Name: E4orf4诱导的细胞死亡的击倒效果的基因表达和测量条件击倒细胞系的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: 了解利用四环素诱导shRNA表达系统制备ACF1或SNF2h条件性敲低哺乳动物细胞系的方法，并评估ACF亚基缺失对腺病毒E4orf4诱导细胞死亡的影响。该方案为研究染色质重塑因子在细胞凋亡通路中的功能提供了可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作部分得到了以色列科学基金会（ISRAEL SCIENCE FOUNDATION，资助号 399/11）、德国-以色列项目合作框架下德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）以及拉帕波特医学科学研究所（Rappaport Family Institute for Research in the Medical Sciences）的支持。

1. 诱导型细胞系的构建
<ol>
 <li>实验前，需确定能够杀死所有用于制备目标细胞系的细胞的最低浓度药物G418。为此，将所选细胞以70%融合度接种于多个重复培养皿中，使用实验中将采用的培养基，并加入浓度递增的G418（0–1,000 μg/ml）。每日观察细胞，以确定能有效杀死细胞的最低G418浓度。细胞死亡通常在3–7天内出现。</li>
 <li>在构建细胞系之前，建议通过瞬时转染实验验证表达shRNA的质粒可在一定程度上降低目标基因的表达水平。该验证可在任何高效转染的细胞系中进行。</li>
 <li>将T-REx-293细胞以约5×106个细胞/10 cm培养皿的密度接种于8 ml DMEM培养基中（含10%经Tet系统认证的FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素和5 μg/ml杀稻瘟菌素）。于37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
 <li>次日转染前，更换为8 ml新鲜培养基。</li>
 <li>使用10 μg编码Acf1或SNF2h shRNA的pSuperior.neo+GFP质粒（图1）进行转染，该质粒的shRNA由四环素诱导型H1启动子驱动，同时携带与GFP融合的新霉素抗性基因，由组成型PGK启动子驱动。将DNA加入500 μl 150 mM NaCl中。另取500 μl 150 mM NaCl，按每μg DNA加入2 μl jetPIE试剂。将jetPIE溶液加入DNA中，充分涡旋混匀。室温孵育15分钟。将DNA复合物轻柔滴加至含有70–80%融合度细胞的10 cm培养皿中。将培养皿放回培养箱。</li>
 <li>次日，更换为筛选培养基（即上述DMEM培养基，额外添加500 μg/ml G418）。</li>
 <li>接下来两周内持续观察细胞，并每3–4天更换一次新鲜筛选培养基，直至出现肉眼可见的克隆。</li>
 <li>在分离克隆前，预先在24孔板中加入筛选培养基。</li>
 <li>肉眼识别克隆，并用彩色标记笔在培养皿底部标记其位置。在显微镜下确认各克隆之间分离良好。</li>
 <li>在无菌操作台中，吸除培养皿中的培养基，用预温的PBS轻轻冲洗，彻底吸净残留液体。向培养皿中的一个克隆加入3 μl 0.25%胰蛋白酶/EDTA。反复吹打直至细胞脱落，然后将其转移至24孔板中的一个孔。对培养皿中其他多个克隆重复此操作。</li>
 <li>将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养至孔内细胞长满。随后将每个原始克隆来源的细胞分种至三个不同的12孔板中的各一个孔，并过夜培养。</li>
 <li>次日，向其中一个12孔板更换含1 μg/ml多西环素的培养基（多西环素母液用双蒸水配制，浓度为1–5 mg/ml）；向对照板更换不含多西环素的培养基。于37 °C、5% CO2条件下继续孵育72小时。</li>
 <li>从每个细胞克隆的处理组和未处理组各取一个孔收集细胞，用于制备蛋白提取物并进行Western blot分析，以评估Acf1或SNF2h的敲低效率。使用抗Acf1或抗SNF2h抗体，以及作为上样对照的抗α-微管蛋白（alpha-Tubulin）抗体。将第三个未处理孔中的细胞用于扩增那些在加入多西环素后目标蛋白水平降低至少50%的细胞克隆。将这些细胞分装后以90% FBS、10% DMSO冻存，以备后续使用。</li>
</ol>
2. 诱导基因敲低与转染
<ol>
 <li>在10 cm培养皿中，将细胞接种于选择性培养基中。向其中一半培养皿加入浓度为1 μg/mL的多西环素，并在37°C、5% CO2条件下培养48–72小时（参见图4）。</li>
