Name: 马赛克斑马鱼转基因增强子序列，以评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学习利用马赛克斑马鱼转基因技术分析增强子元件功能，研究骨骼发育相关基因的转录调控机制。该方法为发育生物学和遗传学研究提供了重要的实验框架。

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感谢 Paula Roy 女士出色的鱼类饲养工作，以及 Steve Ekker 慷慨惠赠 pDB600 质粒。本研究由 NHGRI 资助 S.F. 的基金项目资助。

1. 用于测试的保守序列的选择与克隆
<ol>
 <li> 首先必须确定用于功能测试的潜在调控序列。我们依靠进化上的序列保守性作为选择序列的标准，最常使用的是PhastCons算法，该算法可在UCSC基因组浏览器（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）上以轨迹（track）形式获取。然而，目前已有多种其他算法可用于评估跨物种的序列保守性。</li>
 <li> 选定序列后，我们设计引物以从基因组DNA中扩增每条序列。引物应选择用于扩增保守区域及其两侧各30个或更多碱基对的区域。</li>
 <li> 为扩增所选序列，我们使用 Takara LA TaqTM 系统。其他聚合酶也可使用，但重要的是应选用包含具有校对功能酶的混合酶体系，以最大限度降低扩增过程中引入错误的几率。我们通过琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物的大小。</li>
 <li> 我们使用 pCR 8/GW/TOPO TA 克隆试剂盒（Invitrogen）将 PCR 产物克隆至含有 attL 重组位点的入门载体中，以构建 Gateway 入门克隆。新鲜的 PCR 产物可提高克隆反应效率，因此最好在 PCR 完成后一天内进行克隆。随后将产物转化至 DH5α 菌株，并通过壮观霉素抗性进行筛选。</li>
 <li> 通过使用 EcoRI 酶切约 500 ng 质粒以释放插入片段，并利用琼脂糖凝胶电泳确认插入片段的大小，从而验证 TA 克隆产物。我们建议通过测序验证插入片段的序列及方向；用于扩增的引物也可用于测序。</li>
 <li> 从入门克隆中，利用Gateway LR Clonase II酶混合物（Invitrogen），通过LR重组将非编码保守序列转入已准备好的Gateway目的载体pGW_cfosGFP1中。随后将重组质粒转化至DH5α菌株，并进行氨苄青霉素抗性筛选。</li>
 <li> 通过使用EcoRV酶切约500 ng质粒以释放插入片段，并通过琼脂糖凝胶电泳确认插入片段的大小，来验证LR重组产物。在确定正确克隆后，使用Qiagen HiSpeed® Plasmid Midi Kit提取质粒DNA。随后按照制造商的操作说明，使用QIAquick PCR纯化试剂盒进一步纯化质粒DNA，并用 30 μL RNase-free 水。将质粒稀释至浓度为 125 ng/μL。μL 并储存在 4°C 注射前。</li>
 <li> 编码具有功能的 Tol2 转座酶的 RNA 被转录 体外 从pDB600质粒2中提取。我们使用Qiagen Midi-Prep试剂盒纯化质粒，然后将10-20 μg 用 XbaI 进行酶切。mRNA 的合成按照 mMESSAGE mMACHINE 试剂盒（Ambion）说明书进行。</li>
 <li> 我们根据试剂盒说明书纯化并沉淀RNA。将RNA重悬至终浓度约为~1μg/μl，或 20 μl 对于单个反应，在无RNase的水中进行，并通过紫外分光光度法进行定量。我们还分析约1μg 通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA，以验证全长转录产物。尽管标准的TAE或TBE凝胶适用于此分析，但仍应按照转录试剂盒说明书使用试剂盒中提供的变性上样缓冲液。</li>
 <li> 我们通过使用已知质粒进行显微注射（图1）来测试每批新制备的转座酶RNA的活性。经验证后，将RNA分装成小份并保存于-80°C，以避免单次分装样品的反复冻融。 <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig1.jpg" alt="斑马鱼胚胎发育；上图为明场显微镜图像，下图为荧光成像；GFP表达研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 注射小鼠Sox10增强子作为对照的斑马鱼胚胎。(顶部明场图像底部) GFP荧光图像。每一批新的转座酶RNA均需测试其有效性。</li>
</ol>
2. 斑马鱼胚胎的显微注射用于嵌合转基因分析
<ol>
 <li> 我们使用 Sutter P-97 微电极拉制仪，以直径 1.2 mm 的细丝毛细管玻璃管拉制显微注射用的微针，所用程序旨在制备出具有较强尖端且锥度较锐利的微针，以穿透完整的卵膜。在体视显微镜下手动折断针尖，使其外径约为 15 μm使用洁净的剃须刀片和测微尺载玻片制备针头。针头可在注射前一天制备，并置于带盖的培养皿中保存，以保持清洁。</li>
 <li> 我们按照常规的明暗循环周期饲养斑马鱼，每天提供14小时光照，饲养条件符合标准3。在进行显微注射的前一天，我们将斑马鱼按预定交配时间放入小型繁殖缸中，每个繁殖缸由一个基础缸、一个带槽隔板和一个塑料盖组成。每缸并排放置三条雌鱼或两条雄鱼。</li>
