Name: 复制叉停滞了迎头RNA聚合酶直接重新启动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 了解复制体与RNA聚合酶迎头碰撞后的命运，观察复制叉停滞及Mfd介导的复制重启机制。该方法利用生物素化DNA和磁性珠固定技术，帮助研究人员深入理解DNA复制与转录的相互作用。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们特别感谢 Seth Darst 提供了RNAP和Mfd蛋白及表达载体。我们还要感谢 Sergei Borukhov 提供 GreB 以及 Dan Zhang 提供的技术支持。本工作由美国国立卫生研究院资助（M.O.D.），并由洛克菲勒大学 Marie-Josee 和 Henry Kravis 奖学金资助（R.T.P.）。

该方法已在 <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content-nw/full/327/5965/590/F3">Pomerantz 和 O'Donnell，《科学》327卷，590-592页（2010年）</a> 报道的研究中使用。
1. RNA聚合酶停滞延伸复合物的组装操作步骤如下：
将终浓度为 500 nM 的 E. coli RNAP σ70 HE 与终浓度为 5 nM 的含有 T7A1 启动子的生物素标记 3.6 kb DNA 模板在 100 μl 缓冲液 A（20 mM Tris-Cl (pH 7.5)、8 mM MgCl2、0.5 mM EDTA、5 mM DTT、10% 甘油）中混合，于 37 °C 孵育 10 分钟。随后加入 100 μM ApU 以及各 40 μM 的 GTP、ATP 和 CTP，继续在 37 °C 反应 10 分钟。
2. 将停滞的RNAP延伸复合物固定到链霉亲和素磁珠上的步骤如下：
向上述反应中加入 200 μl 链霉亲和素磁珠（Invitrogen），室温孵育 10 分钟。
3. 固定化的停滞RNAP延伸复合物的纯化步骤如下：
将上述珠子用含有0.75 M NaCl、200 μg/ml 肝素和20 μg/ml 单链DNA的0.9 ml缓冲液A洗涤5次（每次洗涤后通过磁分离去除上清液）。随后，珠子用0.9 ml缓冲液A再洗涤2次。
4. 相对于迎面而来的RNAP，在其下游形成复制叉的操作步骤如下：
将上述珠子重悬于100 μl New England Biolabs buffer 4中，并加入10单位的Sap I（New England Biolabs），在37 °C下孵育10分钟。珠子用0.9 ml缓冲液A洗涤3次，然后重悬于50 μl Quick T4连接反应缓冲液（New England Biolabs）中。加入2 μl Quick T4连接酶（New England Biolabs）以及终浓度为6 nM的预退火叉状DNA（RP10、RP22、RP25），在室温下反应10分钟。珠子再用0.9 ml缓冲液A洗涤3次。
5. 复制叉处复制体的组装及前导链合成的起始按如下步骤进行：
将448 pmol的DnaB（以六聚体形式）与150 μl缓冲液A（20 mM Tris-Cl（pH 7.5）、8 mM MgCl2、0.5 mM EDTA、5 mM DTT、10%甘油）在23 °C下孵育30秒。随后加入4.9 pmol的Pol III*（不含β亚基的Pol III全酶）、15 pmol的β亚基、2 mM ATP以及每种60 μM的dGTP和dATP，总体积达200 μl，并在37 °C下继续孵育5分钟。通过加入10 μg SSB、每种24 μM的dATP和dTTP，以及[α-32P]dTTP和[α-32P]dCTP（比活性为3,000–5,000 cpm/pmol），启动复制反应，终体积为250 μL。反应10分钟后，加入12 μl 500 mM EDTA终止反应。
6. 放射性标记DNA产物的纯化与浓缩操作步骤如下：
反应终止后，将磁珠（来自上述步骤）煮沸，以去除与磁珠结合的DNA。任何仍残留在磁珠上的DNA通过加入10 µl蛋白酶K溶液、在50 °C下孵育30分钟进行去除。随后将磁珠煮沸，并通过磁力分离移除上清液。合并含有DNA的上清液，使用Qiagen PCR纯化试剂盒进行纯化。纯化后的放射性标记DNA产物随后在碱性琼脂糖凝胶中进行分析。
*在无对向RNAP停滞延伸复合物的情况下进行复制时，操作步骤同上，但省略σ70。
代表性结果：
复制体与迎面而来的RNA聚合酶（RNAP）发生碰撞时，通常会产生两条长度分别为2.5 kb和3.6 kb的产物。其中2.5 kb的产物代表从复制叉到停滞的RNAP之间的DNA长度，这是复制体在与RNAP碰撞后停滞所致。3.6 kb的产物代表全长DNA，其产生原因可能是RNAP对启动子的占据不完全，或复制体部分穿越了迎面而来的RNAP。理想或准确的实验结果应显示约有50%的全长DNA生成。然而，在某些情况下，RNAP对启动子的占据程度较低，导致更高比例的全长DNA被观察到，因为更多的复制体未遇到迎面而来的RNAP。在没有停滞RNAP存在的情况下进行复制，则仅产生全长DNA（3.6 kb）。
<img src="/files/ftp_upload/1919/1919fig1.jpg" alt="DNA复制过程；包含RNAP阻断、复制体停滞、全长DNA复制的示意图。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图1"> 图1 复制体被迎面而来的RNAP阻碍。 (A) 实验设置。E. coli RNAP停滞的延伸复合物在含有T7A1启动子的生物素标记DNA上组装，方法如前所述（9）。简言之，通过将RNAP全酶与生物素标记的DNA孵育10分钟，随后加入ApU、GTP、ATP和CTP再孵育10分钟，在启动子下游20个碱基对处形成停滞的延伸复合物。然后加入链霉亲和素珠孵育额外10分钟，再用含有0.75 M NaCl、200 mg/ml肝素和100 nM单链DNA的缓冲液各0.9 ml洗涤珠子五次，以去除不稳定的RNAP-DNA复合物和过量的NTP。随后用SapI酶切DNA，洗涤后连接预先退火的分叉DNA。在组装复制体之前再次洗涤珠子。启动子位于分叉点上游2.5 kb处，其方向可引导转录朝向复制分叉进行。(B) 加入DnaB后组装复制体，并在存在（泳道2）或不存在（泳道1）迎面而来的RNAP的情况下启动复制。

