Name: 封闭的系统使用透氧材料科技HYPERStack船只的细胞培养协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-29T17:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学习使用Corning HYPERStack培养容器进行封闭式贴壁细胞培养的高效接种、培养与收获方法。本方案展示重力灌注接种、气体渗透膜供氧及无菌收获技术，适用于大规模细胞生产。

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作者谨此感谢Lonza Walkersville在封闭系统知识、袋体设计、袋封口机和焊接机的借用，以及按照HYPERStack示意图制作袋体方面提供的帮助。

1. HYPERStack 器皿——透气材料技术背景
<ol>
<li>HYPERStack 培养器是一种多层结构的细胞培养容器，用于封闭系统中的细胞培养，其通过 76.2 微米厚的透气性聚合物膜实现气体交换，以支持细胞代谢。</li>
<li>HYPERStack 培养器与传统的细胞培养容器不同，其内部细胞上方不设“顶空”；相反，该容器不在内部保留用于气体交换的“顶空”，而是在每个培养腔下方设有与外界大气相通的空气空间（称为“气管”空间）。</li>
<li>这种气管空间可确保培养器中每个细胞培养区的细胞获得均等的气体交换。</li>
<li>透气膜在维持无菌环境的同时允许气体交换；所有多层结构中的液体操作均通过单一入口完成。</li>
</ol>
2. HYPERStack 器具组件概述
<ol>
<li>Stackette 是由顶板和透气膜组成的单个细胞培养单元，细胞在此单元内进行培养。</li>
<li>Liquid Manifold 将 HYPERStack 模块内的 12 个 Stackette 层相互连接，模块之间通过管路连接，可形成 multiples of 12 层的培养容器。该管路系统使用户能够对整个容器进行一次性的液体操作。</li>
<li>Air Manifold 同样将 Stackette 各层连接在一起，但在添加液体时用于排出容器内的空气。它包含一条填充管路，用于填充过程中使用。</li>
<li>Tracheal Space 是各 Stackette 层之间的开放空气空间，允许通过每层的透气膜进行气体交换。</li>
<li>Liquid handling tubing 与液体管路系统相连，用于实现所有封闭系统的液体操作。该组件可根据需要进行定制。</li>
<li>Vent tubing 与空气管路系统相连，内置空气过滤器，用于在保持无菌条件的同时释放多余空气。</li>
<li>chase tubing 配备过滤器和夹具，并与液体操作管路相连，用于在填充容器后将液体操作管路中的液体排空。</li>
<li>Corning Stack Manipulator（CSM）是一种操作辅助装置，用于在使用过程中协助将容器准确放置到位。</li>
<li>Filling Wedge 是一种不锈钢辅助工具，用于手动填充 HYPERStack 容器时提供支持。</li>
</ol>
3. HYPERStack 培养容器中所用透气膜的气体扩散结果
<ol>
<li>在具有通气顶空的传统细胞培养系统中，培养基中的氧气在培养3天后平均消耗50%。（图1）</li>
<li>在同一细胞生长系统中，3 mm高度的培养基内，在培养基与顶空交界处的氧浓度梯度比细胞层处高出近50%。（图2）</li>
<li>氧气通过76.2微米透气性聚苯乙烯膜的扩散效率相当于通过2.6 mm培养基的扩散效率。HYPERStack培养装置中使用的透气膜可使气体交换直接发生在细胞层水平。</li>
<li>随着细胞生长至汇合，HYPERStack装置气道空间中的氧气百分比保持恒定。（图3）</li>
</ol>
4. 培养基袋的准备
<ol>
<li>HYPERStack-12 层培养容器需要 1.3L 培养基，HYPERStack-36 层培养容器需要 3.9L 培养基。</li>
<li>在接种装有培养基的袋子之前，如果需要使用血清，应通过管路焊接将血清袋与培养基袋连接，并充分混合。</li>
