Name: 多色成像定时转基因斑马鱼:可视化由针对性的神经细胞消融激活视网膜干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学习多色共聚焦延时成像与靶向细胞消融技术，用于研究斑马鱼视网膜神经干细胞激活机制。该方法可实时追踪内源性干细胞群在损伤后的活化与细胞替代过程。

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感谢 Meera Saxena 博士和 Jonathan Mathias 博士对本文手稿提出的有益意见。感谢 Michael Parsons 博士、Pamela Raymond 博士和 Rachel Wong 博士提供转基因品系。动物实验均依照 MCG IACUC 批准的协议 07-12-003*B 所制定的指南和规定进行。本研究由 NIH R21 MH083614 以及授予 J.S.M. 的 March of Dimes Basil O Conner 新兴学者奖资助。

<ol><li>Köster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+microscopy+of+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse microscopy of brain development.</a> Methods Cell Biol. 76, 207-235 (2004).</li>
<li>Mumm, J. S., Williams, P. R., Godinho, L., Koerber, A., Pittman, A. J., Roeser, T., Chien, C. B., Baier, H., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+dendritic+targeting+of+laminated+afferents+by+zebrafish+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells.</a> Neuron. 52, 609-621 (2006).</li>
<li>Curado, S., Anderson, R. M., Jungblut, B., Mumm, J., Schroeter, E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236, 1025-1035 (2007).</li>
<li>Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+visual+responses+of+wild-type+and+hypopigmented+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish.</a> Vision Res. 42, 293-299 (2002).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+Coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. Coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+motility+and+actin+cytoskeleton+of+individual+neurons+and+neural+crest+cells+in%0A++zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in
 zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by%0A++confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by
 confocal microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

J.S.M. 已获得一项关于在斑马鱼中使用硝基还原酶介导的细胞消融系统的专利（Mumm J.S. 和 Schroeter E.H.，《斑马鱼中的靶向与区域性细胞消融》，美国专利 7514595，2009 年 4 月 7 日）。该技术被作为 J.S.M. 创立并持续持股的一家生物技术公司 Luminomics, Inc. 所提供的工具与服务的通用平台。

在本视频中，我们概述了用于多色共聚焦延时成像和靶向细胞消融的技术。我们采用延时成像技术在活体（in vivo）条件下监测多种目标细胞类型的行为，同时利用靶向细胞消融技术研究神经环路功能及细胞特异性的神经元再生模式。所展示的实例突出了这些方法带来的若干优势。其中最为显著的是，延时成像提供了一种内部自对照的研究范式：所有观察到的现象均可与先前状态进行直接关联，从而实现不同实验时间点之间的直接比较而非推断性比较，使相对变化更易于量化，并减少因群体内个体差异带来的实验“噪声”。多色成像的一个优势在于能够可视化相互作用和/或相邻细胞类型的变化。例如，通过使用标记穆勒胶质细胞的转基因品系，我们正在表征这些潜在的损伤诱导性干细胞对视网膜特定细胞亚群丢失所作出的反应。我们还利用该方法揭示了神经环路形成的新型机制2。此外，除了细胞再生研究外，我们最近也开始利用基于NTR的消融系统，结合多种行为学范式和电生理检测手段，探究神经元亚型——即特定神经环路——的功能作用。采用斑马鱼进行此类研究的独特优势在于，由于其具有强大的再生能力，所诱导的功能缺陷是暂时性的。因此，通过与延时成像分析相结合，我们能够明确导致功能恢复的再支配机制，以及实现功能恢复所需的再支配程度。
所提供的方法可适用于许多不同的科学问题。例如，类似的消融与再生分析可应用于任何可通过转基因手段定义的细胞亚型。总体而言，此类研究有望在单个细胞类型水平以及特定干细胞微环境层面拓展我们对再生机制的理解。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">1. 试剂：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Danau溶液：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;氯化钠（Fisher, S271 1）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;氯化钾（Fisher, P217 500）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;HEPES（Fisher, BP310500）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;硫酸镁（Fisher, M65 500）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;硝酸钙（Fisher, C109500）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;青霉素-链霉素（Fisher, ICN1670049）&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">其他试剂：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;低熔点琼脂糖（Fisher, BP165-25）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;三卡因甲磺酸盐（Fisher, NC9435281）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;N-苯基硫脲（Fisher, NC9968868）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;甲硝唑（Fisher, AC21034-1000）&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">2. 耗材：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;深型培养皿（Fisher Scientific/Corning, 08-772-32）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Dumont #5 精细镊子（Fisher, NC9404145）&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">3. 仪器：&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;变倍体视显微镜（Olympus, SZ51）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;荧光变倍体视显微镜（Olympus, SZX16）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;共聚焦显微镜（Olympus FV1000）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;数字恒温金属浴（Fisher, 11-715-125DQ）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Barnstead/Thermolyne 台式培养箱（Fisher, 11-702-4）&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