<ol><li>Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+and+resolving+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription.</a> DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).</li>
<li>Vilette, D., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-induced+deletions+in+plasmid+vectors%3A+M13+DNA+replication+as+a+source+of+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability.</a> Mol Gen Genet. 252, 398-398 (1996).</li>
<li>Trautinger, B. W., Jaktaji, R. P., Rusakova, E., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+modulators+and+DNA+repair+activities+resolve+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase modulators and DNA repair activities resolve conflicts between DNA replication and transcription.</a> Mol Cell. 19, 247-247 (2005).</li>
<li>McGlynn, P., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+RNA+Polymerase+by+%28p%29ppGpp+Reveals+a+RecG-Dependent+Mechanism+for+Replication+Fork+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of RNA Polymerase by (p)ppGpp Reveals a RecG-Dependent Mechanism for Replication Fork Progression.</a> Cell. 101, 35-35 (2000).</li>
<li>McGlynn, P., Guy, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+forks+blocked+by+protein-DNA+complexes+have+limited+stability+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro.</a> J Mol Biol. 381, 249-249 (2008).</li>
<li>Labib, K., Hodgson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+barriers%3A+pausing+for+a+break+or+stalling+for+time%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Replication fork barriers: pausing for a break or stalling for time.</a> EMBO Rep. 8, 346-346 (2007).</li>
<li>Bidnenko, V., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+collapse+at+replication+terminator+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Replication fork collapse at replication terminator sequences.</a> Embo J. 21, 3898-3898 (2002).</li>
<li>Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+mechanics%3A+insights+into+a+twin+DNA+polymerase+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replisome mechanics: insights into a twin DNA polymerase machine.</a> Trends Microbiol. 15, 156-156 (2007).</li>
<li>Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+replisome+uses+mRNA+as+a+primer+after+colliding+with+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The replisome uses mRNA as a primer after colliding with RNA polymerase.</a> Nature. 456, 762-762 (2008).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-557 (2006).</li>
<li>Yuzhakov, A., Turner, J., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Cell. 86, 557-557 (1996).</li>
<li>Hinkle, D. C., Ring, J., Chamberlin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+assembly+reveals+the+basis+for+asymmetric+function+in+leading+and+lagging+strand+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replisome assembly reveals the basis for asymmetric function in leading and lagging strand replication.</a> J Mol Biol. 70, 197-197 (1972).</li>
<li>Kaplan, D. L., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+binding+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+to+DNA.+V.+T7+RNA+chain+initiation+by+enzyme-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. V. T7 RNA chain initiation by enzyme-DNA complexes.</a> Mol Cell. 15, 453-453 (2004).</li>
<li>Park, J. S., Marr, M. T., Roberts, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twin+DNA+pumps+of+a+hexameric+helicase+provide+power+to+simultaneously+melt+two+duplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twin DNA pumps of a hexameric helicase provide power to simultaneously melt two duplexes.</a> Cell. 109, 757-757 (2002).</li>
<li>Hanawalt, P. C., Spivak, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+Transcription+repair+coupling+factor+%28Mfd+protein%29+rescues+arrested+complexes+by+promoting+forward+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">coli Transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 958-958 (2008).</li>
<li>Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+DNA+repair%3A+two+decades+of+progress+and+surprises%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises.</a> Science. 266, 1957-1957 (1994).</li>
<li>Selby, C. P., Sancar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+repair+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled repair and human disease.</a> J Biol Chem. 270, 4882-4882 (1995).</li>
<li>Liu, B., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+transcription-repair+coupling+factor.+I.+Structural+domains+and+binding+properties.+Head-on+collision+between+a+DNA+replication+apparatus+and+RNA+polymerase+transcription+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of transcription-repair coupling factor. I. Structural domains and binding properties. Head-on collision between a DNA replication apparatus and RNA polymerase transcription complex.</a> Science. 267, 1131-1131 (1995).</li>
<li>George, D. L., Witkin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+excision+repair+in+an+mfd+mutant+of+Escherichia+coli+B%2Fr%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r.</a> Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).</li>
</ol>