 <li>培养48–72小时后，用胰蛋白酶消化各组细胞，计数后将每组1.5×106个细胞接种至6 cm培养皿中，培养基成分相同，根据需要加入或多西环素。在37°C、5% CO2条件下过夜培养。实验设计时应确保第2.1步中的每组培养皿可为12个6 cm培养皿提供细胞，包括每个时间点DAPI检测的两个重复样本，以及每个样本用于Western blot分析的一个培养皿（参见图4）。</li>
 <li>次日，使用以下质粒组合对6 cm培养皿中的细胞进行转染：1 μg空质粒或编码E4orf4的等量质粒，联合4 μg表达Acf1-GFP或SNF2h-GFP的载体（该载体通过引入同义突变使其对细胞克隆中的shRNA产生抗性），或3 μg相应的空载体与1 μg表达GFP的质粒（图4）。按照前述方法使用jetPIE试剂（每5 μg DNA使用10 μl）配制转染混合物。每个样本需为三个培养皿配制转染混合物。</li>
 <li>将DNA与jetPIE试剂在室温下孵育15分钟后，轻轻将每种转染混合物中的DNA复合物等量加入三个6 cm培养皿中，在37°C、5% CO2条件下过夜孵育。</li>
</ol>
3. 转染细胞中的 DAPI 检测
<ol>
 <li>第二天，从每个样本的一块培养板中提取蛋白质，进行 Western 印迹分析，以确认 Acf1 或 SNF2h 已被有效敲低，并且不同样本中 E4orf4 的表达水平相等。</li>
 <li>吸除用于 DAPI 染色实验的培养板中的培养基，用 PBS 轻柔洗涤一次，然后加入 1 ml 用 PBS 配制的 4% 多聚甲醛溶液覆盖细胞。多聚甲醛溶液的配制及细胞处理操作均应在化学通风橱中进行。室温下静置孵育 15 分钟，不摇动。</li>
 <li>吸除多聚甲醛溶液，用 PBS 洗涤三次，每次在室温下轻轻摇动 5 分钟。加入预冷至 -20 °C 的 80% 乙醇，于 -20 °C 孵育至少 1 小时。只要密封良好以防止乙醇挥发和样本干燥，培养板可在 -20 °C 的乙醇中保存数天。</li>
 <li>吸除乙醇，用 PBS 洗涤细胞两次，再用 PBS-BT（含 0.5% BSA 和 0.05% Tween-20 的 PBS）洗涤一次，每次在室温下轻轻摇动 5 分钟。</li>
 <li>为防止非特异性抗体结合，将细胞在含 10% 山羊血清的 1 ml PBS-BT 缓冲液中室温摇动孵育 20 分钟进行封闭。随后用 PBS-BT 洗涤两次，每次 5 分钟。</li>
 <li>将细胞与一抗（本实验中为 E4orf4 特异性抗体）在 1 ml PBS-BT 中室温摇动孵育 1 小时。然后用 PBS-BT 洗涤两次，再用含 0.1% BSA 的 PBS 洗涤一次，每次 5 分钟。</li>
 <li>在避光条件下，将细胞与适当的荧光标记二抗及终浓度为 0.5 μg/ml 的 DAPI 溶于 1 ml PBS-0.1% BSA 中，室温摇动孵育 40 分钟。随后用 PBS 洗涤 5 分钟，吸净液体并倒置培养板 1 小时至过夜，确保完全干燥。然后使用 Fluoromount-G 封片剂将盖玻片封固于细胞上。将培养板置于 4 °C 避光保存，直至进行凋亡细胞核计数。</li>
 <li>请同事将各培养板重新编号，以便对不同样本中的凋亡细胞核进行盲法计数。</li>
 <li>在正置荧光显微镜下以 400X（空气镜）或 630X（油镜）放大倍数观察细胞。识别各样本中表达特定蛋白的转染细胞，并统计转染细胞群体中经 DAPI 染色显示的染色质凝聚或断裂的细胞核数量。观察多个视野，总计数不少于 200 个转染细胞。</li>
 <li>计算转染细胞群体中具有凋亡形态的细胞核所占百分比。重复实验 2–3 次，每次设复孔，以评估各组样本间差异的统计学显著性。</li>
</ol>
4. 代表性结果
获得成功实现基因表达条件性敲低的克隆的效率因所涉及的基因而异。在我们的实验中，针对Acf1检测了12个克隆，其中7个获得成功；针对SNF2h检测了18个克隆，其中6个获得成功。图2展示了筛选出的细胞克隆的代表性培养皿图像（图2A）以及单个克隆的图像（图2B）。图3展示了一张代表性蛋白印迹图，该图所用蛋白样品来自在有或无多西环素条件下培养72小时的不同克隆细胞。印迹膜使用抗SNF2h抗体和抗alpha-Tubulin抗体进行染色，后者作为上样对照。其中两个克隆（编号4和5）在多西环素诱导后表现出SNF2h蛋白水平的显著降低。需要注意的是，尽管用于构建细胞系的pSuperior.neo+GFP质粒（图1）编码一个neo-GFP融合蛋白，但在稳定细胞系中绿色荧光非常微弱，因此在这些细胞中瞬时转染的其他GFP融合蛋白的表达可明显高于背景荧光水平。
在细胞克隆中进行实验以检测Acf1或SNF2h敲低对E4orf4诱导的细胞死亡影响的示意图如图4所示。通过多西环素处理实现基因表达敲低所需的时间可能因目标蛋白的稳定性不同而有所差异。对于Acf1和SNF2h，需要72小时的处理才能在蛋白水平上实现有效的敲低。
