线粒体核样体的特异性标记用于延时结构光照明显微镜观察

该方案可实现对活细胞中线粒体核样体的特异性标记，并以高分辨率对其进行运动的定量研究。仅通过孵育荧光染料即可避免荧光蛋白过表达的需求，从而规避相关的人为假象和局限性，使本方案可应用于不可转染的细胞。为实现核样体的优先染色，应在我们已优化的条件下仅使用SYBR Gold，不得使用其他任何试剂。

否则，可能会染色全部细胞DNA。在标记操作前一天，将4×10⁵个HeLa细胞接种于35毫米培养皿中，加入2毫升培养基进行培养。次日早晨，用2毫升PBS洗涤细胞，然后加入1毫升不含酚红的培养基和1毫升相应的2倍浓度标记溶液。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟后，小心吸除每个35毫米培养皿中含有染料的上清液，并用2毫升PBS洗涤细胞。随后用新鲜的酚红-free细胞培养基喂养细胞，并将培养物放回细胞培养箱中，避光保存直至进行活细胞成像。进行活细胞成像前，至少提前一小时将台式培养箱放置于超分辨率结构光照明显微镜载物台上，将温度设置为37摄氏度，二氧化碳浓度设置为5%。开启显微镜所有组件（包括激光器），并根据显微镜制造商对超分辨率结构光照明显微镜的推荐，选择高放大倍数、高数值孔径的浸油物镜。

激光器预热完成后，将35毫米的培养皿安装到显微镜载物台上，并使用目镜定位培养皿底部附着细胞的兴趣区域。为了获取超分辨率结构光照明显微图像，需使用后端高端电子倍增电荷耦合器件相机。在图像采集软件中，根据相机推荐设置较高的电子倍增增益。

在获取用于类核追踪的时间序列延时图像之前，需对同一视野采集双色超分辨率结构光照明显微图像，其中一通道用于线粒体染色，另一通道用于SYBR gold染色。将线粒体图像通道设置为所用线粒体染料对应的激发和发射波长，并为SYBR gold染料设置相应的激发和带通发射滤光片。两个通道均应使用尽可能低的激光功率。

如果显微镜仅能顺序采集通道，则关闭用于线粒体染料检测的通道。在软件中取消勾选Z-stack选项框，以关闭Z-stack采集，设置为单个焦平面的图像采集，并将相机曝光时间设为尽可能短。设置光栅的三次旋转，对标记的细胞在多个激光功率值和多个曝光时间下采集二维图像，以优化激光功率和相机曝光时间。

选择激光功率和相机曝光时间，以获得线粒体中具有明亮斑点且伪影极少或无伪影的结构照明显微图像，并使用优化后的设置开始采集延时序列图像。为分析延时图像，打开已转换的结构照明显微图像及具备斑点追踪模块的合适图像分析软件，点击“添加新斑点”以启动斑点创建向导。在“创建”选项卡下，点击“随时间追踪斑点”，并进入向导的第二步。

将估计的 x-y 直径设置为 0.1 至 0.15 微米。点击背景减除，然后进入向导的第三步。拖动直方图中的垂直线，调整质量滤波器的阈值，直到大多数核苷酸被检测为亮点，而每个帧内均未检测到伪影。

进入向导的第四步和第五步，选择自回归运动算法。将最大距离设置为 0.5 微米，最大间隙大小设置为零。当精细调整的参数使软件能够正确检测所有荧光点并构建轨迹后，单击“立即箭头”按钮以确认轨迹的生成，并单击统计图标以提取轨迹的统计信息。

然后选择必要的统计参数，点击“另存为”以将数值导出为点 CSV 文件，用于定量和可视化分析。使用高浓度的 SYBR Gold 或 PicoGreen 染色时，细胞核呈现强烈染色，细胞质内出现点状染色。在较低浓度下，细胞核内 SYBR Gold 信号较弱，而在细胞质中可观察到明亮斑点的染色模式。

低浓度PicoGreen标记主要产生细胞核染色。与低浓度SYBR Gold及远红光线粒体染料同时染色显示，几乎所有的SYBR Gold信号均位于线粒体内；而在高浓度下标记，则会导致细胞核和细胞质出现显著染色。时间推移成像显示，45分钟后，类核染色接近饱和。

固定会导致染料轻微重新分布至细胞核，而对固定后的细胞进行通透处理则会消除线粒体的点状染色模式，并增强细胞核的染色。如果在固定和通透处理之后再向细胞中加入SYBR Gold，则染料会在细胞质和细胞核中均匀分布，从而导致染色特异性的丧失。通过超分辨率结构光照明显微镜对活细胞进行三维成像，可揭示线粒体核样体为线粒体内的明亮斑点。

以超越衍射极限的分辨率追踪拟核的位置表明，大多数拟核表现出短距离的随机运动，这些运动可能局限于线粒体网络内。需要注意的是，本方案与样品固定不兼容。然而，我们的方案应适用于多种基于活细胞成像的检测方法，可用于研究分子和细胞器的形态、动态及活性。

本研究阐明了将无机染料重新靶向用于基于细胞技术的优势，可能启发人们探索其他荧光染料在细胞研究中的应用。