional assays.
- Strategic Value: Increases go/no-go decision accuracy by providing direct functional evidence of target engagement in complex cellular environments.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in disease-relevant, non-dividing cell types.
Implementation Considerations
- Requires expertise in recombinant protein expression, purification, and mammalian cell culture for transduction assays.
- Dependent on nickel-affinity chromatography infrastructure and access to IPTG, TB media, and protease inhibitors for lysis.
- Necessitates standardization of transduction conditions (e.g., protein concentration, incubation time) across cell types due to serum sensitivity and variable uptake efficiency.
- Requires optimization of fusion tag arrangement (e.g., TAT, NLS, His-tag) to balance solubility, yield, and biological activity.
- Limited by the need to empirically determine active concentration and incubation duration for each target protein and cell type.
