Name: 工程细胞透水蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 8 s
Description: 学习利用蛋白质转导技术将活性蛋白直接递送至哺乳动物细胞，无需基因修饰即可实现高效细胞操控。本方法特别适用于非分裂细胞，如神经元，为神经科学和细胞生物学研究提供安全可靠的替代方案。

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感谢奥利弗·布吕斯勒（Oliver Brüstle）以及波恩大学干细胞工程组的全体成员提供的支持和宝贵讨论。感谢萨宾娜·申克（Sabine Schenk）在 SDS-PAGE 制备以及整个项目过程中持续的支持。妮可·鲁斯（Nicole Russ）和安娜·马格亨斯（Anna Magerhans）提供了出色的技术支持。此外，我们感谢安德烈亚斯·贝尔（Andreas Bär）和希拉·默滕斯（Sheila Mertens）参与影片的制作。本工作得到了大众基金会（Volkswagen Foundation，项目编号 I/77864）和德国联邦教育与研究部（BMBF，项目编号 01 GN 0813）的资助。

表达载体的构建与表达：
通过标准克隆方法，利用AvrII和NheI限制性酶切位点将编码Cre的片段插入pSESAME载体，构建了pSESAME-Cre表达载体。pSESAME编码一种融合蛋白，包含组氨酸标签、TAT结构域、NLS序列和Cre，缩写为HTNCre。为表达HTNCre，将pSESAME-Cre转化至TUNER (DE3) pLacI菌株中，并用于制备甘油菌种保存液。
<ol>
 <li>使用移液枪头蘸取甘油保种管中的转化菌，接种于过夜培养液中。过夜培养液包含添加了0.5%葡萄糖 [v/v] 和羧苄西林（终浓度为50 μg/mL）的LB培养基，并在37°C下培养16小时。</li>
 <li>次日，将生长浓密的过夜培养物按1:40的比例接种至表达培养液中，并置于37°C培养箱中培养。表达培养液包含添加了0.5%葡萄糖 [v/v] 和氨苄青霉素（终浓度为100 μg/mL）的TB培养基。</li>
 <li>当OD595达到1.5时，加入0.5 mM IPTG诱导表达1小时。</li>
 <li>随后，使用SLA3000转子在5000 rpm条件下离心10分钟收集菌体。</li>
 <li>菌体沉淀在-20°C保存，直至进行纯化。</li>
</ol>
细胞通透性蛋白的纯化：
<ol>
 <li>将每升摇瓶培养物的冷冻细菌沉淀在10 mL裂解缓冲液中重悬，在室温下孵育15分钟。</li>
 <li>随后加入终浓度为1 mg/mL的溶菌酶，继续在室温下混匀孵育15分钟。</li>
 <li>再加入25 U/mL苯并核酸酶，在室温下混匀孵育15分钟。</li>
 <li>在冰上进行超声处理，功率为45%，脉冲0.5秒，总时长1.5分钟；之后每毫升悬液中缓慢加入1 mL预冷的酒石酸盐缓冲液（TSB），边加边混匀，并在冰上孵育5分钟。取裂解组分（L）用于SDS-PAGE分析。</li>
 <li>在4°C、30,000g条件下离心30分钟，获得澄清裂解液。分别取可溶性组分（S）和不溶性组分（I）用于SDS-PAGE分析。</li>
 <li>将上清转移至新的50 mL Falcon管中，每升初始表达培养物加入2 mL 50% Ni-NTA悬液，在4°C轻柔混匀1小时。</li>
 <li>将悬液装入重力流EconoPac层析柱中（收集穿流组分（FT）用于SDS-PAGE分析），并用2倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤两次。分别收集两步洗涤组分（W1和W2）用于SDS-PAGE分析。</li>
 <li>用3倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱含HTNCre的组分，并取洗脱组分（E）用于SDS-PAGE分析。</li>
 <li>通过高盐缓冲液透析两次，去除咪唑。</li>
 <li>进一步使用甘油缓冲液透析两次以浓缩蛋白溶液。所有透析步骤中，缓冲液体积与样品体积之比至少为50。该过程最终获得含HTNCre的甘油储存液，蛋白浓度通常为200至450 μM，即每升表达培养物可获得约12 mg蛋白。取甘油储存液（GS）样品用于SDS-PAGE分析。HTNCre储存液可在-20°C保存。</li>
</ol>
<img border="0" src="/files/ftp_upload/1627/1627fig1tmb.jpg" alt="蛋白质纯化电泳结果、凝胶条带、层析柱组分、SDS-PAGE分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1： Cre重组酶纯化过程中所收集样品的SDS-PAGE分析。裂解液组分中出现的主条带表明Cre蛋白已成功诱导表达。尽管部分蛋白不溶，但Cre蛋白在洗脱组分和甘油保存组分中得到了进一步富集。L：裂解液，I：不溶组分，S：上清液，FT：穿流组分，W：洗涤组分，E：洗脱组分，GS：甘油保存液。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1627/1627fig1.jpg">点击此处</a>查看图1的放大版本。
蛋白质转导至小鼠胚胎干细胞（ES细胞）：
<ol>
 <li>使用 TrypLE™ Express 将携带条件性 β-半乳糖苷酶报告基因5 构建体的 ES 细胞解离为单细胞后接种。4 至 6 小时后细胞重新贴壁，弃去培养基。</li>
 <li>随后，ES 细胞在含有 HTNCre 的培养基中孵育 16 小时。
 <ul>
 <li>从甘油保存液中取适量 HTNCre 蛋白（相当于 10 μM），稀释于 ES 培养基中，随后经无菌过滤（0.22 μm）。</li>
 </ul></li>
 <li>蛋白转导完成后，更换为正常生长培养基。</li>
 <li>两天后，用 PBS 洗涤细胞，并用 4% 多聚甲醛（PFA）固定 10 分钟。</li>
 <li>在进行 X-Gal 染色前，再用 PBS 额外洗涤两次。</li>
 <li>将固定后的细胞覆盖一层 X-Gal 染色液6，于 37°C 过夜孵育。</li>
</ol>
代表性结果：
次日吸除X-Gal染色液，细胞用一层PBS覆盖，用于显微镜分析。根据β-半乳糖苷酶活性判断，在小鼠ES细胞中可观察到80%至100%的重组细胞。

