多色成像定时转基因斑马鱼:可视化由针对性的神经细胞消融激活视网膜干细胞

荧光报告基因在转基因动物中的表达使得在活体疾病模型中跟踪细胞对实验作的反应成为可能。在这里，斑马鱼的选择性细胞丢失是药理学诱导的，高分辨率多色共聚焦。目标细胞和直接邻居的图像是在紧接之后获取的，其间隔间隔在药物治疗图像分析表明内源性干细胞群的激活和随后在恢复阶段目标细胞的替换。

这种方法可以帮助回答再生生物学领域的关键问题，例如用于再生谨慎细胞类型的细胞和分子机制是什么 首先，在受精后 16 小时将从交配中收集的转基因卵转移到含有 0.3 x danio 溶液的培养皿中。ADD PTU 以在感兴趣组织出现色素沉着的任何证据之前抑制酪氨酸 ACE 活性。如果胚胎不是白化病，则在 28.5 摄氏度下孵育胚胎。

一旦报告基因明显，将培养皿置于荧光立体变焦显微镜下，并分选所需的转基因表达。成像前。在胚胎培养基中制备 0.5% 低熔点 aeros 封片剂，并将其储存在 40 摄氏度。

如有必要，添加 trica 和 PTU。轻轻混合并返回 40 摄氏度。通过将鱼置于含有 trica 的胚胎培养基中来麻醉鱼。

大约三分钟后，鱼会变得没有反应。要使用微量移液器触摸，请将单条鱼吸入体积约为 30 微升麻醉溶液的修剪过的移液器吸头中。接下来，倒置移液管，让鱼沉降到底部。

将尖端接触安装解决方案，让它们通过重力转移。注意不要稀释农产品，以便可以重复使用。丢弃微量移液器中剩余的麻醉液。

然后使用相同的尖端，将鱼转移到培养皿中。在大约 30 微升的封片剂溶液中，轻轻调整鱼的方向，使感兴趣的区域以 Aeros 液滴为中心。确保鱼保持在所需的方向，直到 Aeros 凝固。

如果需要，可以将多条鱼安装在一个培养皿中。气瓶凝固后，将鱼运输到共聚焦显微镜载物台，然后轻轻地向培养皿中加入含有 trica plus 或 mina PTU 的胚胎培养基，直到鱼完全浸没。打开成像软件并专注于感兴趣的区域，以获得细胞和/或分子细节的最佳成像。

在软件中使用具有高数值孔径的长工作距离物镜。从拨盘列表中选择合适的 flora fours。单击光谱设置并调整发射范围。

获得报告信号的清晰分离并最大限度地提高信噪比。在下拉菜单中选择适当的目标，以确保正确调整任何软件定义的预设。要聚焦激光器并设置功率级别，请从查找表中选择一个输出，该输出显示每个通道的像素饱和度。

接下来，设置探测器灵敏度以获得所需的图像质量，逐渐提高激光输出，直到图像强度可接受。避免感兴趣区域的像素饱和，并保持尽可能低的激光水平。减少光漂白和光毒性问题。

通过在监控所有成像通道的同时手动打开和关闭激光器，确保每条激光线仅在适当的通道中产生可检测信号。如果没有明显的串扰，则可以同时采集所有通道。接下来，使用缩放和旋转功能对感兴趣区域进行构图。

然后使用更快的扫描速度设置扫描速度和图像大小，最大限度地减少激光停留时间并提高时间分辨率。根据实验需要设置 Z 维度步长。这里使用 10 微米的步长对视网膜组织的七个光学切片进行成像。

确定适当的设置后，获取 Zack 图像并保存。然后移动到下一条鱼。可以根据随附书面文件中的说明进行连续捕获和释放成像以跟踪连续几天的细胞变化。

在进行多报告基因成像实验时，最好使用分离良好、光谱良好的地板，但这并不总是可行的。在这里，我们展示了一种简单的图像减法，该方法使用开源软件图像 J 来分离具有重叠激发和发射剖面的地板。在我们的例子中，GFP 和 YFP。

