利用延时共聚焦显微镜观察 sox10:kaede 转基因斑马鱼品系中的颅面发育过程

以下实验的总体目标是生成神经嵴细胞迁移的活体延时录像，以展示发育中颅面结构的形成过程。首先，将麻醉后的转基因 SOX10 KD 斑马鱼固定在琼脂糖中，以最大限度减少实验过程中的移动。接着，在共聚焦显微镜下对神经嵴细胞进行紫外光激活，使其中的 KD 荧光蛋白由绿色转化为红色。

然后聚焦于光转化的神经嵴细胞。在记录延时视频之前，对发育结构生成一个Z轴层扫图像。结果展示了在转基因SOX10 KD斑马鱼胚胎中，颅部神经嵴细胞发育形成斑马鱼初级腭的过程。

与静态成像等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够实时观察细胞迁移等复杂的发育过程。这使得研究结果更易于被科学界获取。该方法有助于解答发育生物学中的关键问题，例如神经嵴细胞来源的结构如何形成，以及PTO基因如何影响其发育。

为准备胚胎封片，使用 125 毫升的烧瓶将 E3 水与低熔点琼脂糖混合，通过微波加热使溶液溶解。然后加入三卡因（Trica），将烧瓶置于 50 摄氏度的水浴中保温，并对 60 小时受精后的强荧光转基因斑马鱼（zebra fish）KD 胚胎进行麻醉处理。随后，用滤纸将每个胚胎转移至载玻片腔室中。

吸去多余的 E3 水，然后用琼脂糖溶液覆盖胚胎。使用移液器吸头将胚胎精确调整至背侧朝上，确保胚胎完全浸没在琼脂糖中。待琼脂糖凝固后，加入 E3 0.015% 三卡因填充腔室载玻片，以进行光转化。

首先使用20倍空气浸润物镜对胚胎进行聚焦。然后按下显微镜上的L 100光源按钮，并在软件中选择通道。打开图标。

查看采集控制 A 一的设置，点击共聚焦设置按钮。接着，点击自动，并为通道 1、2、3 分别选择 DPI 4 88 和 561.9，然后再次关闭窗口。随后关闭通道一和通道三，点击解除联锁按钮，按下扫描按钮，以每秒一帧、高压 200 的条件开始扫描。

开始聚焦于目标细胞。逐渐将每秒帧数增加至每32秒一帧，并根据背景噪声将电压降低至100至120。当胚胎处于焦平面时，用鼠标右键点击前，先抓住屏幕右边缘的绿色边框并缩小，使其覆盖需要进行光转化的区域。

将每秒帧数更改为1，高压（HV）更改为200，然后按下扫描。此时将可见光转化区域的放大图像。下一张图片。

通过打开通道一，将细胞转化五到六十秒，直至绿色的KD信号几乎消失。然后关闭dappy通道。打开通道二和三，恢复至原始缩放倍数。

右键单击缩放窗口，选择“恢复至原始大小”，以检查目标细胞的光转化是否充分。通过菜单栏中选择“采集Z序列”图标来设置Zack的范围。调整查找表或uts，以设置时间序列成像。

选择 A 一个简单的图形用户界面框，并勾选以下设置：每秒 32 帧采集一次。尺寸为 1024，平均次数为 4 或 8×，具体取决于单次循环中需要采集的 Z 轴层数量。

接下来，进入查看采集控制中的ND序列采集并设置时间范围。然后点击连续采集，再点击Zack。按照之前演示的方式设置边界。

开始拍摄，向腔室中加入0.015% E3三卡溶液，全天滑动并完全填充腔室以进行过夜成像。成像完成后，通过点击“显示最大强度投影”从成像文件创建高质量视频。然后在图像上右键单击，并创建新文档。

删除不必要的帧并调整LUTs。本视频展示了斑马鱼腭部发生过程，使用SOX10-K转基因品系标记颅神经嵴细胞，以追踪其发育形成初级腭部的过程。在受精后60小时，腭部前端形成中最靠前的细胞通过光转化从绿色转为红色。

当成对的骨小梁相遇并形成初级腭后，继续追踪这些细胞直至其到达最终位置。本视频展示了因speck基因的吗啉代介导敲低导致腭部发育异常，进而形成口面裂的过程。以一个与斜行面部裂相关的基因lbA为例进行说明。

在60小时后受精（HPF）时，对最前部筛板细胞进行单侧光转化，显示出中筛板细胞与侧筛板细胞之间融合失败。该缺陷类似于人类斜面裂发育的发病机制，即侧鼻突与上颌突之间融合失败。该技术为发育生物学领域的研究人员探索斑马鱼神经嵴细胞发育铺平了道路。

观看完本视频后，您应该能够充分理解如何利用该方法来捕捉您感兴趣的发育过程。