 <li> 在显微注射当天早晨，光周期开始后不久，我们将雄鱼和雌鱼放入洁净的系统处理水中进行配对以获取卵子。需频繁检查鱼类状态，并在产卵后几分钟内及时收集卵子，以获得同步性良好的卵批次。通过在整个上午持续更换新的鱼群进行配对，可将产卵时间维持两到三个小时。</li>
 <li> 使用内径较宽的 5 1/4 英寸玻璃巴斯德移液管（配乳胶吸球），将收集的胚胎分选至部分盛有胚胎培养基2的 60 × 15 mm 培养皿中，每皿 50 枚胚胎，并在皿盖上标注收集时间。</li>
 <li> 一旦鱼类开始产卵，我们即在冰上将以下成分混合于微量离心管中，配制新鲜的注射液：
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>组分</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>转座子质粒储备液（125 ng/μL）μl)</td>
 <td>1μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>转座酶RNA储备液（175ng/μl)</td>
 <td>1μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>酚红储备液（2% 溶于 H2O</td>
 <td>0.5μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase free water</td>
 <td>2.5μl</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 
 将注射针放置于盛放用的培养皿中，用移液器吸取500 nl注射溶液滴加至每根针的宽端。液体通过毛细作用被吸入针尖后，可继续添加溶液，总量达到1.5-2 μl每次注射溶液至少准备两根针头。</li>
 <li> 将装有液体的针头装入气动Pico-Pump或类似压力注射仪的手持式针头夹持器中，按照制造商说明进行配置并连接至N2气罐。我们通过测量在显微测微载玻片上的矿物油中排出液滴的直径来校准注射体积。通常，设定注射时间为120毫秒、压力为20 psi时，可产生约1 nl的液滴；但由于针头直径存在微小差异，这些参数可能受到影响，因此在不同针头之间可能需要重新校准。</li>
 <li> 在体视显微镜下以6-10倍放大倍数进行显微注射。使用一对精细镊子固定胚胎，将注射针在稳定压力下穿过卵膜，插入单细胞期或早期双细胞期胚胎的卵黄中。理想情况下，针尖应位于卵裂球正下方的卵黄区域。注入约1 nl的注射溶液后，缓慢退出注射针。每种构建体至少注射200枚胚胎。此外，对于每批收集的胚胎，务必保留一皿未注射的对照胚胎。</li>
 <li> 注射完成后，我们通过去除未受精卵、受损胚胎以及注射失败的胚胎（卵裂球中无酚红的胚胎）对胚胎进行筛选。随后将胚胎置于胚胎培养液中培养 28.5°C 直到合适的观察时间。</li>
</ol>
3. 嵌合表达模式的分析
<ol>
 <li> 经过适当的孵育时间后，我们观察注射后的胚胎是否产生荧光。观察时间取决于内源性斑马鱼基因的正常表达模式，但通常我们在受精后的前5天内每天进行观察。</li>
 <li> 我们使用配备落射荧光装置的 Olympus MVX10 体视显微镜观察胚胎荧光，但任何具备低倍成像能力的类似显微镜均可使用。如果在第一天有大量胚胎死亡或发育异常，应检查该批次未注射的对照组胚胎是否正常。若对照组发育正常，则最常见的问题是注射用DNA纯度不足。此外，早期胚胎对注射质粒的总量较为敏感，因此也可能是由于DNA定量不准确，导致注射了过量的DNA。</li>
 <li> 观察胚胎时需注意，所有胚胎对注射的构建体均呈嵌合表达。因此必须仔细检查每一个胚胎，尤其是当预期的表达区域较小时。同时需记住，表达可能是动态变化的：第1天强烈的荧光可能在第2天消失，而前3天无表达的胚胎可能在第4天出现荧光信号。</li>
 <li> 我们挑选出表达范围较广泛的胚胎，通过显微摄影记录其荧光表达模式。在完成5天的观察后，应将胚胎送回饲养设施并作为品系继续培养。数月后，可对成鱼进行筛选，以检测转基因是否实现了种系传递。</li>
</ol>
4. 结果
我们观察到多种多样的表达模式和表达水平，这取决于所分析的增强子元件。我们通常关注的是具有高度组织特异性的表达模式，尤其常聚焦于在骨骼中表达的基因。图2展示了我们在显微注射胚胎中观察到的嵌合表达模式示例，其中增强子调控软骨和骨骼中的基因表达。最后，大量经测试的序列并不调控组织特异性表达。对于这些序列，我们通常仅观察到极微弱的荧光信号，可能每个胚胎仅有零星散在的几个细胞发出荧光。较少情况下，我们可观察到荧光信号，但仅出现在异位表达的两个常见部位：表皮和骨骼肌（图3）。 <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig2.jpg" alt="生物发光生物的荧光显微镜图像，显示暗视野下发光的结构。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 显微注射胚胎中观察到的软骨和骨骼表达模式示例。 <img src="/files/ftp_upload/1722/1722fig3.jpg" alt="斑马鱼胚胎显微镜图像；上图：明场，下图：荧光；基因表达研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 增强子相对于基因的位置与其对表达的调控之间相关性较弱。大量经测试的序列并不调控组织特异性表达。这些序列通常荧光信号极弱，或仅在异位表达的两个常见部位出现：表皮和骨骼肌。（上图）明场图像（下图）GFP荧光图像。

