膜片钳从花萼电容录音方法
July 29th, 2007
嗨，我叫 Ken Paradiso。我在国家神经疾病和中风校内项目研究所为 Ling Gang Wu 工作，该项目位于贝塞斯达校区的 NIH。我将向您展示 caly 已经举行的突触前记录膜片钳的技术。
所以为了准备脑组织，我们从大鼠身上取出大脑。我们将大脑放入这种溶液中，这将是冰冷的低钙溶液，它会用碳水化合物冒泡，以确保大脑始终有氧气供应。而且它还必须是冰冷的，以最大限度地减少 DA 以最大限度地减少损害。
所以大脑现在将处于这个解决方案中。我们会把它取出来，适当地切割，这样就可以把它放在块上，用 Sano correlate 或疯狂的胶水安装在块上，然后用冰冷的低钙溶液填充腔室，将其泡出，放在振动器上，然后以 70 赫兹的频率和 0.01 至 0.02 毫米/的前进速度切割厚度为 180 至 190 微米的切片第二。所以这将是每秒 10 到 20 微米。
制作出每一片后，我们将切片从冰冷的盐水中转移到这个含有正常钙溶液的腔室中。这与我们记录的溶液相同，它在 37 度的生理温度下。然后我们将切片放入此处进行恢复。
在运行生理学实验之前，它会在这里停留半小时到一个小时。所以这里我有大脑，我要把它从解决方案中拉出来。所以这是一个用于演示目的的更大的大脑。
这是来自 P 20 大鼠。我们会把它翻过来。我们感兴趣的是脑干。
所以这里的这个区域和花萼所在的区域就在那个区域。所以我们要做的是切掉大脑的其余部分，隔离脑干，然后为切片室准备脑干。好了，我们要切掉大脑的其余部分，只隔离出脑干。
我将把它翻过来，以证明我们在哪里。通常我们不会这样做，同样，我们可以去掉那整个部分。把它翻过来，我们已经隔离了脑干，我们只是在那里再做一次切割。
好了，就是这样。这就是脑干。held 的 Calyx 就在那儿。
这就是脑干。同样，我们将它稍微推迟一点。我们要切掉小脑的一侧，这样脑干就会像这样侧向一侧坐着。
我们加入一点 Sano 丙烯酸胶，将其侧向放置，然后迅速用冷冰、冷的低钙溶液填充。尽快将氧气管插入那里。现在我们把它拿起来，带到颤音上。
我们快速进入大脑的起点，然后一旦我们到达大脑的起点，我们就把速度降低到每秒 0.01 毫米。所以它是每秒 10 微秒。所以它以令人难以置信的缓慢速度移动。
大脑的第一部分是具有 mtb 的部分，即梯形体的内侧奈尔斯。这就是包含部分，好的，所以一旦我将其放入移液管中，我就会尝试将其尽可能靠近移液器的尖端。那里有大脑的切片，我相当快地将其转移到这个腔室中，其中包含一个标准的记录溶液，即正常水平的钙和更高的温度。
这将使切片能够在它们从生理学实验中准备好的切片程序后恢复。好的，所以从现在开始，它将一遍又一遍地重复同样的事情。以下设备是我将用于进行膜片钳的设备。
我们有一台固定载物台正置显微镜。正如我所说，载物台是固定的，因此显微镜从机械手上移动到其下方。我们使用假发和 Newman 微型机械手来固定载物台，放大器的头部载物台，我们使用 heca 的 EPC 10 膜片钳放大器。
我还应该提到的是，我们将 DIC 与红外光一起使用。我们这里有一个红外摄像头，因此当我们寻找 CAE 时，我们看到的一切都会在屏幕上看到。膜片钳放大器由这个软件控制，这个软件叫做 Pulse，它也来自 Heca，将控制放大器和所有的生理学实验。
结果将出现在此屏幕上。caly 所持有的是一个大的突触前末梢，因为它很大，它允许我们物理地修补到末端。所以我们可以进行突触前记录，这是一种独特的事情，尤其是在 CNS 中。
因此，这使我们能够测量突触前激活的钙通道。如果我们想刺激通向花萼的神经，我们还可以测量动作电位活动。我们在这个实验室中所做的是测量一个称为胞吐作用的过程，即含有神经递质的囊泡与膜的融合。
现在，在这些囊泡中，在称为胞吐作用的过程中与膜融合，它们将膜添加到突触末端，我们可以将其测量为电容的变化。当膜添加到端子时，我们将得到电容的增加，因此，我今天要展示的实验是电容测量，当膜被移除时，突触前。所以你不能只继续添加膜，你当然必须去除一些。
这个过程称为内吞作用或膜摄取。我们也可以测量它，这将作为电容水平的降低来测量，我们稍后将展示相关示例。现在，这使我们能够做的是监测钙通道活性，并监测一些参与胞吐作用和内吞作用的蛋白质并对其进行研究。
我们可以放入肽之类的东西来阻断参与胞外吞或内吞作用的蛋白质。我们也可以使用做同样事情的毒素。我们还可以调整进入末梢的钙量，这样我们就可以真正研究胞吐过程、神经递质的释放以及该事件后膜的摄取。
这是包含我们的细胞内记录溶液的试管。我们提前准备好，然后冷冻，我们通常可以使用几周到一个月，然后再做出新的解决方案。同样，我们在进行录音之前立即考虑了一下，您总是会得到一定量的灰尘颗粒或其他类型的碎屑，这些碎屑会进入您的电子管。
您可以执行以下两项作之一。您可以将溶液取出并过滤，也可以旋转一两分钟，然后拉出溶液，留下一个底部，里面会有碎屑和其他材料。所以我更喜欢旋转它，我现在就这样做。
所以这是包含我们的细胞内溶液的试管。它已经解冻了。我们要在一个小离心机中将其旋转大约两到三分钟，这应该足以从溶液中去除任何大的灰尘颗粒。
所以现在我只需拉下顶部，我们刚刚旋转的溶液，小心不要搅动它，将其转移到干净的试管中，然后我拉出大约 90% 的溶液。我尽量不再，得到最后一点。所以我就到此为止。