<ol><li>Gump, J. M., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT+transduction%3A+the+molecular+mechanism+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects.</a> Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).</li>
<li>Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+revisited%3A+novel+insights+into+the+mechanism+underlying+intracellular+delivery+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Protein transduction revisited: novel insights into the mechanism underlying intracellular delivery of proteins.</a> Curr Pharm Des. 14 (34), 3628-3636 (2008).</li>
<li>Branda, C. S., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Talking+about+a+revolution%3A+The+impact+of+site-specific+recombinases+on+genetic+analyses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice.</a> Dev Cell. 6 (1), 7-28 (2004).</li>
<li>Nolden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination+in+human+embryonic+stem+cells+induced+by+cell-permeant+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination in human embryonic stem cells induced by cell-permeant Cre recombinase.</a> Nat Methods. 3 (6), 461-467 (2006).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+site-directed+recombination+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 24 (4), 543-548 (1996).</li>
<li>Peitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purification+of+cell-permeant+Cre+and+germline+transmission+after+transduction+into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Enhanced purification of cell-permeant Cre and germline transmission after transduction into mouse embryonic stem cells.</a> Genesis. 45 (8), 508-517 (2007).</li>
<li>Bosnali, M., Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transducible+versions+of+transcription+factors+Oct4+and+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Generation of transducible versions of transcription factors Oct4 and Sox2.</a> Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).</li>
<li>Landry, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx+genes+are+direct+targets+of+Scl%2FTal1+in+the+yolk+sac+and+fetal+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Runx genes are direct targets of Scl/Tal1 in the yolk sac and fetal liver.</a> Blood. 111 (6), 3005-3014 (2008).</li>
</ol>

在Cre融合蛋白的纯化过程中，离心前必须加入冰&nbsp;冷的TBS缓冲液，不可省略此步骤，否则Cre重组酶容易在甘油缓冲液中发生沉淀。
如果由于融合蛋白浓度过高导致洗脱组分出现浑浊，应加入更多的洗脱缓冲液，直至溶液重新变澄清。
使用10 μM的Cre融合蛋白通常可达到80%至100%的重组效率。胎牛血清（FCS）作为胚胎干细胞培养基的主要成分，会强烈抑制蛋白转导，因此必须使用高浓度的Cre重组酶。在无血清条件下，仅需使用较低浓度的蛋白（0.5 - 2 μM）即可达到相似的重组效率。
利用pSESAME载体系统，可将蛋白质转导技术应用于其他蛋白质，包括Oct4和Sox27以及Scl/Tal18等转录因子。

