E4orf4诱导的细胞死亡的击倒效果的基因表达和测量条件击倒细胞系的制备

以下实验的总体目标是观察 ACF 1 或 SNF 2 H 敲低对 E 4 或 4 诱导细胞死亡的影响。这是通过生成细胞系来实现的，其中 ACF 1 或 SNF 2 H srna 表达通过添加多西环素有条件地激活，导致 ACF 1 或 SNF 2 H 蛋白水平降低，这是第二步。已获得的细胞系的细胞用多西环素处理以减少 ACF 1 或 SNF 2 H 表达或不处理。

接下来，在具有或不具有 S-H-R-N-A 耐药的细胞中表达 E 4 或 4 个 ACF 1 或 SNF 2 H.In 为了研究 ACF 1 或 SNF 2 H 对 E 4 或 4 诱导细胞死亡的影响，获得显示 ACF 1 或 SNF 2 H 水平对 E 4 或 4 毒性的影响，基于使用 JY 测定法对具有凋亡形态的细胞核的计数。与其他方法（如 RNA 瞬时转染）相比，该技术的主要优点是所有细胞都表达 S-H-R-N-A，并且与传统质粒共表达的细胞百分比更高。这种方法提供了对 4 0 4 诱导细胞死亡的潜在机制的见解，但它也可以应用于其他质子蛋白的研究。

除了 Ana Lafe 之外，我实验室的一名研究人员还将演示此程序的部分内容 为了开始生成诱导细胞系的程序，以大约 5 倍 10 的密度将 T-Rex 2 9 3 细胞板接种到每 10 厘米板 6 个细胞中，在 8 毫升含有不含四环素的血清的 DMEM 中，并留出 5 微克毫升的冲击波，在 37 摄氏度下孵育板过夜，然后第二天 5% 二氧化碳。转染前，用 8 mL 新鲜培养基替换培养基。用于转染的质粒是编码 ACF 1 或 SNF 2 H-S-H-R-N-A 的 P 优势新加 GFP 质粒，由四环素诱导型 H 1 启动子驱动，以及新霉素抗性基因融合 GFP 并由组成型 PGK 启动子驱动。

将 10 μg 质粒 DNA 添加到 500 μL 150 毫摩尔氯化钠中并涡旋。然后，将喷射 PY 试剂以每微克 DNA 2 微升的浓度加入另一根装有 500 微升 150 毫摩尔氯化钠的试管中，然后涡旋。将喷射派溶液添加到 DNA 中，涡旋混合均匀。

在室温下孵育 15 分钟。15 分钟后，轻轻移液将 DNA 复合物移液到含有 70% 至 80% 汇合度的 10 cm 平板上。T-Rex 2 9 3 细胞，第二天混合。

以前一样，在本例中为选择性培养基 DMEM 替换培养基，每毫升含有 500 微克 G four 18。在接下来的两周内，监测细胞。每 3 到 4 天用类似的新鲜培养基更换一次选择性培养基，直到出现菌落。

用眼睛识别菌落，并使用彩色标记在板底部标记它们的位置。在显微镜下验证菌落是否分离良好。一旦菌落大到无需显微镜即可观察，就可以分离菌落。

为了该程序的成功，在克隆分离过程中选择分离良好的克隆非常重要。在无菌罩中，从板中吸出培养基。用 PBS 轻轻冲洗并充分吸出所有剩余液体。

将 3 微升 0.25% 的 EDTA 中加入到板上的一个菌落中，反复抚摸，直到细胞从板中分离。将细胞转移至 24 孔板中孔中的选择性培养基中。对板上的其他几个菌落重复此作。

在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下培养细胞，直到它们充满孔。然后将每个原始集落的细胞分成三个孔，每个孔在一个单独的 12 孔板中，并在第二天孵育过夜。将一个板中的培养基替换为含有 1 μg/mL 多西环素的培养基，该培养基来自在双蒸水中制备的储备溶液。

用不含多西环素的培养基替换对照板中的培养基。将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育 72 小时。然后收获来自一个处理孔和一个未处理孔的细胞用于蛋白质印迹分析，以确定敲低 ACF one 或 SNF two H 的效率，此处显示了代表性结果。

该印迹用 SNF 2 H 和 α 微管蛋白抗体染色。后者作为两个克隆的加载对照。4 号和 5 号显示多西环素诱导后 SNF 2 H 强烈降低，因此选择用于敲低实验，这将在下一部分进行演示。

第三个板中未处理的细胞将用于扩增选定的细胞系，这些细胞的等分试样随后将被冷冻。为了进一步用于在 10 厘米板中的选择性培养基中诱导 ACF 1 或 SNF 2 H 板细胞的敲低，将 1 μg/mL 的多西环素添加到一半的板中，并在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育 48 至 72 小时。每组板必须提供 12 个 6 厘米板的细胞，包括每个点的两个 DPI 检测板，以及每个样品的蛋白质印迹分析的一个板。

