复制叉停滞了迎头RNA聚合酶直接重新启动

复制体的命运碰撞与头部的RNA聚合酶（RNAP）是未知的。我们发现，碰撞后的头对RNA聚合酶的复制体摊位，但恢复后，取代了从DNA的RNA聚合酶的伸长。 MFD促进便利碰撞后的RNA聚合酶的位移复制重新启动。

该程序的总体目标是观察正面碰撞后 Repli 区和 RNA 聚合酶或 RNAP 的命运。这是通过首先将转录复合物组装在生物素化 DNA 上并将其固定在 Stripp 片剂和珠子上来实现的，这将导致 RNAP 延伸复合物停止。该程序的第二步是将 preen pre-need 分叉的 DNA 连接到 RNAP 延伸复合物上，以形成正面 RNAP 下游的复制叉。

该程序的第三步是组装 repli 区并在复制叉处启动前导链合成。该程序的最后一步是从磁珠中分离 DNA，并在 PCR 纯化柱上纯化 DNA。最终，可以获得结果，显示 roso 在通过纯化的放射性标记的 DNA 产物的碱性 agro 凝胶与迎面转录复合物碰撞时停滞。

大家好，我是来自洛克菲勒大学 Mike O'Donnell 实验室的 Richard Pomerance。今天，我将向您展示如何进行核糖体与固相 RNA 聚合酶上的头部碰撞。我在实验室中使用这个程序来研究复制过程如何受到 DNA 转录复合物的影响。

那么让我们开始吧。为了开始此方案混合物，RNAP 全息酶与生物素化的 3.6 KB DNA 模板（在 100 微升缓冲液 a 中含有 T 7 A 一个启动子）在 37 摄氏度下孵育混合物 10 分钟。孵育 10 分钟后，加入核糖核苷酸腺苷、三磷酸、胞苷磷酸和亚丁等位基因尿苷，这将限制 RNA 合成到 20 个核苷酸。

将溶液在 37 摄氏度下再孵育 10 分钟，以将停止的 RN 猿延伸复合物固定在珠子上。将溶液添加到链霉亲和素包被的磁珠中。让混合物在室温下孵育 10 分钟。

通过用 0.9 毫升高盐缓冲液洗涤珠子来纯化固定的终止 RNAP 延伸复合物。为了在每次洗涤后去除非特异性 R-N-A-P-D-N-A 复合物，通过磁分离去除上清液。这种洗涤应重复五次。

然后用 0.9 毫升缓冲液再洗涤珠子两次 A.最后一次洗涤后，下游复制叉可以组装成正面 RNAP Resus 下游的复制叉，将磁条悬浮在 100 微升 New England Biolabs 缓冲液 4 中，以明显的珠子附着在停止的 RNAP 延伸复合物上。接下来，加入 10 单位的虾碱性磷酸酶或 SAP 一磷酸酶，并将样品在 10 摄氏度下孵育 37 分钟。用 0.9 mL 缓冲液 A 洗涤珠子 3 次，然后将珠子重悬于 50 μL 快速 T four 连接反应缓冲液中。

加入 2 μL 快速 T 4 连接酶和预先需要的分叉 DNA，在室温下孵育溶液 10 分钟。最后，用 0.9 毫升缓冲液 A 混合六聚体、带有磁性链球菌 A 的 DNAB 解旋酶和连接到终止的 RNAP 延伸复合物和下游复制叉的珠子再洗涤珠子 3 次。在 150 微升缓冲液 A 中制备溶液，并在 23 摄氏度下孵育 30 秒。

在 23 摄氏度下短暂的第 32 次孵育后。在聚合酶三个 β 钳夹下，A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P α P 32 标记的 DGTP 和 α P 32 标记的 DATP 体积为 200 微升。将样品在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。

通过添加单链 DNA 结合蛋白 DCTP 和 DTTP 开始复制。同时添加标记的 DTTP 和 DCTP 的 alpha P 32 至最终体积为 250 μL。10 分钟后，加入 12 μL 0.5 摩尔 EDTA 终止反应。

接下来，煮沸 strp din 珠子以从珠子中释放 DNA。在 50 摄氏度下用蛋白酶 K 处理微珠 30 分钟，去除任何残留的 DNA。再次煮沸珠子，并通过磁分离去除上清液。

使用 Kyogen PCR 纯化试剂盒纯化含有 DNA 的组合上清液。最后，在碱性 aros 凝胶中分析纯化的放射性标记 DNA 产物 区域与 RNAP 上的头部碰撞通常会导致两个长度为 2.5 KB 和 3.6 KB 的产物。2.5 KB 产物代表 DNA 从叉子到终止的 RNAP 的长度。

这是由于 repli 在与 RNAP 碰撞时停滞的结果。3.6 KB 产物代表全长 DNA，是 RNAP 不完全占据启动子或正面 RNAP 部分复制穿透的结果。良好的结果表明，可产生约 50% 的全长 DNA。

然而，在某些情况下，RNAP 对启动子的占用较少，并且观察到全长 DNA 的百分比更高。这是因为在没有停止的 RNAP 的情况下，更多的 repli 区不会遇到 RNAP 复制的头部，结果只有全长 DNA，我们刚刚向您展示了如何在存在与 DNA 结合的停止的 RNA 聚合酶延伸复合物的情况下进行复制和固相。执行此程序时，重要的是用高盐洗涤停止的转录复合物以去除多余的 RNA 聚合酶，这些聚合酶与 DNA 非特异性结合并抑制复制。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。