本视频中描述的时间线成像技术已用于在视网膜双极神经元消融和再生过程中监测 GFP 标记的视网膜干细胞 为了进行光谱分离，使用顺序成像模式和可变屏障滤光片设置收集图像，这允许分别独立和部分分离地获取重叠的地板四层。获取图像后，使用 ImageJ loci bio formas 导入打开图像文件以启动导入工具。将感兴趣的文件拖动到图像 J 窗口中。

使用导入窗口中的 split channels 复选框将通道拆分为单独的堆栈，以启动 align three TP 插件。单击 plugins，然后对齐堆栈。然后对齐三个 tp。

堆栈必须对齐以确保正确减去。在第一个下拉框中选择引用堆栈，在第二个下拉框中选择未对齐的堆栈。选中 Use XY relative origin 和 use Z relative origin 框，然后单击 okay。

要开始对齐过程，请单击 volume registration 按钮。将出现一个包含对齐参数的新窗口。单击 确定。

此部分已由插件的分发者优化，因此无需修改。完成后，将出现一个对齐的堆栈窗口。从对齐的窗口中选择输出以打开输出窗口。

此窗口也经过优化，无需修改。单击 确定。工作区中将出现一个新堆栈，其中 aligned 附加到文件 Title 的末尾。

要使用图像计算器消除串扰，请单击 处理 然后 图像计算器.在图像 1 下拉框中选择要减去的堆栈，并选择要用于减法的堆栈。在图像 2 下拉框中，选择 减去 在作下拉框中，然后单击 确定。

图像 J 将要求处理堆栈。选择 yes。应该会出现一个新的堆栈，它已经消除了重叠通道之间的串扰。

合并堆栈以在对齐和减法之前重新创建相同的图像结构。通过在通道工具窗口中选择合并的通道，该工具允许将最多四个堆栈合并为一个超级堆栈。最后，对通道着色，调整亮度和对比度，并将文件保存为 tiffs 以检查硝基还原酶的靶向丢失和再生。

表达 M cherry 的视网膜双极细胞。在处理前对个体斑马鱼拍摄时间序列的共聚焦图像。在受控双极细胞中存在膜标记的 YFP 报告基因的镶嵌表达，黄色表示，在靶向双极细胞中存在硝基还原酶樱桃融合蛋白，红色表示。

以青色显示的膜标记的 CFP 转基因提供了有关大多数其他视网膜细胞的上下文信息，以提高清晰度。用甲硝唑处理后显示没有 CFP 信号的相同图像。表达红色硝基还原酶的双极细胞丢失，而黄色受控双极细胞幸免

这证明了这种消融方法的高度特异性。同样，为了清晰起见，将显示没有 CFP 的相同图像。当 metro NIAZ 被移除时，表达 NTR 的细胞会返回这里。

G-F-P-Y-F-P 减法的一个例子显示在这个标记为 Mueller 的 GFP 图中。GL 细胞显示为绿色，YFP 标记的双极细胞显示为紫色。两者之间的重叠会产生白色来执行减法。

必须首先对齐 GFP 和 YFP 图像。然后，减法过程允许从 GFP 图像中删除 YFP 标记的双极细胞，从而可以清楚地表示 GFP 标记的 Mueller ggl，并检测较暗的 Mueller 细胞。现在可以验证以红色显示的暗淡 Mueller、ggl 和 M cherry 标记的双极细胞之间的重叠。

此处显示的数据表明，双极细胞消融会触发 mullar GGL 以替换丢失的细胞。这种解释与最近对视网膜再生的研究一致，该研究表明 Mueller Ggl 是哺乳动物和鱼类中损伤诱导的祖细胞。该技术使研究人员能够通过斑马鱼中干细胞的可视化来探索调节特定细胞类型再生的机制。