膜片钳从花萼电容录音方法

嗨，我叫 Ken Paradiso。我在国家神经疾病和中风校内项目研究所为 Ling Gang Wu 工作，该项目位于贝塞斯达校区的 NIH。我将向您展示 caly 已经举行的突触前记录膜片钳的技术。

所以为了准备脑组织，我们从大鼠身上取出大脑。我们将大脑放入这种溶液中，这将是冰冷的低钙溶液，它会用碳水化合物冒泡，以确保大脑始终有氧气供应。而且它还必须是冰冷的，以最大限度地减少 DA 以最大限度地减少损害。

所以大脑现在将处于这个解决方案中。我们会把它取出来，适当地切割，这样就可以把它放在块上，用 Sano correlate 或疯狂的胶水安装在块上，然后用冰冷的低钙溶液填充腔室，将其泡出，放在振动器上，然后以 70 赫兹的频率和 0.01 至 0.02 毫米/的前进速度切割厚度为 180 至 190 微米的切片第二。所以这将是每秒 10 到 20 微米。

制作出每一片后，我们将切片从冰冷的盐水中转移到这个含有正常钙溶液的腔室中。这与我们记录的溶液相同，它在 37 度的生理温度下。然后我们将切片放入此处进行恢复。

在运行生理学实验之前，它会在这里停留半小时到一个小时。所以这里我有大脑，我要把它从解决方案中拉出来。所以这是一个用于演示目的的更大的大脑。

这是来自 P 20 大鼠。我们会把它翻过来。我们感兴趣的是脑干。

所以这里的这个区域和花萼所在的区域就在那个区域。所以我们要做的是切掉大脑的其余部分，隔离脑干，然后为切片室准备脑干。好了，我们要切掉大脑的其余部分，只隔离出脑干。

我将把它翻过来，以证明我们在哪里。通常我们不会这样做，同样，我们可以去掉那整个部分。把它翻过来，我们已经隔离了脑干，我们只是在那里再做一次切割。

好了，就是这样。这就是脑干。held 的 Calyx 就在那儿。

这就是脑干。同样，我们将它稍微推迟一点。我们要切掉小脑的一侧，这样脑干就会像这样侧向一侧坐着。

我们加入一点 Sano 丙烯酸胶，将其侧向放置，然后迅速用冷冰、冷的低钙溶液填充。尽快将氧气管插入那里。现在我们把它拿起来，带到颤音上。

我们快速进入大脑的起点，然后一旦我们到达大脑的起点，我们就把速度降低到每秒 0.01 毫米。所以它是每秒 10 微秒。所以它以令人难以置信的缓慢速度移动。

大脑的第一部分是具有 mtb 的部分，即梯形体的内侧奈尔斯。这就是包含部分，好的，所以一旦我将其放入移液管中，我就会尝试将其尽可能靠近移液器的尖端。那里有大脑的切片，我相当快地将其转移到这个腔室中，其中包含一个标准的记录溶液，即正常水平的钙和更高的温度。

这将使切片能够在它们从生理学实验中准备好的切片程序后恢复。好的，所以从现在开始，它将一遍又一遍地重复同样的事情。以下设备是我将用于进行膜片钳的设备。

我们有一台固定载物台正置显微镜。正如我所说，载物台是固定的，因此显微镜从机械手上移动到其下方。我们使用假发和 Newman 微型机械手来固定载物台，放大器的头部载物台，我们使用 heca 的 EPC 10 膜片钳放大器。

我还应该提到的是，我们将 DIC 与红外光一起使用。我们这里有一个红外摄像头，因此当我们寻找 CAE 时，我们看到的一切都会在屏幕上看到。膜片钳放大器由这个软件控制，这个软件叫做 Pulse，它也来自 Heca，将控制放大器和所有的生理学实验。

结果将出现在此屏幕上。caly 所持有的是一个大的突触前末梢，因为它很大，它允许我们物理地修补到末端。所以我们可以进行突触前记录，这是一种独特的事情，尤其是在 CNS 中。

因此，这使我们能够测量突触前激活的钙通道。如果我们想刺激通向花萼的神经，我们还可以测量动作电位活动。我们在这个实验室中所做的是测量一个称为胞吐作用的过程，即含有神经递质的囊泡与膜的融合。

现在，在这些囊泡中，在称为胞吐作用的过程中与膜融合，它们将膜添加到突触末端，我们可以将其测量为电容的变化。当膜添加到端子时，我们将得到电容的增加，因此，我今天要展示的实验是电容测量，当膜被移除时，突触前。所以你不能只继续添加膜，你当然必须去除一些。