我立即将其放在冰上，以便在实验过程中保持良好和凉爽。这非常重要。这是我们的移液器之一。
我们将其用于细胞内记录。它是厚壁孔硅胶玻璃，外径 2 毫米，内径 1.16 毫米。首先，我们要做的是回填移液器。
因此，我们进行抽吸，将移液器放入记录溶液中，然后进行抽吸，尝试填充移液器的非常非常尖端，否则不会以任何其他方式填充。完成后，我们取一根毛细管并填充电极的其余部分，只需取移液器的背面即可。这是一种标准的生理学技术，实际上是轻弹它。
您有损坏移液器末端的危险，但您也会有，如果不这样做，您经常会有气泡。好了，我们现在把它放在移液器支架上，它连接到贴片设备放大器的头部级。那里有一根氯化银丝。
氯化银丝与细胞内溶液接触，这使我们能够测量突触前末端的电活动。所以我们要做的是找到包含大量 CAE 的切片。我们想要高密度的 CAE。
所以，我们正在寻找梯形体的内侧核，即 MNTB，这就是形成 caly 支撑的末端，或者是 calyx 应用程序，是如何找到的。所以我们要做的是开始扫描 slice。例如，我们有一个离表面有点深的花萼，没有太多需要修补的地方，所以我们就继续扫描我们自己。
所以这是我们要找的花萼。我在屏幕上做了两个标记，这是移液器要去的地方。你可以看到，我要去的那块花萼，吸管会掉下来。
我要施加正压，使其向上推向花萼，然后我要释放正压。然后花萼将向上推向移液器，此时我非常轻柔地吸力，尝试吸吮并推动膜或让膜密封到移液器吸头上。好了，缓解了正压。
现在我要应用吸力。所以，我们是专业人士，我们应用了一个 5 毫伏的脉冲，或者实际上是一个 4 毫伏的脉冲。好，就是这样。好。
现在我们将膜电位降低到负 80，取消快速瞬态繁荣。现在我们要进行整个细胞检查。我将应用轻柔的吸力并尝试批发。
那些充电瞬变表明他是，移液器和电池现在是连续的，他得到了一个批发录音。这是另一个漂亮的镜头。所以较浅的红色是电容走线，你可以看到有一个突然的跳跃，然后它下降了。
好的，我刚刚向你展示了从花萼支撑的突触前末梢获取记录的基本技术。我已经向您展示了如何生成包含梯形体内侧核的切片。那是你会发现花萼的地方。
我已经向您展示了查看切片的技巧。您将遍历每个切片，寻找表面上 caly 数量最多的切片。然后，您将寻找能找到的最大的膜片，并在其上进行膜片钳记录。
我还向您展示了膜片钳记录的技术，这些是标准的膜片钳记录技术。
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概述
本文展示了在哺乳动物中枢神经系统神经末梢Held杯体中进行突触前膜片钳记录的基本技术。该方法专注于准备脑组织以便于准确记录。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 神经生理学
背景
- Held杯体是听觉通路中的一个大型突触。
- 膜片钳技术对于研究突触传递至关重要。
- 突触前记录提供了神经递质释放机制的洞察。
- 维持组织活力对于准确测量至关重要。
研究目的
- 展示突触前膜片钳记录技术。
- 以最小化损伤的方式准备脑组织。
- 为感兴趣于突触生理学的研究者提供一个协议。
使用的方法
- 取出大鼠脑组织。
- 使用冰冷低钙溶液保存组织。
- 持续通入carbogen以确保氧气供应。
- 在Held杯体上应用膜片钳技术。
主要结果
- 成功准备脑组织以进行电生理记录。
- 展示了有效的突触前膜片钳技术。
- 在准备过程中最小化了组织损伤。
- 为未来研究建立了一个可靠的协议。
结论
- 所呈现的技术对于研究突触机制至关重要。
- 适当的组织准备对于获得准确数据至关重要。
- 本研究为突触生理学的进一步研究提供了基础。
常见问题
Executive Industry Relevance
Patch clamp capacitance recordings at the calyx of Held enable direct, quantitative measurement of presynaptic vesicle fusion and membrane retrieval, providing mechanistic insight into neurotransmitter release and synaptic maintenance. This approach supports predictive confidence in target validation for synaptic function and de-risking of early neuropharmacological discovery. The method's ability to resolve both exocytosis and endocytosis in real time positions it as a critical tool for translational neuroscience R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of presynaptic mechanisms underlying neurotransmitter release and uptake.