用高盐溶液洗涤结合在磁珠上的停滞延伸复合物至关重要，目的是去除任何不稳定或非特异性结合的RNA聚合酶（RNAP）分子。RNA聚合酶对引物-模板型DNA结构具有极高的亲和力，因此必须去除这类非特异性的RNAP-DNA复合物，才能实现从引物-模板起始的复制。使用Qiagen PCR纯化试剂盒浓缩放射性标记的DNA产物也十分关键，以获得足够强的放射性信号，从而在凝胶中清晰观察到结果。

<table><tbody><tr><td>Dynabeads M-270</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0569S</td><td></td></tr><tr><td>T4 快速连接酶</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

由迎面而来的rna聚合酶导致停滞的复制叉的直接重启

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

体内研究表明，复制叉会因与对向转录复合物相遇而停滞。然而，对向碰撞发生后复制体和RNA聚合酶（RNAP）的命运仍不清楚。在此，我们发现E. coli复制体在与迎面而来的转录复合物发生碰撞时会停滞，但并不会因此解体，而是复制叉能够保持高度稳定，并最终通过将RNA聚合酶（RNAP）从DNA上移除后恢复延伸。我们还发现，转录-修复偶联因子Mfd可通过促进RNAP的移除，直接推动复制叉在碰撞后重新启动。这些结果揭示了复制装置本身具有内在稳定性，并阐明了转录偶联修复通路在促进复制叉越过RNAP阻滞位点过程中的新功能。

当复制体与迎面而来的RNA聚合酶（RNAP）发生碰撞后其命运尚不清楚。我们发现，复制体在与迎面而来的RNAP碰撞后会停滞，但在将RNAP从DNA上移除后可恢复延伸。Mfd通过促进碰撞后RNAP的移除，从而促进复制的重新启动。