图5 显示了表达 E4orf4 和 GFP 的细胞发生死亡的示例，其特征表现为 DAPI 染色的细胞核出现浓缩或碎裂的形态。图6 展示了一项代表性实验的结果，表明由多西环素诱导的 Acf1 沉默导致 E4orf4 诱导的细胞死亡增加（图6A）。这种增加并非由 E4orf4 水平升高所致（图6B）。此外，在多西环素诱导的细胞中恢复 Acf1 表达后，E4orf4 的毒性增加被减弱，恢复至未诱导细胞中观察到的水平（图6）。
<img alt="质粒载体图谱 pSUPERIOR neo+GFP；基因克隆位点；shRNA、H1 启动子、EGFP、Neo。" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1.jpg" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. pSuperior.neo+GFP 质粒的图谱。该图谱显示了由四环素诱导型 H1 启动子驱动的 shRNA 表达，以及由 PGK 启动子驱动的 neo-GFP 融合蛋白表达。该图谱改编自 OligoEngine 公司的 pSuperior 使用手册。
<img alt="琼脂平板上的细菌菌落生长及显微镜下的细胞培养。" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 新霉素抗性菌落的鉴定。 图中显示了含有菌落的平板（A）和单个菌落（B）的图像。这些菌落是通过在含新霉素的选择性培养基中培养细胞 14 天后获得的。
<img alt="Western blot 分析；SNF2h 蛋白表达；阿霉素处理；抗体检测方法。" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 所选克隆中基因敲低效率的检测。 在含有新霉素的培养基中筛选出的多个克隆细胞被接种至两个重复孔中。每个样本的一个孔用多西环素诱导（+），另一个孔不作处理（-）。诱导72小时后提取蛋白，并进行SDS-PAGE电泳分离。Western印迹依次使用抗SNF2h抗体和抗α-微管蛋白抗体（作为上样对照）进行染色，结果显示了诱导组与对照组细胞中SNF2h的表达水平。
<img alt="细胞培养流程；多西环素处理、转染、DAPI 检测、Western blot；流程示意图。" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图 4. 典型基因敲低-DAPI 检测实验的设计方案。图中展示了实验的连续步骤，包括使用多西环素处理以实现 Acf1 或 SNF2h 的基因敲低，转染以恢复 Acf1 或 SNF2h 的表达或引入空载体，并将 E4orf4 或相应的空载体导入细胞，以及对结果进行分析。经多西环素处理的培养板以红色标示（Dox），对照组培养板以蓝色标示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4442/4442fig4large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="荧光显微镜图像、细胞结构分析、多色染色、细胞分化。" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 使用 DAPI 检测 E4orf4 诱导的细胞死亡。 接受了 图 4 中所述各种处理的细胞被固定，并用 E4orf4 特异性抗体和 DAPI 染色，以显示转染细胞的细胞核。本图来自表达 E4orf4 和对照 GFP 蛋白的样本。（A）GFP。（B）E4orf4。（C）DAPI。（D）合并图像。白色箭头标记了表达 GFP 和 E4orf4 且细胞核呈现凋亡形态的转染细胞。红色箭头标记了形状不规则但不被计为凋亡细胞核的细胞核。星号标记了处于有丝分裂期或刚完成分裂的细胞核。
<img alt="评估 E4orf4 和 Dox 作用的核异常柱状图及蛋白质表达 Western 印迹。" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6. Acf1 沉默增强 E4orf4 诱导的细胞死亡。（A）使用四环素诱导型启动子表达 Acf1-shRNA 的 T-REx-293 衍生细胞系在添加多西环素（+Dox）或不添加（-Dox）的条件下进行诱导。三天后，细胞转染表达 E4orf4（+E4orf4）或空载体（-E4orf4）的质粒，同时共转染空载体或表达 GFP 标签 Acf1 的质粒；该 Acf1 因引入沉默突变而对 shRNA 具有抗性。转染 24 小时后固定细胞，并用 E4orf4 抗体和 DAPI 染色。通过上述 DAPI 检测法测量细胞死亡的诱导情况，并确定具有浓缩或断裂细胞核的转染细胞百分比。结果显示一个具三个重复的代表性实验，误差线代表标准差。（B）来自平行培养板的细胞被收集用于 Western 印迹分析。印迹膜使用 E4orf4、GFP 和 Acf1 抗体进行染色。内源性 Acf1 和 Acf1-GFP 在两个独立图面板中显示。