<table><tbody><tr><td>TUNER (DE3) pLacI</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70625</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3783.2</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>T876.1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>4625.1</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>X998.4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>2363.4</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨/蛋白胨</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>8952.4</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; </td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>P749.2</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6344.2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>苯并核酸酶</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-酒石酸二钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% Ni-NTA 悬浮液</td><td>Invitrogen</td><td>R901-15</td><td></td></tr><tr><td>EconoPac 层析柱</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>0.22&amp;mu;m 无菌滤器</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td></td><td></td><td>酵母提取物，胰蛋白胨/蛋白胨，NaCl</td></tr><tr><td>TB 培养基</td><td></td><td></td><td>酵母提取物，胰蛋白胨/蛋白胨，甘油，K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>裂解缓冲液</td><td></td><td></td><td>50 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，5 mM Tris，pH 7.8</td></tr><tr><td>酒石酸盐缓冲液（TSB）</td><td></td><td></td><td>PTB 含 2 M L-酒石酸二钠盐和 20 mM 咪唑</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液</td><td></td><td></td><td>PTB，500 mM NaCl，15 mM 咪唑</td></tr><tr><td>洗脱缓冲液</td><td></td><td></td><td>PTB，500 mM NaCl，250 mM 咪唑</td></tr><tr><td>高盐缓冲液</td><td></td><td></td><td>600 mM NaCl，20 mM HEPES，pH 7.4</td></tr><tr><td>甘油缓冲液</td><td></td><td></td><td>50% 甘油，500 mM NaCl，20 mM HEPES，pH 7.4</td></tr><tr><td>TrypLE&amp;#8482; Express</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESGRO（LIF）</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>PAA Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Gal 染色液：</td><td></td><td></td><td>4 mM K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;(FeIII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)，4 mM K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(FeII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)，&lt;br/&gt;2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，0.4 mg/mL X-Gal 溶于 PBS</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;(FeIII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3367</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (FeII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-9387</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr></tbody></table>

可穿透细胞的蛋白质的构建

Engineering Cell-permeable Protein

蛋白质转导技术能够将具有生物活性的物质直接递送至哺乳动物细胞内[综述见1,2]。该技术可利用一类被称为细胞穿透肽（cell penetrating peptides, CPPs）的分子，也称为蛋白质转导结构域（protein transduction domains, PTDs）。来源于人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的Tat（转录反式激活因子）蛋白的TAT-CPP已被广泛应用。带正电荷的TAT可通过内吞作用和/或直接穿透细胞膜的方式促进细胞通透性，从而克服细胞膜屏障2。当与核定位信号（nuclear localization signal, NLS）结合时，融合蛋白能够进入细胞核并发挥功能。我们的视频展示以可穿透细胞的蛋白质构建为例，演示了DNA修饰酶Cre的一种细胞可穿透形式的构建、生产及其应用。
Cre 是一种位点特异性重组酶，能够在哺乳动物细胞中识别并重组 34 个碱基对长的 loxP 位点 体外 和 体内因此，Cre/loxP 系统被广泛用于在活细胞基因组中条件性地诱导突变3,4然而，将有活性的Cre重组酶递送至细胞仍存在局限性。
我们介绍了pSESAME载体系统，该系统允许将目的基因直接插入，并提供了一个平台，可方便、标准化地快速克隆载体内不同的结构域和标签。已证实，重组不同标签的排列顺序可改变融合蛋白的生化特性，从而有可能获得更高的表达产量和更好的溶解性。我们展示了如何在大肠杆菌（E. coli）中表达并纯化重组的细胞通透性蛋白。最后，通过评估重组Cre蛋白在细胞内的重组酶活性，在细胞培养中验证了其功能活性。

蛋白质转导技术能够将具有生物活性的蛋白质直接递送至细胞内。与传统的DNA转染或病毒转导方法相比，这种非侵入性策略能够以可调节的方式实现高效的细胞操控，避免了因永久性基因修饰所导致的细胞毒性及致癌转化风险。

