颅面部发育中的SOX10可视化:使用枫转基因斑马鱼线时间推移共聚焦显微镜
2013年9月30日
实验数据的可视化已成为展示结果给科学界的一个关键因素。越来越多的胚胎活延时录制的产生有助于复杂的发育过程中更好地介绍和了解。该协议是一步一步的通过枫蛋白在斑马鱼光转化指南细胞标记。
以下实验的总体目标是生成神经嵴细胞迁移的实时延时记录，以显示发育中的颅面部结构的形成。这是通过首先在琼脂糖中安装麻醉的转基因 SOX 10 KD 斑马鱼来实现的，以尽量减少整个实验中的移动。接下来，在共聚焦显微镜下，进行紫外光活化，将神经嵴细胞中的 KD 从绿色转化为红色。
然后专注于光转换的神经嵴细胞。在录制延时视频之前，会生成显影结构的 Zack。获得的结果表明，在转基因 SOX 10 KD 斑马鱼胚胎中，颅神经嵴细胞发育到斑马鱼初级上颚。
与静态成像等现有方法相比，该技术的主要优点是可以实时可视化复杂的发育过程，例如细胞迁移。这使得科学界更容易获得结果。这种方法可以帮助回答发育生物学中的关键问题，例如神经嵴细胞衍生结构如何形成，以及 PTO 基因如何影响它们的发育。
为了准备封固胚胎，使用 125 毫升烧瓶将 E 3 水与低熔点 aeros 微波混合以溶解溶液。然后加入 trica 并将培养瓶放入 50 摄氏度的水浴中保温，并在受精后 60 小时嵌套荧光鲜艳的转基因 KD 斑马鱼胚胎。然后将它们分别转移到带有薄纸的腔室载玻片上。
吸收多余的 E 三水，然后使用 agarro 溶液覆盖胚胎。使用微型装载器尖端将胚胎完美地放置在背侧，确保胚胎完全浸没在 agarro 中。agarro 凝固后，使用 E three 0.015%trica 填充腔室载玻片进行照片转换。
首先使用 20 x 空气浸没物镜聚焦胚胎。然后按下显微镜上的 L 100 light（灯光）按钮，并在软件中选择通道。打开图标。
查看采集控件 A one 设置，然后单击共聚焦设置按钮。接下来，单击自动并分别为通道 4、88、561.9 和 1、2 和 3 选择 DPI，然后再次关闭窗口。然后关闭通道 1 和 3，然后单击 remove interlock（删除联锁）按钮，然后按下从每秒 1 帧和 HV 200 开始的扫描按钮。
开始关注感兴趣的细胞。逐渐将每秒帧数增加到每 32 帧 1 帧，并根据背景噪声将电压降低到 100 到 120。当胚胎聚焦时，抓住屏幕右边缘的绿色边缘并将其缩小以适合要转换照片的区域，然后用鼠标右键单击。
将每秒帧数更改为 1，将 HV 更改为 200，然后按 scan。现在将看到照片转换区域的放大图像。下一张照片。
通过打开通道 1 5 到 60 秒不等，直到绿色 KD 信号几乎消失，来转换细胞。然后关闭 dappy 频道。打开通道 2 和 3 以返回到原始缩放。
右键单击缩放窗口并选择 返回原始大小 检查所需的单元格是否已充分转换照片。通过选择菜单栏中的 Capture Z Series 图标来设置 Zack 的限制。调整查找表或 ut 以设置延时摄影。
选择 A one simple GUI 框并勾选以下设置。每秒 32 帧 1 次。大小为 1024，平均 4 或 8 倍，具体取决于必须在一个循环中采用的 Z 堆栈数量。
接下来，转到 view acquisition controls ND sequence acquisition 并设置时间范围。然后单击 continuous，然后单击 Zack。如前所述设置边框。
开始电影，向腔室中加入 E 3 个 0.015% trica 溶液，全天滑动并完全填充腔室以进行过夜成像。成像完成后，单击 Show maximum intensity projection （显示最大强度投影） 从成像文件创建高质量的视频。然后右键单击图像并创建新文档。
删除不必要的帧并调整 L uts。在这部展示斑马鱼 Palato Genesis 的电影中，SOX 10 K 转基因品系用于跟踪颅神经嵴细胞发育形成初级上颚的过程。形成上颚的最前部细胞在受精后 60 小时从绿色光转化为红色。
当成对的小梁相遇形成初级腭时，这些细胞会被跟踪，直到它们到达最终目的地。这部电影展示了上颚发育紊乱导致口颌裂的形成，Morino 介导的斑点敲除。以 1 lb， A 参与斜面裂的基因为例。
在 60 HPF 时，最前筛板细胞的单侧光转换显示正中和外侧筛板细胞之间出现失败积液。这种缺陷类似于人类斜面裂发展的发病机制，其中鼻外侧突和上颌突起之间发生失败的积液。这项技术为发育生物学领域的研究人员探索斑马鱼的神经嵴细胞发育铺平了道路。
看完这个视频后，你应该对如何使用这种方法来捕捉你感兴趣的发展过程有一个很好的了解。
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概述
本协议概述了一种通过活体延时录像来观察斑马鱼胚胎中神经嵴细胞迁移的方法。通过利用kaede蛋白的光转化，研究人员可以更好地了解头面部结构的发育。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 胚胎学
背景
- 实验数据的可视化对科学交流至关重要。
- 延时录像增强了对复杂发育过程的理解。
- 转基因斑马鱼模型对于研究神经嵴细胞动态非常有价值。
- 光转化技术允许对细胞变化进行精确跟踪。
研究目的
- 生成神经嵴细胞迁移的活体延时录像。
- 说明斑马鱼中头面部结构的形成。
- 利用光转化来增强细胞过程的可视化。
使用的方法
- 将麻醉的转基因SOX 10 KD斑马鱼固定在琼脂中。
- 进行紫外光激活以将kaede蛋白从绿色转换为红色。
- 在共聚焦显微镜下观察光转化后的神经嵴细胞。
- 录制延时视频以捕捉头部结构的发育。
主要结果
- 成功观察到斑马鱼中神经嵴细胞的迁移。
- 展示了头部神经嵴细胞发育成原始腭的过程。
- 生成展示细胞动态的延时视频。
- 对SOX 10在头面发育中的作用的洞察。
结论
- 该协议有效展示了神经嵴细胞在体内的行为。
- 光转化是研究发育过程的强大工具。
- 研究结果有助于理解头面发育。
常见问题
Executive Industry Relevance