多色延时成像转基因斑马鱼：可视化通过靶向神经元细胞消融激活的视网膜干细胞

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

活体斑马鱼幼鱼的高分辨率延时成像可用于观察生物过程的动态展开（综述见1）。携带在相邻细胞类型中表达不同荧光报告基因的复合转基因鱼，为追踪细胞间相互作用2和/或随时间变化的组织水平对实验干预的响应提供了手段。在本视频中，我们演示了可用于在单条鱼中连续时间点（时间跨度可从数分钟至数天）对多个转基因标记的细胞类型进行成像的方法。所述技术适用于任何旨在随时间关联相邻细胞类型“行为”的研究，包括：1）用于在连续数天内对大量鱼类进行成像的连续“捕获-释放”方法；2）分离激发/发射光谱重叠的荧光团（例如GFP和YFP）的简化方法；3）利用低色素突变品系延长高分辨率成像在发育晚期幼体阶段的时间窗口；4）使用膜定位荧光报告基因揭示单个细胞的精细形态细节以及细胞群体中的细胞结构细节；以及5）一种先前描述的化学诱导消融转基因靶向细胞类型的方法，即硝基还原酶（NTR）介导前药底物（如甲硝唑（MTZ））转化为细胞毒性衍生物的方法3,5。
以这些方法为例，我们将在数天内对单条鱼体内某一亚型视网膜双极神经元的消融及再生过程进行可视化观察。同时，我们将监测其他多种视网膜细胞类型，包括邻近的非靶向双极细胞以及可能因退变刺激而激活的视网膜干细胞（即Müller胶质细胞）。&#971;胶质细胞。该策略正在我们的实验室中用于表征细胞和组织水平（例如干细胞微环境）对特定神经元细胞类型选择性丢失与再生的响应。

在本视频中，提供了多色共聚焦延时成像和靶向细胞消融的技术。延时成像用于监测多种目标细胞类型的行为 体内靶向细胞消融有助于研究神经环路功能及细胞特异性神经元再生模式。