这个过程称为内吞作用或膜摄取。我们也可以测量它，这将作为电容水平的降低来测量，我们稍后将展示相关示例。现在，这使我们能够做的是监测钙通道活性，并监测一些参与胞吐作用和内吞作用的蛋白质并对其进行研究。

我们可以放入肽之类的东西来阻断参与胞外吞或内吞作用的蛋白质。我们也可以使用做同样事情的毒素。我们还可以调整进入末梢的钙量，这样我们就可以真正研究胞吐过程、神经递质的释放以及该事件后膜的摄取。

这是包含我们的细胞内记录溶液的试管。我们提前准备好，然后冷冻，我们通常可以使用几周到一个月，然后再做出新的解决方案。同样，我们在进行录音之前立即考虑了一下，您总是会得到一定量的灰尘颗粒或其他类型的碎屑，这些碎屑会进入您的电子管。

您可以执行以下两项作之一。您可以将溶液取出并过滤，也可以旋转一两分钟，然后拉出溶液，留下一个底部，里面会有碎屑和其他材料。所以我更喜欢旋转它，我现在就这样做。

所以这是包含我们的细胞内溶液的试管。它已经解冻了。我们要在一个小离心机中将其旋转大约两到三分钟，这应该足以从溶液中去除任何大的灰尘颗粒。

所以现在我只需拉下顶部，我们刚刚旋转的溶液，小心不要搅动它，将其转移到干净的试管中，然后我拉出大约 90% 的溶液。我尽量不再，得到最后一点。所以我就到此为止。

我立即将其放在冰上，以便在实验过程中保持良好和凉爽。这非常重要。这是我们的移液器之一。

我们将其用于细胞内记录。它是厚壁孔硅胶玻璃，外径 2 毫米，内径 1.16 毫米。首先，我们要做的是回填移液器。

因此，我们进行抽吸，将移液器放入记录溶液中，然后进行抽吸，尝试填充移液器的非常非常尖端，否则不会以任何其他方式填充。完成后，我们取一根毛细管并填充电极的其余部分，只需取移液器的背面即可。这是一种标准的生理学技术，实际上是轻弹它。

您有损坏移液器末端的危险，但您也会有，如果不这样做，您经常会有气泡。好了，我们现在把它放在移液器支架上，它连接到贴片设备放大器的头部级。那里有一根氯化银丝。

氯化银丝与细胞内溶液接触，这使我们能够测量突触前末端的电活动。所以我们要做的是找到包含大量 CAE 的切片。我们想要高密度的 CAE。

所以，我们正在寻找梯形体的内侧核，即 MNTB，这就是形成 caly 支撑的末端，或者是 calyx 应用程序，是如何找到的。所以我们要做的是开始扫描 slice。例如，我们有一个离表面有点深的花萼，没有太多需要修补的地方，所以我们就继续扫描我们自己。

所以这是我们要找的花萼。我在屏幕上做了两个标记，这是移液器要去的地方。你可以看到，我要去的那块花萼，吸管会掉下来。

我要施加正压，使其向上推向花萼，然后我要释放正压。然后花萼将向上推向移液器，此时我非常轻柔地吸力，尝试吸吮并推动膜或让膜密封到移液器吸头上。好了，缓解了正压。

现在我要应用吸力。所以，我们是专业人士，我们应用了一个 5 毫伏的脉冲，或者实际上是一个 4 毫伏的脉冲。好，就是这样。好。

现在我们将膜电位降低到负 80，取消快速瞬态繁荣。现在我们要进行整个细胞检查。我将应用轻柔的吸力并尝试批发。

那些充电瞬变表明他是，移液器和电池现在是连续的，他得到了一个批发录音。这是另一个漂亮的镜头。所以较浅的红色是电容走线，你可以看到有一个突然的跳跃，然后它下降了。

好的，我刚刚向你展示了从花萼支撑的突触前末梢获取记录的基本技术。我已经向您展示了如何生成包含梯形体内侧核的切片。那是你会发现花萼的地方。

我已经向您展示了查看切片的技巧。您将遍历每个切片，寻找表面上 caly 数量最多的切片。然后，您将寻找能找到的最大的膜片，并在其上进行膜片钳记录。

我还向您展示了膜片钳记录的技术，这些是标准的膜片钳记录技术。