Visualizing cranial neural crest cell dynamics in zebrafish provides a predictive model for mechanistic de-risking in craniofacial target validation. The sox10:kaede transgenic system enables high-resolution temporal tracking of migration and differentiation events relevant to human facial morphogenesis. This approach supports early discovery by linking genetic perturbations to phenotypic outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by tracing cranial neural crest contributions to maxillary and mandibular elements.
- Operational Value: Enables precise lineage restriction via photoconvertible kaede reporter, reducing labeling ambiguity compared to dye injection.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening of craniofacial mutants to assess target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative spatiotemporal data on cell migration and tissue convergence for assay standardization.
- Operational Value: Produces reproducible time-lapse outputs compatible with high-content imaging pipelines.
- Scalability: Adaptable to any kaede or photoconvertible reporter in transgenic zebrafish for platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Illustrates homology of zebrafish facial prominences to amniotes, enhancing translational relevance.
- Operational Value: Captures both normal and abnormal craniofacial development in mutants for phenotypic validation.
- Risk Mitigation: Enables observation of effusion defects modeling human orofacial cleft pathogenesis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing live imaging of neural crest-derived structures prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in cranial neural crest migration and palate formation.
- Screening: Delivers quantitative confocal readouts for assessing compound effects on cell dynamics.
- Analytics: Enables measurement of migration velocity, convergence timing, and tissue boundary formation.
- Translational Research: Connects zebrafish palate development to human craniofacial homologs for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for developmental phenotype assessment across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation through direct visualization of cell fate decisions.
- Operational Value: Standardizes photoactivation and time-lapse protocols for reproducible neural crest tracking.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking genetic targets to observable craniofacial phenotypes.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets based on developmental phenotype severity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, confocal microscopy, and photoconvertible protein handling.
- Dependent on UV-capable confocal systems and agarose embedding infrastructure for embryo immobilization.
- Necessitates standardization of photoactivation duration and z-stack acquisition across users.
- Adaptation considerations include varying promoter-driven reporters and developmental staging across zebrafish strains.
- Practical limitations include phototoxicity from prolonged UV exposure and embryo viability during extended imaging.