<ol><li>Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+biological+relevance+of+putative+enhancers+using+Tol2+transposon-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).</li>
<li>Balciunas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169-169 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. Westerfield, M. , 3 ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (1995).</li>
</ol>

我们已展示了本实验室用于利用斑马鱼转基因技术高效分析潜在增强子的方法。通常，我们采用此方法寻找与人类基因相关的组织特异性增强子。尽管人类与鱼类的非编码序列之间大多数情况下缺乏明显的序列同源性，但我们发现该方法通常能够成功鉴定出我们感兴趣基因的增强子。成功的关键因素在于仔细制备质粒DNA和转座酶RNA，并对每种构建体注射并检测足够数量的胚胎。转基因构建、胚胎显微注射以及嵌合表达分析的一般方法也可适用于为多种其他目的构建转基因斑马鱼品系。

<table><tbody><tr><td>Takara LA Taq</td><td>Takara Bio Inc</td><td>RR02M</td><td></td></tr><tr><td>pCR8/GW/TOPO TA 克隆试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K2500-20</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II 酶混合液</td><td>Invitrogen</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>高效文库克隆用感受态细胞 DH5&amp;alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>12535-019</td><td></td></tr><tr><td>高效文库克隆用感受态细胞 DB3.1</td><td>Invitrogen</td><td>11782-018</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE 体外转录试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed 质粒中量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>气动 PicoPump</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr></tbody></table>

用于评估增强子序列的嵌合体斑马鱼转基因技术

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

人类基因组序列以及许多其他物种基因组序列的完成，凸显了为非编码序列赋予特定功能所面临的挑战。基因组中的非编码区域一个重要功能是调控基因转录，然而目前尚无有效方法能够从初级DNA序列广泛预测顺式调控元件。我们开发了一种高效的实验方案，通过斑马鱼转基因技术对潜在的顺式调控元件进行功能评估。与基于细胞培养的技术相比，该方法在研究发育相关基因时具有显著优势，因为它能够提供基因调控在空间和时间上的信息。相反，与转基因小鼠中的类似实验相比，该方法更快且成本更低，我们常规将其应用于从人类基因组中分离出的序列。本文中，我们展示了基于序列保守性筛选待测元件的方法，以及克隆序列并将其显微注射至斑马鱼胚胎的实验流程。