高分辨率活体斑马鱼幼鱼延时成像可用于可视化生物过程的动态展开（综述见参考文献1）。化合物……

在转基因动物中表达荧光报告基因使得能够在活体疾病模型中追踪细胞对实验干预的响应。在此，通过药物诱导斑马鱼中特定细胞的选择性丢失，采用高分辨率多色共聚焦显微技术，在药物处理前、处理后即刻以及后续间隔时间点对靶向细胞及其邻近细胞进行成像。图像分析表明，在恢复阶段内源性干细胞群被激活，并随之替代了被靶向清除的细胞。该方法有助于回答再生生物学领域中的关键问题，例如：再生特定细胞类型所依赖的细胞与分子机制是什么？首先，在受精后16小时，将从交配中收集的转基因卵转移到含有0.3 x 斑马鱼溶液的培养皿中。在目标组织出现任何色素沉积迹象之前，加入PTU以抑制酪氨酸酶活性。如果胚胎并非白化型，则将胚胎在28.5°C条件下孵育。当报告基因表达明显时，将培养皿置于荧光体视变倍显微镜下，筛选具有目标转基因表达的个体。成像前，用胚胎培养基配制0.5%低熔点琼脂糖封片液，并将其保存在40摄氏度。如有需要，加入三卡和PTU。轻轻混匀后放回40摄氏度。将鱼放入含有三卡的胚胎培养基中以麻醉。鱼类将大约在三分钟内失去反应。使用微量移液器时，吸取单条鱼进入已剪裁的移液器吸头中，吸入约30微升的麻醉溶液。接着，将移液器倒置，使鱼沉降至吸头底部。将枪头接触封片液，让其依靠重力转移。注意不要稀释农杆菌溶液，以便重复使用。弃去微量移液器中剩余的麻醉溶液。然后使用同一吸头将鱼转移至培养皿中。在约30微升封片溶液中，轻轻调整鱼的位置，使目标区域位于液滴中心。确保鱼在封片剂凝固前保持在所需的方向。可根据需要将多条鱼同时固定于一个培养皿中。待琼脂凝固后，将鱼样转移至共聚焦显微镜载物台上，轻轻向培养皿中加入含有三卡因（trica）并可选择性添加或不添加PTU的胚胎培养基，直至鱼样完全浸没。打开成像软件，对目标区域进行聚焦，以获得细胞和/或分子细节的最佳成像效果。在软件中使用长工作距离且具有高数值孔径的物镜。从转盘列表中选择合适的荧光染料组合。点击光谱设置，并对发射波长范围进行调整。为了获得清晰的报告信号分离并最大化信噪比，请在下拉菜单中选择合适的物镜，以确保软件定义的预设得到正确调整。为了聚焦激光并设置功率水平，请选择查找表中的一个输出，该输出显示每个通道的像素饱和情况。接下来，调整检测器灵敏度以获得理想的图像质量，逐步提高激光输出，直至图像强度达到可接受水平。应避免感兴趣区域内的像素饱和，并尽可能保持激光强度处于最低水平，以减少光漂白和光毒性问题。通过手动开启和关闭各激光线路，同时监测所有成像通道，确保每条激光线路仅在相应的通道中产生可检测信号。若未见明显串色，则可同时采集所有通道。接下来，使用缩放和旋转功能框定目标区域。然后根据实验需求设置扫描速度和图像尺寸，使用较快的扫描速度可缩短激光驻留时间，并提高时间分辨率。根据实验需要设定Z轴步进尺寸，此处采用10微米的步进尺寸，对视网膜组织的七个光学切片进行成像。确定适当的设置后，采集 Zack 图像并保存，然后转移到下一条鱼。根据随附书面文件中的说明，可进行连续的捕获与释放成像，以追踪连续数天内的细胞变化。在进行多报告基因成像实验时，最好使用光谱分离良好的荧光基团，然而这并不总是可行的。本文展示了利用开源软件 ImageJ 进行简单图像减法处理的方法，以分离具有重叠激发和发射光谱的荧光基团信号。在本例中，目标为 GFP 和 YFP。本视频中描述的时间序列成像技术已被用于监测视网膜干细胞在视网膜双极神经元消融与再生过程中的动态变化。为实现光谱分离，需采用顺序成像模式并调整滤光片设置，以分别独立采集和部分分离重叠的荧光信号。图像采集完成后，使用 ImageJ 的 LOCI Bio-Formats 导入功能打开图像文件以启动导入工具。将目标文件拖入 ImageJ 窗口中。在导入窗口中使用“拆分通道”复选框将通道拆分为独立的图层，以启动“对齐三个TP”插件。