由迎面而来的RNA聚合酶导致停滞的复制叉的直接重启

本实验的总体目标是观察复制区（Repli zone）与RNA聚合酶（RNAP）在迎头碰撞后各自的命运。该目标通过以下步骤实现：首先，在生物素标记的DNA上组装转录复合物，并将其固定在Stripp平板和磁珠上，从而获得停滞的RNAP延伸复合物。实验的第二步是将预先制备的叉状DNA连接至RNAP延伸复合物，以在迎头方向的RNAP下游形成一个复制叉。

该实验步骤的第三步是组装复制区，并在复制叉处启动前导链的合成。实验步骤的最后一步是从磁珠中分离DNA，并通过PCR纯化柱纯化DNA。最终，可通过纯化的放射性标记DNA产物的碱性琼脂糖凝胶电泳结果，观察到复制叉在与对向转录复合物碰撞时发生停滞现象。

大家好，我是来自洛克菲勒大学 Mike O'Donnell 实验室的 Richard Pomerance。今天我将向您展示如何在固相体系中实现核糖体与迎面而来的RNA聚合酶的碰撞实验。在我们的实验室中，该实验方法被用于研究DNA上的转录复合物如何影响复制过程。

接下来我们开始实验。首先，将RNAP全酶与含有T7A1启动子的生物素标记3.6 KB DNA模板在100 µL缓冲液A中混合，37°C孵育10分钟。孵育10分钟后，加入核糖核苷三磷酸：腺苷三磷酸（ATP）、胞苷三磷酸（CTP）和腺苷尿苷（Aden allele uridine），以将RNA合成限制在20个核苷酸以内。

在37摄氏度下将溶液额外孵育10分钟，以将停滞的RN酶延伸复合物固定到磁珠上。将溶液加入链霉亲和素包被的磁珠中。室温下孵育混合物10分钟。

用0.9毫升高盐缓冲液洗涤磁珠，纯化固定化的停滞RNAP延伸复合物。每次洗涤后，通过磁分离去除上清液，以除去非特异性的R-N-A-P-D-N-A复合物。此洗涤步骤应重复五次。

然后，珠子需再用 0.9 毫升缓冲液 A 洗涤两次。最后一次洗涤后，可在头对头 RNAP 阻滞处下游组装复制叉，将磁力架上的珠子（其上结合了停滞的 RNAP 延伸复合物）重悬于 100 微升 New England Biolabs 缓冲液 4 中。接着加入 10 单位的虾碱性磷酸酶（SAP），在 37 摄氏度下孵育样品 10 分钟。用 0.9 毫升缓冲液 A 将珠子洗涤三次。然后将珠子重悬于 50 微升快速 T4 连接反应缓冲液中。

加入2 µL快速T4连接酶和预处理的分叉DNA，室温孵育10分钟。最后，用0.9 mL缓冲液A洗涤磁珠三次，将六聚体、DNAB解旋酶与连接在停滞的RNAP延伸复合物及下游复制叉上的磁性Strep A磁珠混合。用150 µL缓冲液A配制溶液，在23°C孵育30秒。

在23摄氏度下短暂孵育32分钟后。在聚合酶三β夹中，加入A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P αP32标记的dGTP和αP32标记的dATP，总体积为200微升。将样品在37摄氏度下孵育5分钟。

通过加入单链DNA结合蛋白、dCTP和dTTP启动复制反应。同时加入α-P³²标记的dTTP和dCTP，终体积为250微升。反应10分钟后，加入12微升0.5摩尔EDTA终止反应。

接下来，将链霉亲和素包被的磁珠煮沸，以释放磁珠上的DNA。用蛋白酶K在50摄氏度下处理磁珠30分钟，去除残留的DNA。再次煮沸磁珠，并通过磁分离法移除上清液。

使用Kyogen PCR纯化试剂盒纯化含有DNA的合并上清液。最后，通过碱性琼脂糖凝胶分析纯化的放射性标记DNA产物。当区带与前方的RNA聚合酶发生正面碰撞时，通常会产生长度分别为2.5 KB和3.6 KB的两种产物。其中2.5 KB的产物代表从复制叉到停滞的RNA聚合酶之间的DNA长度。

这是由于复制体在与RNAP碰撞时发生停滞所致。3.6 KB的产物代表全长DNA，其产生原因可能是RNAP对启动子的占据不完全，或复制体部分穿透了与复制方向相反的RNAP。理想的结果显示约有50%的全长DNA被生成。

然而，在某些情况下，RNA聚合酶在启动子上的占据率较低，因此观察到较大部分的全长DNA。这是因为更多的复制区域未遇到与复制方向相反的RNA聚合酶；在没有停滞的RNA聚合酶时，仅产生全长DNA。我们刚刚向您展示了如何在DNA上存在停滞的RNA聚合酶延伸复合物的条件下，进行复制及固相实验。进行此操作时，重要的是要用高盐溶液洗涤停滞的转录复合物，以去除非特异性结合在DNA上的过量RNA聚合酶，后者会抑制复制过程。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。