关键词：基因组非编码序列，顺式调控元件，基因转录调控，斑马鱼转基因，序列保守性，功能验证，显微注射，胚胎分析

我们展示了如何从发育调控基因中寻找潜在的增强子元件，并通过嵌合型斑马鱼转基因技术评估其功能。

人类基因组序列以及许多其他物种基因组序列的完成，凸显了为非编码序列赋予特定功能所面临的挑战。

大家好，我是来自宾夕法尼亚大学细胞与发育生物学系Fisher实验室的Erica Kgi。我是Chris Weber，也来自Fisher实验室。我是Shannon Fisher。今天我们将向您展示一种利用斑马鱼转基因技术分析增强子元件功能的方法。我们使用该方法研究在骨骼发育中起重要作用的基因的转录调控机制。现在就开始吧。为了鉴定候选基因周围的非编码序列，我们使用了 fast cons 算法，该算法可在 uc SC 基因组浏览器上作为轨迹图层获取。我们主要关注在骨骼发育过程中表达的基因，但相同的方法也可用于研究早期发育中表达的任何基因。在本示例中，我们已鉴定出保守序列。在人类 bumper 基因附近的区间内，我们检测该区间内相邻基因的全部序列，并确定一个对应于非编码序列中约前 5% 的低尺寸特异性对数得分阈值。在选定序列后，使用 Primer3 设计引物，从人类基因组 DNA 中扩增每一段序列；引物应选择用于扩增保守区域及其两侧各 30 个或更多碱基对的区域。使用高质量聚合酶和人类基因组 DNA 扩增目标区域，并采用标准实验室分子生物学方法将扩增产物克隆至表达载体中。本实验方案中使用的载体为 PG wc FOS GFPA gateway，目的载体。在完成载体构建后，需进行转座操作。用于转座的酶首先使用Ambion公司的M message M体外转录试剂盒以及PGB 600质粒在体外进行转录，然后用于实验注射。通过与已知增强子（如小鼠socks 10增强子）共注射来检测每批转座酶的活性。为注射做准备，使用Sutter P-97型微电极拉制仪，将外径为1.2毫米的细丝毛细玻璃管拉制成显微注射用针头。采用一种可产生坚固尖端并具有锐利锥度的程序，以确保针头能够穿透完整的卵壳。在体视显微镜下用手动方式折断针尖，使其外径约为15微米。针头可在加盖的培养皿中保存一天。在显微注射前一天，将斑马鱼群体维持在标准条件下的正常光暗循环中，光照时间为14小时。将鱼放入小型繁殖缸中，准备定时交配。在微注射当天早晨光照周期开始后不久，将三条雌鱼或两条雄鱼并排放入每个水箱中。将雄鱼和雌鱼放入经清洁系统处理的水中进行配对，以促进产卵。频繁观察鱼类，并在产卵后几分钟内及时收集卵子，以获得同步性良好的卵批次。通过上午持续使用带有乳胶吸球的宽口5.25英寸玻璃移液管将新鲜的鱼群组合在一起，维持产卵两到三小时。将收集的胚胎按每50枚一组分选至部分充有胚胎培养基的60毫米×15毫米培养皿中。在每个培养皿的皿盖上标记收集时间。每次收集胚胎时，需保留一个含有50个胚胎的培养皿作为未注射对照组，置于两次卵收集之间。在微量离心管中混合以下成分，制备新鲜的注射溶液，并置于冰上保存。将注射针放置于盛放用的培养皿中，每根针内充入1.5至2微升注射溶液。通过将500纳升液滴移液至每根针的宽端。液体将通过毛细作用被吸入针尖。每种注射溶液至少准备两根针。将装满液体的针头装入气动皮升泵或类似压力注射器的手持式针头夹持器中，并根据制造商的说明连接至氮气罐。通过测量在显微测微载玻片的矿物油中排出液滴的直径来校准注射体积，通常注射时间为120毫秒。在20 PS的压力下，使用6至10倍放大倍率的体视显微镜，可产生体积约为一纳升的液滴。用一对精细镊子固定胚胎，以稳定的压力将注射针穿过卵膜，插入处于单细胞或早期双细胞阶段胚胎的卵黄中，将针尖置于卵黄内、卵裂球下方，推出约一纳升的注射溶液，然后撤出针头。针对每种构建体，注射的胚胎数量大于或等于200枚。注射完成后，通过剔除未受精卵、受损胚胎以及注射失败或卵裂球中无酚红的胚胎，对胚胎进行筛选。随后将胚胎及胚胎培养基置于28.5摄氏度下孵育，直至达到适宜的观察时间。接下来，我们将展示一些增强子元件的代表性结果，这些增强子可在斑马鱼胚胎中驱动GFP在特定组织中表达。我们研究在骨骼或软骨发育过程中表达的基因。这是位于 acan 基因上游的一个增强子元件示例，可在受精后三天调控颅面软骨中的基因表达。这是另一个来自 bumper 基因的增强子，可调控成骨细胞中的基因表达。在我们已鉴定出的众多增强子中，截至第五天，发现增强子相对于基因的位置与其对表达的调控之间相关性较弱。在选择待检测序列时，需要牢记的是，增强子可能位于基因上游或下游数百千碱基处，也可能位于内含子中，如此胚胎所示。大量序列似乎并不调控组织特异性表达，这些序列通常表现出极低的荧光信号，或仅在异位表达的两个常见部位——表皮和骨骼肌中出现少量散在的细胞。我们刚刚向您展示了如何通过序列保守性来鉴定潜在的增强子元件，并通过斑马鱼的嵌合转基因技术来检测其功能。进行该实验时，重要的是要检查用于注射的DNA和RNA的质量。此外，务必仔细观察所有注射后的胚胎，特别是当您预期仅在少量细胞中表达时。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

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