<ol><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+suppression+of+tumorigenicity+by+virus-mediated+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference.</a> Cancer. 2, 243-247 (2002).</li>
<li>Czauderna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+shRNA+expression+for+application+in+a+prostate+cancer+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model.</a> Nucleic acids research. 31, e127(2003).</li>
<li>Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditional+vectors+for+hairpin+siRNA+knockdowns%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns.</a> Nucleic acids research. 31, e77(2003).</li>
<li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+suppression+of+cellular+genes%3A+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> Journal of. 77, 8957-8961 (2003).</li>
<li>Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenovirus+E4orf4+protein+targets+PP2A+to+the+ACF+chromatin-remodeling+factor+and+induces+cell+death+through+regulation+of+SNF2h-containing+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes.</a> Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).</li>
<li>Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+by+adenovirus+E4orf4+protein+is+cell+line-specific+and+is+mediated+by+the+death+receptor+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway.</a> J. Virol. 75, 789-798 (2001).</li>
<li>Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+type+5+E4+open+reading+frame+4+protein+induces+apoptosis+in+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells.</a> J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).</li>
<li>Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+E4orf4+protein+interacts+with+both+Ba+and+B%27+subunits+of+protein+phosphatase+2A%2C+but+E4orf4-induced+apoptosis+is+mediated+only+by+the+interaction+with+Ba%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba.</a> Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).</li>
<li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).</li>
<li>Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E4orf4%2C+a+novel+adenovirus+death+factor+that+induces+p53-independent+apoptosis+by+a+pathway+that+is+not+inhibited+by+zVAD-fmk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk.</a> J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).</li>
<li>Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenovirus+E4orf4+protein+induces+growth+arrest+and+mitotic+catastrophe+in+H1299+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells.</a> Oncogene. 28, 390-400 (2009).</li>
<li>Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -C., Robert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+E4+open+reading+frame+4-induced+apoptosis+involves+dysregulation+of+Src+family+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases.</a> J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

