Name: 复制叉停滞了迎头RNA聚合酶直接重新启动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 了解复制体与RNA聚合酶迎头碰撞后的命运，观察复制叉停滞及Mfd介导的复制重启机制。该方法利用生物素化DNA和磁性珠固定技术，帮助研究人员深入理解DNA复制与转录的相互作用。

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我们特别感谢 Seth Darst 提供了RNAP和Mfd蛋白及表达载体。我们还要感谢 Sergei Borukhov 提供 GreB 以及 Dan Zhang 提供的技术支持。本工作由美国国立卫生研究院资助（M.O.D.），并由洛克菲勒大学 Marie-Josee 和 Henry Kravis 奖学金资助（R.T.P.）。

该方法已在 <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content-nw/full/327/5965/590/F3">Pomerantz 和 O'Donnell，《科学》327卷，590-592页（2010年）</a> 报道的研究中使用。
1. RNA聚合酶停滞延伸复合物的组装操作步骤如下：
将终浓度为 500 nM 的 E. coli RNAP σ70 HE 与终浓度为 5 nM 的含有 T7A1 启动子的生物素标记 3.6 kb DNA 模板在 100 μl 缓冲液 A（20 mM Tris-Cl (pH 7.5)、8 mM MgCl2、0.5 mM EDTA、5 mM DTT、10% 甘油）中混合，于 37 °C 孵育 10 分钟。随后加入 100 μM ApU 以及各 40 μM 的 GTP、ATP 和 CTP，继续在 37 °C 反应 10 分钟。
2. 将停滞的RNAP延伸复合物固定到链霉亲和素磁珠上的步骤如下：
向上述反应中加入 200 μl 链霉亲和素磁珠（Invitrogen），室温孵育 10 分钟。
3. 固定化的停滞RNAP延伸复合物的纯化步骤如下：
将上述珠子用含有0.75 M NaCl、200 μg/ml 肝素和20 μg/ml 单链DNA的0.9 ml缓冲液A洗涤5次（每次洗涤后通过磁分离去除上清液）。随后，珠子用0.9 ml缓冲液A再洗涤2次。
4. 相对于迎面而来的RNAP，在其下游形成复制叉的操作步骤如下：
将上述珠子重悬于100 μl New England Biolabs buffer 4中，并加入10单位的Sap I（New England Biolabs），在37 °C下孵育10分钟。珠子用0.9 ml缓冲液A洗涤3次，然后重悬于50 μl Quick T4连接反应缓冲液（New England Biolabs）中。加入2 μl Quick T4连接酶（New England Biolabs）以及终浓度为6 nM的预退火叉状DNA（RP10、RP22、RP25），在室温下反应10分钟。珠子再用0.9 ml缓冲液A洗涤3次。
5. 复制叉处复制体的组装及前导链合成的起始按如下步骤进行：
将448 pmol的DnaB（以六聚体形式）与150 μl缓冲液A（20 mM Tris-Cl（pH 7.5）、8 mM MgCl2、0.5 mM EDTA、5 mM DTT、10%甘油）在23 °C下孵育30秒。随后加入4.9 pmol的Pol III*（不含β亚基的Pol III全酶）、15 pmol的β亚基、2 mM ATP以及每种60 μM的dGTP和dATP，总体积达200 μl，并在37 °C下继续孵育5分钟。通过加入10 μg SSB、每种24 μM的dATP和dTTP，以及[α-32P]dTTP和[α-32P]dCTP（比活性为3,000–5,000 cpm/pmol），启动复制反应，终体积为250 μL。反应10分钟后，加入12 μl 500 mM EDTA终止反应。
6. 放射性标记DNA产物的纯化与浓缩操作步骤如下：
反应终止后，将磁珠（来自上述步骤）煮沸，以去除与磁珠结合的DNA。任何仍残留在磁珠上的DNA通过加入10 µl蛋白酶K溶液、在50 °C下孵育30分钟进行去除。随后将磁珠煮沸，并通过磁力分离移除上清液。合并含有DNA的上清液，使用Qiagen PCR纯化试剂盒进行纯化。纯化后的放射性标记DNA产物随后在碱性琼脂糖凝胶中进行分析。
*在无对向RNAP停滞延伸复合物的情况下进行复制时，操作步骤同上，但省略σ70。
代表性结果：
复制体与迎面而来的RNA聚合酶（RNAP）发生碰撞时，通常会产生两条长度分别为2.5 kb和3.6 kb的产物。其中2.5 kb的产物代表从复制叉到停滞的RNAP之间的DNA长度，这是复制体在与RNAP碰撞后停滞所致。3.6 kb的产物代表全长DNA，其产生原因可能是RNAP对启动子的占据不完全，或复制体部分穿越了迎面而来的RNAP。理想或准确的实验结果应显示约有50%的全长DNA生成。然而，在某些情况下，RNAP对启动子的占据程度较低，导致更高比例的全长DNA被观察到，因为更多的复制体未遇到迎面而来的RNAP。在没有停滞RNAP存在的情况下进行复制，则仅产生全长DNA（3.6 kb）。
<img src="/files/ftp_upload/1919/1919fig1.jpg" alt="DNA复制过程；包含RNAP阻断、复制体停滞、全长DNA复制的示意图。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图1"> 图1 复制体被迎面而来的RNAP阻碍。 (A) 实验设置。E. coli RNAP停滞的延伸复合物在含有T7A1启动子的生物素标记DNA上组装，方法如前所述（9）。简言之，通过将RNAP全酶与生物素标记的DNA孵育10分钟，随后加入ApU、GTP、ATP和CTP再孵育10分钟，在启动子下游20个碱基对处形成停滞的延伸复合物。然后加入链霉亲和素珠孵育额外10分钟，再用含有0.75 M NaCl、200 mg/ml肝素和100 nM单链DNA的缓冲液各0.9 ml洗涤珠子五次，以去除不稳定的RNAP-DNA复合物和过量的NTP。随后用SapI酶切DNA，洗涤后连接预先退火的分叉DNA。在组装复制体之前再次洗涤珠子。启动子位于分叉点上游2.5 kb处，其方向可引导转录朝向复制分叉进行。(B) 加入DnaB后组装复制体，并在存在（泳道2）或不存在（泳道1）迎面而来的RNAP的情况下启动复制。