- Supports functional validation of proteins and pathways involved in exocytosis and endocytosis.
- Facilitates mechanistic de-risking for synaptic targets in CNS drug discovery.
- Provides quantitative readouts for hypothesis-driven target selection.
Screening & Assay Development
- Establishes validated electrophysiological systems for compound screening on synaptic function.
- Delivers reproducible, quantitative capacitance measurements for assay standardization.
- Enables assessment of pharmacological modulation of vesicle dynamics.
- Supports scalability for screening interventions affecting presynaptic processes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of synaptic dysfunction in CNS disorders.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of synaptic targets.
- Enables risk-adjusted advancement of candidates affecting neurotransmitter release or uptake.
- Supports translational biomarker development for synaptic activity.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through lead identification and preclinical validation for CNS targets.
- Discovery Biology: Quantifies vesicle fusion and retrieval to clarify synaptic pathways and de-risk target hypotheses.
- Screening: Provides standardized, reproducible electrophysiological assays for compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative capacitance and current measurements for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to disease-relevant synaptic models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse synaptic target and pathway investigations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in synaptic target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable electrophysiological workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early biological de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires specialized electrophysiology expertise and training in patch clamp techniques.
- Demands access to advanced microscopy, patch clamp amplifiers, and analytical software.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducibility and data integrity.
- Adaptation may be needed for different synaptic models or species.
- Practical limitations include technical complexity and throughput constraints inherent to electrophysiological recordings.