特异性基因表达的敲低是研究某种蛋白质在调控通路中作用的重要方法。由于组成型敲低必需基因的表达会对细胞增殖产生负面影响，因此对这类基因的研究可能需要采用瞬时转染小干扰RNA（siRNA）或应用可诱导的稳定型敲低系统。本文所述的可建立具有药物诱导shRNA表达能力的稳定细胞系的方法，相较于瞬时转染（其在许多细胞系中转染效率较低）以及需反复制备病毒（有时还需额外短期筛选）的方法具有优势。一旦建立成功，这些细胞系无需进一步处理。此外，在我们的实验中，shRNA载体的瞬时转染在降低基因表达方面的效率明显低于在选定稳定细胞系中诱导shRNA表达的效果。然而，建议在每次实验中均需确认药物诱导的基因敲低效果仍然有效。使用稳定细胞系进行条件性基因敲低的一个潜在缺点是，细胞系在筛选过程中可能已获得其他遗传或表型改变，从而可能影响实验结果。为克服这一问题，可同时在两个平行的细胞系中进行实验，或通过引入表达shRNA抗性野生型（WT）蛋白的质粒来逆转敲低效应。若野生型蛋白能够消除shRNA的作用，则可排除克隆特异性效应的影响。
 经典的、依赖半胱天冬酶（caspase）的细胞凋亡可通过多种方法检测，包括检...