<ol><li>Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+and+resolving+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription.</a> DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).</li>
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<li>Liu, B., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+transcription-repair+coupling+factor.+I.+Structural+domains+and+binding+properties.+Head-on+collision+between+a+DNA+replication+apparatus+and+RNA+polymerase+transcription+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of transcription-repair coupling factor. I. Structural domains and binding properties. Head-on collision between a DNA replication apparatus and RNA polymerase transcription complex.</a> Science. 267, 1131-1131 (1995).</li>
<li>George, D. L., Witkin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+excision+repair+in+an+mfd+mutant+of+Escherichia+coli+B%2Fr%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r.</a> Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).</li>
</ol>

用高盐溶液洗涤结合在磁珠上的停滞延伸复合物至关重要，目的是去除任何不稳定或非特异性结合的RNA聚合酶（RNAP）分子。RNA聚合酶对引物-模板型DNA结构具有极高的亲和力，因此必须去除这类非特异性的RNAP-DNA复合物，才能实现从引物-模板起始的复制。使用Qiagen PCR纯化试剂盒浓缩放射性标记的DNA产物也十分关键，以获得足够强的放射性信号，从而在凝胶中清晰观察到结果。

<table><tbody><tr><td>Dynabeads M-270</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0569S</td><td></td></tr><tr><td>T4 快速连接酶</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

由迎面而来的rna聚合酶导致停滞的复制叉的直接重启

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

体内研究表明，复制叉会因与对向转录复合物相遇而停滞。然而，对向碰撞发生后复制体和RNA聚合酶（RNAP）的命运仍不清楚。在此，我们发现E. coli复制体在与迎面而来的转录复合物发生碰撞时会停滞，但并不会因此解体，而是复制叉能够保持高度稳定，并最终通过将RNA聚合酶（RNAP）从DNA上移除后恢复延伸。我们还发现，转录-修复偶联因子Mfd可通过促进RNAP的移除，直接推动复制叉在碰撞后重新启动。这些结果揭示了复制装置本身具有内在稳定性，并阐明了转录偶联修复通路在促进复制叉越过RNAP阻滞位点过程中的新功能。

当复制体与迎面而来的RNA聚合酶（RNAP）发生碰撞后其命运尚不清楚。我们发现，复制体在与迎面而来的RNAP碰撞后会停滞，但在将RNAP从DNA上移除后可恢复延伸。Mfd通过促进碰撞后RNAP的移除，从而促进复制的重新启动。