蛋白质转导技术能够将具有生物活性的物质直接递送至哺乳动物细胞内［综述见文献1,2］。为此，可以……

在过去的15年中，细胞功能的调控可通过经典的DNA转染或病毒转导方法实现。另一种方法也随之发展：通过将目的蛋白与促进细胞摄取的小肽融合，可将具有生物活性的蛋白质直接递送至哺乳动物细胞内。由于未使用DNA，避免了过度表达导致的发育缺陷风险。与上述经典方法不同，蛋白质转导能够以可滴定的方式递送蛋白质。此外，小规模的细胞群体以及非分裂细胞（如有丝分裂后的神经元）也可被调控。为了高效表达重组蛋白，我们推荐使用 Paciz 载体系统。该系统是一种模块化载体系统，包含末端和 C 末端两种变体。这两种载体均可方便地插入目的基因，用于纯化。载体中整合了组氨酸标签以及蛋白转导结构域。在本例中，利用HI病毒的蛋白转导结构域促进细胞摄取，实现细胞内分布。核定位信号完成了载体的构建，出于对照目的，融合标签可被简单移除。此外，这些标签的排列方式可能对融合蛋白的性质产生重大影响。其对产量、纯度以及可销售性和生物学功能的影响均不可预测。您好，我叫 Bernard Mus，我在德国波恩的重建神经生物学研究所干细胞工程组工作。您好，我叫 Christoph P，我也是胡佛实验室的成员。我们课题组广泛采用蛋白质转导技术，将具有生物活性的蛋白质直接递送至多种哺乳动物细胞中。今天，我们将为您详细介绍在大肠杆菌中进行蛋白质表达与纯化的过程。接下来，我们将向您展示如何在细胞培养中应用细胞永久融合蛋白，以示范整个流程，包括表达、纯化和应用。我们利用位点特异性重组酶 Cre 对小鼠胚胎干细胞进行遗传修饰。好的，让我们开始吧。为了接种过夜培养物，我们使用保存在–80摄氏度甘油 stock 中的已转化细菌。这些细菌已含有编码decre重组的载体。使用移液器吸头，用吸头刮取少量细菌，并将其放入含有过夜培养物的烧杯中。过夜培养的培养基为添加了葡萄糖（终浓度为0.5%）和每毫升50微克碳酸胰岛素的LB培养基。随后将烧杯置于37摄氏度的培养箱中，以诱导位点特异性重组酶Cree的表达。我们使用预处理的TB培养基进行大规模表达培养。为了加快表达速度，我们建议使用预热至37摄氏度的TB培养基，该温度是重组蛋白表达过程中的培养温度。接下来，将葡萄糖加入TB培养基中，使其终浓度为0.5%。葡萄糖可防止在诱导前的表达菌培养生长过程中融合蛋白的基础表达升高。最后，向表达培养物中加入氨苄青霉素，使其终浓度为100 µg/mL，以确保培养物为纯培养，仅含有仍携带编码目标蛋白的质粒的细菌。现在我们可以取过夜培养物，并以1:50的比例接种表达培养物。然后将烧瓶转移至37摄氏度的培养箱中进行培养。在整个表达过程中，应定期取样，以测定光密度。当培养物达到1.5的光密度时，加入IPTG至终浓度为0.5毫摩尔，对细菌进行诱导。诱导一小时后，将表达培养物转移至离心管中，并通过离心收集菌体。本实验使用SLA 3000转子进行此步骤。离心机以每分钟 5,000 转的速度在 4 °C 下离心 10 分钟。随后弃去上清液，细菌沉淀可在 -20 °C 长期保存。将冷冻的沉淀物重悬于 lizza 缓冲液中，其量相当于一升表达培养物的量。加入10 ml的lizza缓冲液，等待约15分钟，直至溶液变得均匀。每1 ml悬浮液中加入1毫克溶菌酶。将溶液混合20分钟，使酶能够裂解细菌。随后，加入Benson Nase，稀释比例为1:1000，继续孵育15分钟，以切割DNA，从而得到非黏稠的溶液。最后，使用超声仪确保细胞完全裂解。在完成认证后，程序以45%的功率运行一个半小时。请务必在此处的每一步都留样，包括粗裂解液或纯化过程中的SDS-PAGE分析。现在每毫升悬液中加入1 ml预冷的TSB缓冲液至关重要，因为目的蛋白容易在甘油保存液中发生沉淀。如果跳过此步骤，溶液需短暂混匀，此时粗提物即可用于离心。为此，我们使用 SS 34 转子。离心机在 4°C 条件下以 17,000 RPM 转速运行 30 分钟。离心结束后，小心地将上清液转移至新的 50 ml Falcon 管中。现在将镍-抗A悬浊液加入上清液中的镍中。抗A是正确纯化组氨酸标签融合蛋白的关键试剂。组氨酸可与镍离子形成复合物，从而实现亲和纯化。现在将离心管在40°C下轻轻振荡60分钟。