<table><tbody><tr><td>高糖DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965</td><td></td></tr><tr><td>Tet系统认证胎牛血清（FBS）</td><td>Clontech</td><td>631106</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen Strep）</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>T-REx-293细胞</td><td>Invitrogen</td><td>R710-07</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素（blasticidin）</td><td>Invitrogen</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>pSuperior.neo+GFP质粒</td><td>OligoEngine</td><td>VEC-PBS-0007/0008</td><td></td></tr><tr><td>jetPIE</td><td>Polyplus transfection</td><td>101-40</td><td></td></tr><tr><td>强力霉素（doxycycline）</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（paraformaldehyde）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr></tbody></table>

为条件性敲低基因表达及检测其对e4orf4诱导细胞死亡的影响制备细胞系

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

在哺乳动物细胞中实现基因表达的功能性失活，对于研究目的蛋白在各种信号通路中的作用至关重要1,2。然而，在某些情况下，若细胞长期无法耐受组成型基因表达下调，则需要采用条件性基因敲低策略3-5。本文描述了一种构建细胞系的实验方案，该细胞系可实现ACF染色质重塑因子亚基的条件性敲低。这些细胞系有助于确定ACF在腺病毒E4orf4蛋白诱导细胞死亡过程中的作用6。我们将编码针对ACF染色质重塑因子Acf1和SNF2h亚基的短发夹RNA（shRNA）序列克隆至一个含有强力霉素诱导型启动子的质粒中，该质粒同时还携带新霉素抗性基因。在G418存在条件下筛选并分离出具有新霉素抗性的细胞克隆。通过添加强力霉素诱导后，当Acf1或SNF2h的表达水平降低时，将编码E4orf4的质粒或空载体转染至细胞中。为验证shRNA构建体的特异性效应，通过共转染表达Acf1或SNF2h的质粒来恢复其蛋白水平至野生型（WT）水平，这些表达质粒通过引入同义突变而对shRNA产生抗性。通过DAPI染色实验检测E4orf4在不同样本中诱导细胞死亡的能力，该实验通过测定转染细胞群体中呈现凋亡形态细胞核的出现频率来进行评估7-9。
本方案可用于确定各种蛋白质在其组成型敲低可能导致细胞死亡的情况下，与其蛋白伴侣共同诱导细胞死亡过程中的功能贡献。

检测了ACF染色质重塑因子在E4orf4诱导的细胞死亡中的作用。该实验方案包括筛选在强力霉素处理下可诱导性敲低ACF亚基Acf1和SNF2h的细胞克隆，并利用DAPI染色法测定在可诱导细胞系中E4orf4诱导的细胞死亡。