诱导后 48 至 72 小时，胰蛋白酶闻每组细胞的细胞，计数后，将 1.5 倍 10 至 6 个细胞接种在同一培养基中，含或不含多西环素。第二天在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育细胞过夜，转染细胞。如图所示。

未处理和多西环素处理的细胞都以四种方式一式三份转染。一个带有一个空质粒和一个表达 GFP 的质粒，两个带有空质粒，以及一个表达 SHRA 抗性 ACF 的载体，一个 GFP 或 SNF 2，HGFP 三个，一个编码 E 4 或 4 的质粒和一个表达 GFP 的质粒，一个编码 E 4 的质粒，所有四个。转染后，表达 SHRA 抗性 ACF one GFP 或 SNF two HGFP 的载体将所有板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。

在细胞转染后的第二天，从每个样品的一个板中提取蛋白质进行蛋白质免疫印迹分析，以确定 ACF one 或 SNF two H 已被有效敲低，并且 E 4 或 4 在不同样品中表达相同。其余 16 块板将用于 DPI 测定。从用于 DPI 测定的板中吸出培养基，并在化学罩中用 PBS 轻轻洗涤细胞。

加入 1 毫升在 PBS 中制备的 4% 对位甲醛，覆盖细胞，在室温下孵育 15 分钟，不要摇晃。吸出对位甲醛，并在室温下用 PBS 振荡洗涤 5 分钟。在第三次 PBS 洗涤后，以 80% 乙醇保持在零下 20 摄氏度，并在零下 20 摄氏度下孵育至少一小时，再重复洗涤两次，总共洗涤三次。

吸出乙醇，用 PBS 洗涤细胞两次，在室温下振荡 5 分钟，每次，然后在室温下用含有 0.5% BSA 和 0.05% 的 PBS（介于 20 之间）或 P-B-S-B-T 洗涤一次，每次 5 分钟。也可通过摇动来防止非特异性抗体结合。在含有 10% 山羊血清的 1 毫升 P-B-S-B-T 缓冲液中封闭细胞 20 分钟，同时在室温下摇动。

然后在 P-B-S-B-T 中洗涤细胞两次，每次洗涤 5 分钟。将细胞与一抗（在本例中为 E 四或四特异性抗体）在 1 毫升 P-B-S-B-T 中孵育 1 小时，同时在室温下摇动。然后在 P-B-S-B-T 中洗涤两次，在含有 0.1% BSA 的 PBS 中洗涤一次，每次洗涤 5 分钟。

接下来，向细胞中加入 1 毫升 PBS 0.1%BSA，其中包含适当的二级荧光标记抗体和每毫升 0.5 微克。最终浓度的 DPI 在室温下避光振荡孵育 40 分钟。最后，用 PBS 洗涤 5 分钟。

通过抽吸干燥孔，并将板倒置一小时至过夜，以实现完全干燥，并使用 flora Mount G 解决方案在细胞上盖上铝箔安装盖玻片。将盘子在黑暗中保持在 4 摄氏度，直到准备好计数。固定经过方案中描述的各种处理的凋亡细胞核细胞，并用 E 4 或 4 特异性抗体和 DPI 染色，以观察转染细胞的细胞核。

该图显示了表达 E 4 或 4 的细胞示例，GFP 图 A 显示单独对照 GFP 蛋白表达，图 B 显示 E 4 或 4 表达 DAPI 染色细胞核显示在图 C 中，合并图像显示在图 D 中，白色箭头标记 GFP 和 E.四个或四个转染细胞含有具有凋亡形态的细胞核。红色箭头标记形状不规则的细胞核，这些细胞核不算作凋亡细胞核，星号标记有丝分裂细胞核或仅划分 DAPI 可视化的浓缩或碎裂细胞核数量的细胞核。计数染色以计算转染细胞群中具有凋亡形态的细胞核的百分比，以保持测试的最佳客观性。

各种样品中凋亡核的计数以盲法进行，其中计数人不知道样品身份 该图显示了一个代表性的结果。在 E 4 或 4 表达细胞中观察到较高百分比的核异常，证实 T 4 或 4 诱导细胞死亡。在 E 4 或 4 表达细胞中观察到细胞核异常的百分比最高，其中 ACF 1 水平因 SHR 和介导的敲低而降低，表明 ACF 1 敲除增强了 E 4 或 4 Inge 细胞死亡增强了 E 4 或 4 在细胞中的毒性。

表达低水平的 ACF one 并不是由于 E 增加 4 或 4 水平引起的，如 Western blot 中所见。在执行此程序时，重要的是要记住便于使用 DPI 对凋亡核支架进行建议计数，并应用严格的标准来识别该核。除了此程序外，还可以执行其他方法，例如克隆基因测定，以验证 DA pse 的结果遵循此程序。

可以进行其他方法，如免疫共沉淀测定，以回答其他问题。例如，所研究的蛋白质之间是否存在物理相互作用。