马赛克斑马鱼转基因增强子序列，以评估

大家好，我是来自宾夕法尼亚大学细胞与发育生物学系 Shannon Fisher 实验室的 Erica Kgi。我是 Chris Weber，同样来自 Fisher Lab。我是 Shannon Fisher。

今天，我们将向您展示一个使用斑马鱼转基因分析增强子元件功能的程序。我们使用该程序来研究骨骼发育中重要基因的转录调控。那么让我们开始吧。

为了识别围绕候选基因的非编码序列，我们使用算法 fast cons，该算法可以作为 uc SC 基因组浏览器上的轨道访问。我们主要对骨骼发育过程中表达的基因感兴趣，但同样的方法也可用于研究早期发育中表达的任何基因。在此处显示的示例中，我们确定了守恒序列。

在围绕人类 bumper 基因的区间中，我们检查到相邻基因的整个区间，并确定对应于大约前 5% 非编码序列的低大小特异性对数分数临界值。选择序列后，使用引物 3 设计引物以扩增来自人类基因组学的每个序列，应选择 DNA 引物以扩增保守区域加上两侧的 30 个或更多碱基对。使用人基因组 DNA 通过高质量聚合酶扩增目标区域，使用标准实验室分子生物学程序将扩增产物克隆到表达载体中。

该协议中使用的载体是 PG wc FOS GFPA 网关。目标向量。以下向量创建被告知转置。

在实验注射之前，首先使用来自 Ambion 的 M message M 机器套件和 PGB 600 质粒在体外转录转座所需的酶。通过注射已知的增强剂（如小鼠袜子）来测试每批转座的疗效。10 增强器。

为了准备注射，在 Sutter P 97 微量移液拉拔器上从 1.2 毫米外径的细丝毛细管玻璃中拉出用于显微注射的针头。使用一个程序，产生一个具有尖锐锥度的强尖端，用干净的剃须刀片和千分尺滑块穿透完整的冠状骨。在立体显微镜下用手将尖端折断至约 15 微米的外径。

针头可以在有盖的保温皿中存放一天。在进行显微注射前一天，在标准条件下保持 14 小时的光照，将斑马鱼种群维持在规律的光暗周期中。在小型繁殖池中准备定时交配的鱼。

光照周期开始后不久的显微注射早晨，将每个水箱中的三只雌性或两只雄性平行排成一排。将雄性和雌性混合在干净的系统处理水中进行产蛋。经常检查鱼，并在生产后的几分钟内收集鱼卵，以获得良好的同步批次。

通过整个上午继续将新鲜鱼群与装有乳胶球的宽口径 5.4 英寸玻璃移液管混合，保持产蛋两到三个小时。将收集的胚胎分选到 60 x 15 毫米的培养皿中，部分填充胚胎培养基，以 50 个胚胎为一组。在每道菜的盖子上标记收集的时间。

对于收集的每一窝胚胎，保存一个装有 50 个胚胎的培养皿，用于卵子收集之间的 unin 注射控制。通过将以下成分混合在微量离心管中制备新鲜的注射液，并储存在冰上。将注射针放在固定皿中，并填充 1.5 至 2 微升注射液。

将 500 纳升液滴到每个针头的宽端。液体将通过毛细管作用被吸入尖端。为每种注射液准备至少两根针头。

将填充的针头装入气动 pico 泵或类似压力注射器的手持式针架中。根据制造商的说明配置并连接到氮气罐。通过在千分尺载玻片上测量喷出到矿物油中的液滴的直径来校准进样体积，进样时间通常为 120 毫秒。

在 20 PS 的压力下，我将使用立体显微镜以 6 到 10 倍的放大倍率产生大约 1 纳升的液滴。用一对细镊子将胚胎固定到位，并在单细胞或早期双细胞阶段以稳定的压力将注射针头通过瓶芯推入胚胎的卵黄中，将针尖放在卵黄中，就在卵裂球下方，排出大约一升注射液，并为注射完成后我们注射大于或等于 200 个胚胎的每个构建体拔出针头。通过去除未受精的卵子、受损的胚胎和注射失败的胚胎或亵渎物中没有酚红的胚胎来对胚胎进行分类。

然后，我们在 28.5 摄氏度下孵育胚胎和胚胎培养基，直到适当的观察时间。现在，我们将向您展示在斑马鱼胚胎中产生组织特异性 GFP 表达模式的增强子元件的一些代表性结果。我们研究在骨骼或软骨中表达的基因。

这是 acan 基因上游的增强子元件示例，该元件在受精后 3 天调节颅面部软骨的表达。这是另一个增强子，这次来自调节骨细胞表达的 bumper 基因。在我们鉴定的许多增强子的 5 天时，我们发现相对于基因的位置与表达调节之间几乎没有相关性。

在选择要测试的序列时，重要的是要记住，增强子可以是基因上游或下游的数百 kb，也可以是该胚胎中所见的内含子之一。很大一部分序列似乎不调节组织特异性表达。这些通常显示非常少的荧光，或者在两个常见的异位表达部位（表皮和骨骼肌）可能有一些分散的细胞。

我们刚刚向您展示了如何通过序列保守来识别潜在的增强子元件，并通过斑马鱼中的马赛克转基因测试它们的功能。进行此程序时，检查用于注射的 DNA 和 RNA 的质量非常重要。另外，请务必仔细检查所有注射的胚胎，特别是如果您只期望在一小群销售中表达。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。