为条件性敲低基因表达及检测其对E4orf4诱导细胞死亡的影响制备细胞系

在哺乳动物细胞中实现基因表达的功能性失活，对于研究目的蛋白在多种生物学过程中的作用至关重要……

以下实验的总体目标是观察ACF1或SNF2H基因敲低对E4orf4诱导的细胞死亡的影响。该目标通过构建细胞系来实现：在这些细胞系中，通过添加多西环素条件性激活ACF1或SNF2H的shRNA表达，从而导致ACF1或SNF2H蛋白水平降低；第二步，对已获得的细胞系进行处理，一部分用多西环素处理以降低ACF1或SNF2H的表达，另一部分则不作处理。为了研究ACF1或SNF2H对E4OR4诱导的细胞死亡的影响，在表达或不表达S-H-R-N-A抗性ACF1或SNF2H的细胞中检测了E4OR4的表达。通过JY检测法计数具有凋亡形态的细胞核，获得的结果显示了ACF1或SNF2H水平对E4OR4毒性的效应。该技术相较于其他方法（如RNA的瞬时转染）的主要优势在于，所有细胞均表达S-H-R-N-A，且与传统质粒共表达的细胞比例更高。该方法不仅有助于揭示E4OR4诱导细胞死亡的潜在机制，还可应用于其他促凋亡蛋白的研究。除了Ana Lafe之外，我实验室的另一位研究人员也将演示该实验的部分操作步骤。首先，为建立可诱导的细胞系，将T-Rex 293细胞以约每10厘米培养皿5×10⁶个细胞的密度接种于8 mL含有血清的DMEM培养基中，培养基中不得含有四环素，并添加5 µg/mL的blaster aside。将培养皿置于37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。次日，在转染前更换为8 mL新鲜培养基。用于转染的质粒为P-superior-neo-plus-GFP质粒，该质粒编码ACF1或SNF2H-S-H-R-N-A，其表达由四环素可诱导的H1启动子驱动；同时包含新霉素抗性基因与GFP的融合基因，该融合基因由组成型PGK启动子驱动表达。将10微克质粒DNA加入500微升150毫摩尔氯化钠溶液中，涡旋混匀。然后将jet PY试剂按每微克DNA加2微升的比例加入另一含有500微升150毫摩尔氯化钠溶液的离心管中，涡旋混匀。将jet PIE溶液加入DNA中，通过涡旋充分混匀。室温孵育15分钟。15分钟后，将DNA复合物轻轻加入含有70%至80%融合度的10厘米培养皿中。次日混合T-Rex 293细胞。在此示例中，将培养基更换为含有每毫升 500 微克 G four 18 的 DMEM 选择性培养基，方法同前。接下来两周内持续观察细胞，并每三至四天更换一次新鲜的选择性培养基，直至出现细胞克隆。 用肉眼识别菌落，并使用彩色标记笔在培养皿底部标记其位置。在显微镜下确认菌落是否充分分离。当菌落生长至无需显微镜即可观察到的大小时，即可进行分离。为了确保该实验步骤的成功，在菌落分离过程中应选择分离良好的单个菌落。在无菌操作台中，吸除培养皿中的培养基，用 PBS 轻轻冲洗，并彻底吸净所有残留液体。用移液枪反复吹打，向平板上的一个菌落加入3 µL含EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液，直至细胞从平板上脱落。将细胞转移至24孔板中一个孔内的筛选培养基中。对平板上的其他多个菌落重复此操作。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，直至细胞铺满孔板。随后将每个原始克隆的细胞分别传代至另一块12孔板中的三个孔中，并于次日继续培养过夜。向其中一块孔板的培养基中更换为含有1微克/毫升多西环素的培养基，该多西环素母液使用双蒸水配制。将对照组培养板中的培养基更换为不含多西环素的培养基。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育72小时。随后收集一个经处理和一个未经处理孔中的细胞，进行蛋白质印迹分析，以确定ACF1或SNF2H基因敲低的效率，此处展示的是一个代表性结果。该蛋白印迹使用 SNF2H 和 α-tubulin 的抗体进行染色，后者作为两个克隆的上样对照。克隆编号 4 和编号 5 在多西环素诱导后显示出 SNF2H 的显著降低，因此被选用于后续的基因敲低实验，该实验将在下一段中展示。第三块培养板中的未处理细胞将用于扩增筛选出的细胞系，随后将这些细胞分装并冻存。为后续诱导ACF或SNF的基因敲低，需在10厘米培养板中使用选择性培养基培养H板细胞，并向其中一半的培养板加入浓度为每毫升1微克的多西环素，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育48至72小时。每组培养板需提供足够细胞用于12个6厘米培养板，其中每个时间点需设置两个重复用于DPI检测，另需各一个培养板用于每个样本的蛋白质印迹分析。诱导后48至72小时，用胰蛋白酶消化各组细胞，计数后，将1.5×10⁶个细胞接种至每孔6厘米的培养皿中，培养基相同，根据需要加入或不加入多西环素。将细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。次日，按指示转染细胞。未处理和多西环素处理的细胞均以四种方式设置三个重复进行转染：第一种为转入空质粒以及表达GFP的质粒；第二种为空质粒与表达SHRA抗性ACF1-GFP或SNF2H-GFP的载体；第三种为转入编码E4的质粒以及表达GFP的质粒；第四种为转入编码E4（全部四种）的质粒与表达SHRA抗性ACF1-GFP或SNF2H-GFP的载体。转染后，将所有培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下培养过夜。在转染细胞后的次日，从每个样本的一个培养皿中提取蛋白质，用于 Western blot 分析，以确定 ACF1 或 SNF2H 是否被有效敲低，以及 E4F4 在不同样本中是否表达量相等。剩余的 16 个培养皿将用于 DPI 检测。在通风橱中，吸去用于 DPI 检测的培养皿中的培养基，并用 PBS 轻柔地清洗细胞。加入1 mL用PBS配制的4%多聚甲醛溶液覆盖细胞，在室温下静置固定15分钟，期间不摇动。吸除多聚甲醛溶液，用PBS在室温下振荡洗涤5分钟。重复洗涤两次，共洗涤三次。第三次PBS洗涤后，加入80%乙醇（置于-20°C保存），于-20°C孵育至少1小时。吸去乙醇，用 PBS 在室温下振荡洗涤细胞两次，每次 5 分钟；随后用含有 0.5% BSA 和 0.05% Tween 20（即 P-B-S-B-T）的 PBS 在室温下振荡洗涤一次，每次 5 分钟。振荡以防止非特异性抗体结合。在 1 毫升含有 10% 小牛血清的 P-B-S-B-T 缓冲液中，室温振荡封闭细胞 20 分钟。然后用 PBS-T 缓冲液洗涤细胞两次，每次洗涤 5 分钟。将细胞与一抗（本实验中为 E4/4 特异性抗体）在 1 毫升 PBS-T 缓冲液中孵育 1 小时，室温下轻轻振荡。随后用 PBS-T 缓冲液洗涤两次，再用含 0.1% BSA 的 PBS 洗涤一次，每次洗涤 5 分钟。接着，向细胞中加入一毫升含适当荧光标记的二抗和0.5微克/毫升BSA的PBS缓冲液（0.1% BSA），DPI的终浓度为孵育40分钟，期间在室温下避光振荡。最后，用PBS洗涤五分钟。通过抽吸使孔干燥，并将培养板倒置放置额外一小时至过夜，以实现完全干燥，然后用铝箔覆盖，并使用Flora Mount G溶液在细胞上加盖盖玻片。将培养板置于4摄氏度避光保存，直至准备计数。根据本方案中描述的不同处理条件，发生凋亡的细胞核经固定后，使用E4或4特异性抗体及DPI染色，以观察转染细胞的细胞核。该图展示了表达 E four 或 four 与 GFP 的细胞示例。图 A 显示仅表达对照 GFP 蛋白的情况，图 B 显示 E four 或 four 的表达情况。图 C 显示 DAPI 染色的细胞核，图 D 显示合并图像。白色箭头标记了转染了 GFP 和 E.four 或 four 且细胞核呈现凋亡形态的细胞。红色箭头标记了形状不规则、未被计为凋亡细胞核的细胞核，星号标记了处于有丝分裂阶段或刚刚完成分裂的细胞核。通过 DAPI 染色观察到的浓缩或碎裂细胞核数量被统计，用于计算转染细胞群体中具有凋亡形态的细胞核百分比，以确保实验结果的最佳客观性。对各样本中凋亡细胞核的计数采用盲法进行，即计数人员不知晓样本的身份信息。本图显示了一个代表性结果。在表达 E4/4 的细胞中观察到更高比例的核异常，证实 E4/4 可诱导细胞死亡。在 E4/4 表达细胞中，当通过 SHRNA 介导的沉默使 ACF1 水平降低时，核异常的比例最高，表明 ACF1 沉默增强了 E4/4 诱导的细胞死亡，即增强了 E4/4 在细胞中的毒性作用。ACF 表达水平较低并非由 Western 印迹中观察到的 E 四或四水平升高所致。在执行该操作时，重要的是要记住使用 DPI 辅助对凋亡细胞核进行准确计数，并对识别此类细胞核应用严格标准。除本操作外，还可进行克隆形成实验等其他方法，以验证该 DA pse 操作后的结果。还可以进行其他方法，如共免疫沉淀实验，以回答更多问题。例如，所研究的蛋白质之间是否存在物理相互作用。