由迎面而来的RNA聚合酶导致停滞的复制叉的直接重启

体内研究表明，复制叉的停滞是由于其与迎面而来的转录复合物相遇所致。然而，复制体和RNA……的命运仍不明确。

本实验的总体目标是观察复制区（Repli zone）与RNA聚合酶（RNAP）在迎头碰撞后各自的命运。该目标通过以下步骤实现：首先，在生物素标记的DNA上组装转录复合物，并将其固定在Stripp平板和磁珠上，从而获得停滞的RNAP延伸复合物。实验的第二步是将预先制备的叉状DNA连接至RNAP延伸复合物，以在迎头方向的RNAP下游形成一个复制叉。该实验步骤的第三步是组装复制区，并在复制叉处启动前导链的合成。实验步骤的最后一步是从磁珠中分离DNA，并通过PCR纯化柱纯化DNA。最终，可通过纯化的放射性标记DNA产物的碱性琼脂糖凝胶电泳结果，观察到复制叉在与对向转录复合物碰撞时发生停滞现象。大家好，我是来自洛克菲勒大学 Mike O'Donnell 实验室的 Richard Pomerance。今天我将向您展示如何在固相体系中实现核糖体与迎面而来的RNA聚合酶的碰撞实验。在我们的实验室中，该实验方法被用于研究DNA上的转录复合物如何影响复制过程。接下来我们开始实验。首先，将RNAP全酶与含有T7A1启动子的生物素标记3.6 KB DNA模板在100 µL缓冲液A中混合，37°C孵育10分钟。孵育10分钟后，加入核糖核苷三磷酸：腺苷三磷酸（ATP）、胞苷三磷酸（CTP）和腺苷尿苷（Aden allele uridine），以将RNA合成限制在20个核苷酸以内。在37摄氏度下将溶液额外孵育10分钟，以将停滞的RN酶延伸复合物固定到磁珠上。将溶液加入链霉亲和素包被的磁珠中。室温下孵育混合物10分钟。用0.9毫升高盐缓冲液洗涤磁珠，纯化固定化的停滞RNAP延伸复合物。每次洗涤后，通过磁分离去除上清液，以除去非特异性的R-N-A-P-D-N-A复合物。此洗涤步骤应重复五次。然后，珠子需再用 0.9 毫升缓冲液 A 洗涤两次。最后一次洗涤后，可在头对头 RNAP 阻滞处下游组装复制叉，将磁力架上的珠子（其上结合了停滞的 RNAP 延伸复合物）重悬于 100 微升 New England Biolabs 缓冲液 4 中。接着加入 10 单位的虾碱性磷酸酶（SAP），在 37 摄氏度下孵育样品 10 分钟。用 0.9 毫升缓冲液 A 将珠子洗涤三次。然后将珠子重悬于 50 微升快速 T4 连接反应缓冲液中。加入2 µL快速T4连接酶和预处理的分叉DNA，室温孵育10分钟。最后，用0.9 mL缓冲液A洗涤磁珠三次，将六聚体、DNAB解旋酶与连接在停滞的RNAP延伸复合物及下游复制叉上的磁性Strep A磁珠混合。用150 µL缓冲液A配制溶液，在23°C孵育30秒。在23摄氏度下短暂孵育32分钟后。在聚合酶三β夹中，加入A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P αP32标记的dGTP和αP32标记的dATP，总体积为200微升。将样品在37摄氏度下孵育5分钟。通过加入单链DNA结合蛋白、dCTP和dTTP启动复制反应。同时加入α-P³²标记的dTTP和dCTP，终体积为250微升。反应10分钟后，加入12微升0.5摩尔EDTA终止反应。接下来，将链霉亲和素包被的磁珠煮沸，以释放磁珠上的DNA。用蛋白酶K在50摄氏度下处理磁珠30分钟，去除残留的DNA。再次煮沸磁珠，并通过磁分离法移除上清液。使用Kyogen PCR纯化试剂盒纯化含有DNA的合并上清液。最后，通过碱性琼脂糖凝胶分析纯化的放射性标记DNA产物。当区带与前方的RNA聚合酶发生正面碰撞时，通常会产生长度分别为2.5 KB和3.6 KB的两种产物。其中2.5 KB的产物代表从复制叉到停滞的RNA聚合酶之间的DNA长度。这是由于复制体在与RNAP碰撞时发生停滞所致。3.6 KB的产物代表全长DNA，其产生原因可能是RNAP对启动子的占据不完全，或复制体部分穿透了与复制方向相反的RNAP。理想的结果显示约有50%的全长DNA被生成。然而，在某些情况下，RNA聚合酶在启动子上的占据率较低，因此观察到较大部分的全长DNA。这是因为更多的复制区域未遇到与复制方向相反的RNA聚合酶；在没有停滞的RNA聚合酶时，仅产生全长DNA。我们刚刚向您展示了如何在DNA上存在停滞的RNA聚合酶延伸复合物的条件下，进行复制及固相实验。进行此操作时，重要的是要用高盐溶液洗涤停滞的转录复合物，以去除非特异性结合在DNA上的过量RNA聚合酶，后者会抑制复制过程。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