由迎面而来的RNA聚合酶导致停滞的复制叉的直接重启

体内研究表明，复制叉的停滞是由于其与迎面而来的转录复合物相遇所致。然而，复制体和RNA……的命运仍不明确。

本实验的总体目标是观察复制区（Repli zone）与RNA聚合酶（RNAP）在迎头碰撞后各自的命运。该目标通过以下步骤实现：首先，在生物素标记的DNA上组装转录复合物，并将其固定在Stripp平板和磁珠上，从而获得停滞的RNAP延伸复合物。实验的第二步是将预先制备的叉状DNA连接至RNAP延伸复合物，以在迎头方向的RNAP下游形成一个复制叉。该实验步骤的第三步是组装复制区，并在复制叉处启动前导链的合成。实验步骤的最后一步是从磁珠中分离DNA，并通过PCR纯化柱纯化DNA。最终，可通过纯化的放射性标记DNA产物的碱性琼脂糖凝胶电泳结果，观察到复制叉在与对向转录复合物碰撞时发生停滞现象。大家好，我是来自洛克菲勒大学 Mike O'Donnell 实验室的 Richard Pomerance。今天我将向您展示如何在固相体系中实现核糖体与迎面而来的RNA聚合酶的碰撞实验。在我们的实验室中，该实验方法被用于研究DNA上的转录复合物如何影响复制过程。接下来我们开始实验。首先，将RNAP全酶与含有T7A1启动子的生物素标记3.6 KB DNA模板在100 µL缓冲液A中混合，37°C孵育10分钟。孵育10分钟后，加入核糖核苷三磷酸：腺苷三磷酸（ATP）、胞苷三磷酸（CTP）和腺苷尿苷（Aden allele uridine），以将RNA合成限制在20个核苷酸以内。在37摄氏度下将溶液额外孵育10分钟，以将停滞的RN酶延伸复合物固定到磁珠上。将溶液加入链霉亲和素包被的磁珠中。室温下孵育混合物10分钟。用0.9毫升高盐缓冲液洗涤磁珠，纯化固定化的停滞RNAP延伸复合物。每次洗涤后，通过磁分离去除上清液，以除去非特异性的R-N-A-P-D-N-A复合物。此洗涤步骤应重复五次。然后，珠子需再用 0.9 毫升缓冲液 A 洗涤两次。最后一次洗涤后，可在头对头 RNAP 阻滞处下游组装复制叉，将磁力架上的珠子（其上结合了停滞的 RNAP 延伸复合物）重悬于 100 微升 New England Biolabs 缓冲液 4 中。接着加入 10 单位的虾碱性磷酸酶（SAP），在 37 摄氏度下孵育样品 10 分钟。用 0.9 毫升缓冲液 A 将珠子洗涤三次。然后将珠子重悬于 50 微升快速 T4 连接反应缓冲液中。加入2 µL快速T4连接酶和预处理的分叉DNA，室温孵育10分钟。最后，用0.9 mL缓冲液A洗涤磁珠三次，将六聚体、DNAB解旋酶与连接在停滞的RNAP延伸复合物及下游复制叉上的磁性Strep A磁珠混合。用150 µL缓冲液A配制溶液，在23°C孵育30秒。在23摄氏度下短暂孵育32分钟后。在聚合酶三β夹中，加入A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P αP32标记的dGTP和αP32标记的dATP，总体积为200微升。将样品在37摄氏度下孵育5分钟。通过加入单链DNA结合蛋白、dCTP和dTTP启动复制反应。同时加入α-P³²标记的dTTP和dCTP，终体积为250微升。反应10分钟后，加入12微升0.5摩尔EDTA终止反应。接下来，将链霉亲和素包被的磁珠煮沸，以释放磁珠上的DNA。用蛋白酶K在50摄氏度下处理磁珠30分钟，去除残留的DNA。再次煮沸磁珠，并通过磁分离法移除上清液。使用Kyogen PCR纯化试剂盒纯化含有DNA的合并上清液。最后，通过碱性琼脂糖凝胶分析纯化的放射性标记DNA产物。当区带与前方的RNA聚合酶发生正面碰撞时，通常会产生长度分别为2.5 KB和3.6 KB的两种产物。其中2.5 KB的产物代表从复制叉到停滞的RNA聚合酶之间的DNA长度。这是由于复制体在与RNAP碰撞时发生停滞所致。3.6 KB的产物代表全长DNA，其产生原因可能是RNAP对启动子的占据不完全，或复制体部分穿透了与复制方向相反的RNAP。理想的结果显示约有50%的全长DNA被生成。然而，在某些情况下，RNA聚合酶在启动子上的占据率较低，因此观察到较大部分的全长DNA。这是因为更多的复制区域未遇到与复制方向相反的RNA聚合酶；在没有停滞的RNA聚合酶时，仅产生全长DNA。我们刚刚向您展示了如何在DNA上存在停滞的RNA聚合酶延伸复合物的条件下，进行复制及固相实验。进行此操作时，重要的是要用高盐溶液洗涤停滞的转录复合物，以去除非特异性结合在DNA上的过量RNA聚合酶，后者会抑制复制过程。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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