preparation-cell-lines-for-conditional-knockdown-gene-expression

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

E4orf4诱导的细胞死亡的击倒效果的基因表达和测量条件击倒细胞系的制备

本实验方案介绍了一种快速简便的工作流程，用于将siRNA导入难转染的细胞系，并通过实时PCR检测基因表达。使用自动细胞计数仪、多孔电穿孔板和自动电泳工作站，无需昂贵的机器人操作设备，即可获得快速且可靠的结果。...

使用自动细胞计数器简化基因表达研究：通过siRNA敲低Namalwa细胞中IL-4依赖性基因表达

在此，我们使用人类esiRNA文库进行高通量筛选，以鉴定参与细胞分裂的基因。我们将演示如何设置和开展esiRNA筛选实验，以及如何分析和验证筛选结果。...

用于哺乳动物细胞RNAi筛选的MISSION esiRNA

本文描述了一种从造血干细胞/祖细胞体外生成成熟人红细胞的 ex vivo 实验方案。此外，我们还介绍了一种高效的慢病毒递送方法，用于在原代红系细胞中敲低转录因子 TAL1。通过表达 GFP...

慢病毒介导的基因敲低过程 离体 人类造血干细胞的红细胞生成

我们描述了一种荧光报告基因检测方法，可用于快速鉴定和表征调控小鼠胚胎干细胞维持与自我更新的基因。...

Oct4GiP 报告基因检测法用于研究调控小鼠胚胎干细胞维持与自我更新的基因

一种快速、简便的方法，可生成具有可诱导且可逆的cDNA过表达或shRNA介导的目标基因敲低的人源细胞系。该方法使研究人员能够可靠且高度可重复地操控那些难以通过瞬时转染方法或传统敲低/敲除策略进行改造的细胞系。...

建立可稳定表达四环素诱导型（Tet-on）shRNA或cDNA的人源细胞系

本方案旨在介绍如何在癌细胞系中建立功能性Tet-ON系统，并进一步应用该系统，特别是用于研究肿瘤细胞来源的蛋白质在单核细胞/巨噬细胞向肿瘤微环境募集过程中的作用。...

在癌细胞系中条件性敲低基因表达以研究单核细胞/巨噬细胞向肿瘤微环境的募集

这是一种省时且经济高效的方法 体外...

寻找靶向治疗获得性耐药的驱动通路：通过基因敲降产生耐药亚克隆并恢复药物敏感性

建立稳定过表达目的基因的细胞系以研究基因功能，可通过稳定转染法实现，即在转染后筛选单克隆细胞。 通过...

建立过表达DR3的细胞系以评估对有丝分裂抑制治疗的凋亡反应

本文介绍了一种在活细胞中检测eIF4E与eIF4G相互作用的实验方案，该方法可用于在筛选条件下评估药物对eIF4F复合物动态的干扰作用。...

通过活细胞中eIF4E-eIF4G相互作用的检测来监测eIF4F复合物的组装

本文提供了一种利用慢病毒介导的shRNA转导技术，通过建立稳定的基因敲低细胞系，筛选参与树突状细胞（DC）发育的潜在转录因子的实验方案。 体外...

通过短发夹RNA介导的基因敲低在造血干细胞和祖细胞系中研究树突状细胞发育 体外

了解利用四环素诱导shRNA表达系统制备ACF1或SNF2h条件性敲低哺乳动物细胞系的方法，并评估ACF亚基缺失对腺病毒E4orf4诱导细胞死亡的影响。该方案为研究染色质重塑因子在细胞凋亡通路中的功能提供了可靠工具。

为条件性敲低基因表达及检测其对E4orf4诱导细胞死亡的影响制备细胞系

探索更多视频