direct-restart-replication-fork-stalled-head-on-rna

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

复制叉停滞了迎头RNA聚合酶直接重新启动

DT40 是一种模式脊椎动物遗传系统，为分析蛋白质功能提供了强有力的工具。本文介绍一种简单的方法，可在单分子水平上对 DT40 细胞 S 期期间影响 DNA...

利用DNA纤维技术在脊椎动物模型系统DT40中可视化DNA复制

我们在此描述一种利用位点特异性、可逆的系统 体内 蛋白阻断导致复制叉停滞和崩溃...

在 E. coli 中利用荧光阻遏蛋白-操纵子系统诱导位点特异性复制阻滞

本文概述了利用二维凝胶电泳分析通过致病性、易形成结构的重复序列进行复制进程的实验步骤。...

基于SV40的人工附加体中通过结构倾向性DNA重复序列的复制电泳分析

该技术展示了一种高效制备编码人癌基因的复制缺陷型逆转录病毒储备液的方法，并可用于在小鼠模型中诱导骨髓增殖性疾病。...

通过瞬时转染293T细胞生产复制缺陷型逆转录病毒

本方案展示了一种简单的单分子荧光显微镜技术，用于实时观察单个复制体进行的DNA复制过程。...

利用荧光显微镜观察单分子DNA复制

我们描述了一种通过噬菌体复制系统蛋白介导，对单个DNA分子进行实时复制观察的方法。...

利用单分子DNA拉伸实验直接观察酶复制DNA

可视化 体内 RNA 运输通过将荧光标记的 RNA 转录本显微注射到 非洲爪蟾...

在 Xenopus 卵母细胞中可视化 RNA 定位

已建立一种在受精后24小时（24hpf）将吗啉代寡核苷酸直接递送至斑马鱼耳囊的方法。通过将吗啉代寡核苷酸微量注射至听泡腔内，并结合电穿孔促进其穿透，我们能够避免吗啉代寡核苷酸对脑部的影响，从而获得特异性作用于内耳的效果。...

通过显微注射与电穿孔将MIF Morpholino直接递送至斑马鱼耳囊影响内耳发育

该方法可实现高产量 体外 从含有线性化质粒的模板合成带帽和无帽mRNA 高斯荧光素酶 荧光素酶（GLuc）基因。RNA经纯化后，取部分未加帽RNA通过酶法加帽 痘苗病毒...

体外 转录与Gaussia荧光素酶mRNA加帽及其后续的HeLa细胞转染

通过结合RNA整体染色的方法 原位...

RNA 原位杂交在整装胚胎及细胞组织学中的应用：适用于海洋软骨鱼类

了解复制体与RNA聚合酶迎头碰撞后的命运，观察复制叉停滞及Mfd介导的复制重启机制。该方法利用生物素化DNA和磁性珠固定技术，帮助研究人员深入理解DNA复制与转录的相互作用。

由迎面而来的RNA聚合酶导致停滞的复制叉的直接重启

探索更多视频