一小时后，可将悬液上样至20 mL层析柱，依靠重力流使溶液过柱。对于大规模制备，可将悬液分装至多根层析柱进行操作。随后，用含有15毫摩尔肌醇的缓冲液洗涤层析柱两次。缓冲液的用量取决于树脂体积。两毫升镍柱NTA相当于一毫升树脂用于洗涤。洗涤后，我们向柱子中加入五倍树脂体积的洗涤缓冲液，现在可以开始洗脱目标蛋白了。因此，我们使用含有250毫摩尔免疫试剂的洗脱缓冲液。请注意树脂颜色如何逐渐变为绿色。由于CRE蛋白浓度较高，OID组分有时会变得浑浊。为防止此情况发生，需混匀溶液并加入额外的裂解缓冲液，所有组分现在将被合并，随后转移至透析管中。裂解后，首先进行对含有高浓度盐的缓冲液的透析步骤。一小时后，更换高盐缓冲液，并继续过夜透析。第二天，将透析袋从高盐缓冲液中取出，转移至甘油缓冲液中。三到五小时后，更换甘油缓冲液，并再次过夜透析。用甘油缓冲液进行透析将得到至少三倍浓缩的储存液。现在可将储备液在零下20摄氏度保存数年，而不会失去活性。为确保质量，可将收集的SDS-PAGE样品上样至凝胶，随后进行染色。对于Kamasi，Cree融合蛋白在OID组分中表现为一条明显的条带。为了使用适当浓度的Crew重组蛋白，应通过Redford法测定其浓度。如何将永久性蛋白质导入哺乳动物细胞。首先，准备您的靶细胞，以实现最高的蛋白质转导效率。如果您的靶细胞是成紧凑集落生长的细胞，则应将单层细胞以适当的密度接种，使其在第二天达到80%至90%的汇合度。提前五小时将细胞分离并进行机械性处理，以获得单细胞悬液。在蛋白质转导之前制备单细胞悬液非常重要，否则只有菌落表面的细胞能够被转导。吸除培养基，并在进行处理前用磷酸盐缓冲液（PPS）短暂洗涤细胞。去除残留的含血清的完全培养基。用移液管吸去PPS覆盖层中的细胞，静置滴落，然后让细胞孵育3至5分钟。现在在显微镜下检查，确认所有集落是否均已分散为单个细胞。上述原因表明，这是将蛋白质转导入 yes 细胞的关键步骤。将悬浮细胞转移至离心管中，将离心管放入台式离心机，离心沉淀细胞，吸除上清液，重悬细胞。在生长培养基中将细胞稀释至适当的细胞数量。当然，这取决于组织培养皿的大小。将细胞在培养皿中孵育，额外孵育五小时。这将使气室细胞有足够时间贴附到底部并贴壁生长。三类细胞株可在零下20摄氏度保存两年以上。在处理重组细胞永久融合蛋白时，拥有此类可按需使用的储备溶液非常有益。在等待细胞贴壁至培养皿的同时，可先配制C转导培养基，只需将适量胆固醇储备液中的细胞永久性蠕变蛋白加入培养基中即可。由于Clare储备液尚未经过灭菌，转导培养基在使用前必须进行无菌过滤。我们建议使用可旋接至小叶蛋白结合滤膜的注射器。最终的感染浓度取决于细胞类型或培养基添加物。例如，血清对转导效率具有强烈的抑制作用。可通过使用无血清培养基或提高感染浓度来克服这一影响。我们找到了能够实现最高重组效率的最佳条件。将脱氢酶浓度从0.5微摩尔开始逐步增加至10微摩尔。我们建议测试6至18小时之间的不同孵育时间。孵育5小时后，取出目标细胞并吸除交叉培养基。随后，将其替换为蛋白转导培养基，将细胞放回培养箱中过夜孵育。用PPS短暂清洗D细胞，并将蛋白转导培养基更换为正常的ES培养基。孵育48小时后，可通过xul检测到细胞中稳定表达的Cree基因。经染色后，具有阳性bega表型的细胞已通过位点特异性重组成功实现基因工程改造。Cree报告。细胞在预先介导的重组后携带CRE并使用Lae构建体。一个由P片段 flank 的终止序列被切除，同时由team启动子驱动的luxe报告基因被激活。为了评估预处理报告基因空气细胞中的重组效率，细胞必须进行固定。吸去培养基，用 PBS 洗涤细胞两次，加入 4% PFA 覆盖细胞，并在室温下孵育 10 分钟。随后再次用 PBS 洗涤细胞三次。最后一次洗涤后，吸去 PBS，向孔中加入 Xal 染色液，在 37 摄氏度培养箱中孵育过夜。第二天，可通过观察蓝色环状细胞来监测 Beal 活性。重组效率可通过蓝色菌落数量来确定。在最佳条件下，重组效率应可达到 90% 以上。好了，今天向您展示了如何在大肠杆菌中表达并纯化位点特异性查询重组系统。在此原理验证研究中，我们能够在大多数盐中诱导出重组。好了，就这些。祝您的实验顺利。I.

