Dissezione della ghiandola larvale dell'anello: isolamento degli organi endocrini dello sviluppo dalla Drosophila

- Per sezionare la ghiandola ad anello, è necessario un microscopio sezionante, due pini, un ago a calibro fine per fungere da coltello da sezionamento e una soluzione tamponata. Trovare la ghiandola dell'anello identificando la testa delle larve, che contiene i ganci della bocca. Viaggiare lungo la lunghezza delle larve per trovare il cervello, che si trova tra il torace e le sezioni addominali. La ghiandola dell'anello è più piccola del cervello e si trova in cima.

La ghiandola dell'anello larvale è una struttura endocrina complessa che contiene tre diversi organi endocrini. Il corpus allatum si trova al centro della ghiandola ad anello e produce ormone giovanile, che regola lo sviluppo e l'invecchiamento. La ghiandola protoracica circonda il corpo allatum e costituisce la maggior parte della struttura. Ecdysone, un ormone coinvolto nel malto degli insetti, è fatto da questa ghiandola. Sotto la ghiandola protoracica si trova il corpo cardiacum, che produce ormone adipocinetico, un regolatore nutritivo.

In questo esempio, sezioneremo cervelli larvali e ghiandole ad anello per l'immunoistochimica.

- Dopo aver preparato le larve, iniziare la dissezione del corso in un piatto di tre centimetri riempito di PBS al microscopio sezionato. In primo luogo, afferrare il gancio della bocca con pinze. Quindi, utilizzando micro forbici, tagliare il corpo a circa un terzo della lunghezza dalla punta anteriore. Successivamente, tenere la lunghezza anteriore con un paio di pinze e utilizzare una seconda coppia per spingere delicatamente la punta della testa nel corpo per trasformare infine il corpo larvale all'interno.

Preparare fino a 20 larve in questo modo entro 10 minuti e quindi trasferirle in soluzione fissante. Dopo 30 minuti, lavare i preparati e procedere con l'immunostaining. Dopo aver immunosottento le larve, utilizzare una pipetta usa e getta per trasferire i campioni in un piatto riempito con 0,3% di PBT.

Al microscopio di sezionamento, afferrare la cuticola o il gancio della bocca con un paio di pinze. Quindi, utilizzare un ago calibro 27 attaccato a una siringa da un millilitro come un coltello per rimuovere il complesso del disco encefalico-anello della ghiandola occhi dalla cuticola del corpo tagliando la punta anteriore dell'esofago e dei dischi oculari.

Successivamente, utilizzando le pinta, separare accuratamente l'esofago e l'intestino dal complesso del disco cerebrale- ghiandola oculare. Estrarre l'intestino sul lato posteriore, poiché l'esofago passa attraverso il cervello sopra il cordone nervoso ventrale. Infine, per isolare il complesso della ghiandola cervello-anello, tagliare accuratamente le connessioni tra il disco cerebrale, i dischi degli occhi e i dischi delle gambe con un coltello ad ago.

- È essenziale utilizzare forcep fini con spigoli vivi durante la dissezione. Raccomando inoltre vivamente di affilare le forceps con una macina dell'Arkansas per riunire i loro bordi senza spazi vuoti.

- Per trasferire i campioni, utilizzare una micropipetta con un'ampia punta di foro. Depositare i campioni al centro dello scivolo di vetro. Quindi, utilizzare le forcep per posizionare i campioni sui lati ventrali in modo che la ghiandola dell'anello, che si trova sul lato dorsale del cervello, possa essere immagine. Successivamente, inclinare lo scivolo e pulire il più possibile il PBT in eccesso. Quindi, mettere una goccia di reagente di montaggio vicino ai campioni e utilizzare le forcep per abbassare lentamente un coverslip sul reagente e quindi sui campioni.