点击“插件”，然后选择“对齐图层”，再选择“对齐三个TP”。必须对图像堆栈进行对齐，以确保正确减除。在第一个下拉框中选择参考堆栈，在第二个下拉框中选择未对齐的堆栈。勾选“使用 XY 相对原点”和“使用 Z 相对原点”选项，然后点击确定。要开始配准过程，请点击体积配准按钮。此时将出现一个包含配准参数的新窗口。点击确定。此部分已由插件发行商优化，无需进行任何修改。完成后，将出现一个对齐后的图像堆栈窗口。从该对齐窗口中选择输出，以打开输出窗口。此窗口已优化，无需修改。单击“确定”。工作区中将出现一个新图像栈，其文件标题末尾会添加“aligned”。为了使用图像计算器去除串扰，请点击“Process”（处理），然后选择“Image Calculator”（图像计算器）。在“Image 1”（图像1）下拉框中选择要被减去的图像栈，在“Image 2”（图像2）下拉框中选择用于减法运算的图像栈。在“Operation”（运算方式）下拉框中选择“Subtract”（减法），然后点击“Okay”（确定）。Image J 将提示是否处理该图像栈。选择“是”。随后将出现一个新的图像栈，其中已去除重叠通道之间的串扰。合并图层以重建在配准和减影前的相同图像结构。在通道工具窗口中选择合并通道后，该工具可将最多四个图层合并为一个多通道图像（hyper stack）。最后，对各通道进行染色，并调整亮度和对比度，将文件保存为 tiff 格式，以检测硝基还原酶的靶向丢失与再生情况。表达mCherry的视网膜双极细胞。在处理前，对单条斑马鱼进行了共聚焦图像的时间序列采集。图中显示，对照组双极细胞中表达膜定位的YFP报告蛋白（黄色），而靶向双极细胞中表达硝基还原酶与mCherry的融合蛋白（红色）。图中以青色显示的膜标记CFP转基因为其他大多数视网膜细胞提供了背景信息，以增强清晰度。同一图像在甲硝唑处理后不显示CFP信号。表达红色硝基还原酶的双极细胞消失，而受黄色标记控制的双极细胞得以保留。这展示了该消融方法的高度特异性。同样，为清晰起见，展示了同一位置未表达CFP的图像。当去除metro NIAZ时，表达NTR的细胞会重新回到此处。本图展示了G-F-P-Y-F-P减法方法的一个示例，其中GFP标记的Mueller细胞以绿色显示，YFP标记的双极细胞以紫色显示。两种信号的重叠区域呈现白色，用于执行减法操作。必须首先对 GFP 和 YFP 图像进行配准。随后通过减影处理，可将 YFP 标记的双极细胞从 GFP 图像中去除，从而清晰地呈现 GFP 标记的 Mueller ggl，并检测到较暗的 Mueller 细胞。现在可以验证红色显示的暗弱 Mueller 细胞、ggl 与 M cherry 标记的双极细胞之间的重叠部分。此处所示数据表明，双极细胞消融会触发穆勒胶质细胞（Muller glia）以替代丢失的细胞。这一解释与近期关于视网膜再生的研究一致，这些研究指出穆勒胶质细胞在哺乳动物和鱼类中均可作为损伤诱导的祖细胞。该技术可使研究人员通过观察斑马鱼中的干细胞，探索调控特定细胞类型再生的机制。

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利用双光子显微镜在斑马鱼幼体中进行靶向神经元消融

来源： Lahne, M., 等. 利用多光子显微镜进行活细胞成像的成年转基因斑马鱼视网膜外植体培养方法. J. Vis. Exp.

活细胞成像观察斑马鱼视网膜再生过程中穆勒胶质细胞核的迁移

来源：Williams, A. L., et al. 利用多光子延时成像技术实时可视化发育过程：斑马鱼胚胎中迁移的神经嵴细胞的可视化. J. Vis. Exp.

利用多光子延时成像技术观察斑马鱼胚胎中神经嵴细胞的迁移

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