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

工程细胞透水蛋白

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本演示介绍了一种利用电穿孔技术对贴壁培养细胞进行研究的方法，用于分析细胞间连接通讯，同时细胞生长在涂有导电透明氧化铟锡的载玻片上。...

一种用于间隙连接功能检测的实验方法；在氧化铟锡上对贴壁细胞进行电穿孔

采用电穿孔法将纯化的细菌毒力效应蛋白直接导入活的真核细胞中。通过共聚焦免疫荧光显微镜监测蛋白的定位。该方法可利用有活性的外源蛋白研究蛋白的转运、功能及蛋白-蛋白相互作用，避免了在真核细胞中进行异源表达的需要。...

将功能性细菌效应蛋白电穿孔导入哺乳动物细胞

本文介绍了一种用于确定活细胞中整合膜蛋白取向和拓扑结构的实验方案。该简单方案依赖于目标蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）融合形成的嵌合体对蛋白酶的选择性敏感性。...

利用荧光蛋白酶保护法（FPP）测定膜蛋白拓扑结构

本方案介绍了利用跨孔无溶剂脂双层在单个转运蛋白水平上分析膜蛋白介导的转运过程。该方法通过制备大量生产的纳米孔阵列芯片，结合高通量数据采集与分析，有望实现膜蛋白效应物筛选的未来应用。...

基于高通量纳米孔芯片系统在单蛋白分辨率下分析膜转运过程

本文介绍了两种评估肠道屏障功能的方法。使用上皮电阻仪（伏特/欧姆计）直接在组织培养板孔中测量培养上皮细胞的跨上皮电阻，以评估其屏障完整性。在小鼠中，采用荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖（FITC-dextran）灌胃法测定肠道通透性。 体内.

体外 与 体内 评估肠上皮细胞通透性的方法

荧光泄漏实验是一种简单的方法，可用于研究肽与膜之间的相互作用，以了解其在多种生物过程中的作用，特别是细胞穿透肽在直接跨细胞转位过程中扰动磷脂双分子层的能力。...

荧光泄漏实验用于研究穿膜肽对膜稳定性的破坏

本方案描述了构建一种芯片实验室微流控电穿孔装置所需的微加工技术。该实验装置可在连续流动条件下实现可控的单细胞水平转染，并可通过基于细胞群体的控制进一步扩展至更高通量。文中提供了分析结果，展示了实时电学监测细胞膜通透化程度的能力。...

连续流动微电穿孔系统的构建与操作及其通透性检测

多孔基质电穿孔（PSEP）可实现稳定、高通量的递送，并保持高细胞存活率。跨上皮电阻（TEEI）测量的引入为PSEP的中间过程提供了深入见解，并实现了无标记递送。本文介绍了一种同时进行PSEP递送实验与TEEI测量分析的方法。...

基于多孔基底的电穿孔结合跨上皮电阻监测

学习利用蛋白质转导技术将活性蛋白直接递送至哺乳动物细胞，无需基因修饰即可实现高效细胞操控。本方法特别适用于非分裂细胞，如神经元，为神经科学和细胞生物学研究提供安全可靠的替代方案。

可穿透细胞的蛋白质的构建

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