<li>使用大型袋夹在培养基袋中夹闭约 300 mL 的培养基。这将确保接种的所有细胞在灌装过程中都被使用，而不会残留在培养基袋中。将培养基袋放置在支架上。</li>
</ol>
5. 接种培养基
<ol>
<li>用连接导管的注射器吸取细胞悬液。将装有细胞悬液的注射器上的 3/16" 导管与培养袋进行管路焊接。</li>
<li>将细胞悬液注入培养袋中，并充分混匀。</li>
</ol>
6. 填充操作步骤
<ol>
<li>将接种后的培养基袋与HYPERStack培养瓶的3/8英寸液体操作管路进行管路焊接。（也可使用无菌连接器或多功能连接器（MPC）将培养基袋连接至培养瓶。）</li>
<li>关闭HYPERStack装置上液体操作管路和冲洗管路上的夹具。</li>
<li>将36层HYPERStack培养瓶置于CSM的装载位置；将通气滤膜管钩入CSM上的固定夹中。拧紧盖子，并将CSM移至灌注位置。将培养瓶置于正确的灌注位置后，空气滤膜即处于最高位置，可在灌注过程中防止润湿。10°倾斜角有助于在灌注期间使液体在各层之间平衡分布。将12层HYPERStack培养瓶侧放于灌注楔块上，即为正确的灌注位置。</li>
<li>通过将培养基袋置于与HYPERStack培养瓶相同高度（不可更高）来排出灌注管路中的空气。保持冲洗管夹关闭状态，打开液体操作管夹和培养基袋夹，使液体流入培养瓶内。</li>
<li>使用培养基袋支架抬高培养基袋，以促进细胞悬液流入培养瓶中。</li>
<li>继续灌注直至所有接种的培养基均进入培养瓶，此时培养基袋顶部应仍保留约300 mL培养基。移除培养基袋上的夹具以继续完成灌注。当液体接近上方空气歧管时，通过降低培养基袋位置减缓灌注速度，以防止过度灌注。缓慢将液面升至灌注线位置，随后夹闭液体操作管路。</li>
</ol>
7. 将液体锁定在各层中的分离步骤
<ol>
<li>将 CSM 中的 HYPERStack 培养器移至隔离位置，使两组管路均处于最高位置，并将培养液袋降至低于培养器的高度。可通过一手扶住培养器侧面，另一手提起加液楔的方式，将 HYPERStack-12 层培养器抬升至隔离位置。</li>
<li>保持追加滤器处于直立状态，打开追加管夹。此举将使液体输送管路中的培养液回流至培养液袋中。待管路排空后，关闭培养液袋管路上的管夹。</li>
<li>保持追加管滤器直立，打开 HYPERStack 上液体输送管路的管夹，使残留液体流入培养器并达到平衡。等待 1–2 分钟以完成此过程。</li>
<li>将 CSM 中的 HYPERStack 培养器旋转，使管路位于左侧。将培养器降至 CSM 的装载位置。轻微向左倾斜 HYPERStack-12 层培养器，可便于取出加液楔。关闭追加管和液体输送管上的管夹。</li>
<li>此时可将培养液袋从培养器上移除，也可保持连接，以备后续收获步骤使用。若需保存连接的培养液袋，可将空袋及袋中残留的培养液卷起，并置于 HYPERStack 培养器储物托盘的固定带下方。</li>
<li>将 HYPERStack 培养器转移至培养箱。搬运过程中应注意防止液体进入通气滤膜。可通过将 HYPERStack 的管路端略微向上倾斜来实现。</li>
</ol>
8. 收获方案
<ol>
<li>开始收获操作时，将细胞解离溶液袋和淬灭液袋通过管路焊接连接，形成收获袋组件。确保所有管夹均处于关闭状态。（可用示意图演示）</li>
<li>从培养箱中取出 HYPERStack 器具，松开固定带下方的培养基袋，将其悬挂在袋架上。将器具放入细胞收获模块（CSM）的装载位置，并拧紧盖子以固定器具。将通气管路钩入固定夹中，然后将 CSM 移至灌注位置。</li>
<li>确保袋架上的培养基袋位置低于 HYPERStack；打开培养基袋管路和器具液体处理管路的管夹，使培养基流入连接的收集袋中。</li>
<li>当器具内液体排空约四分之三时，将 CSM 设置调整至最终排空位置。当 HYPERStack 器具及液体处理管路完全排空后，抬高管路以推动残余培养基越过废液袋管路上的管夹，随后关闭液体处理管路和废液袋管路上的管夹。</li>
<li>用收获袋组件通过管路焊接替换废培养基袋，并使用袋架将细胞解离液袋组件提升至高于 HYPERStack 的位置。</li>
<li>将 CSM 置于平衡位置。打开细胞解离溶液管路的管夹，将溶液转移至 HYPERStack 中。转移完成后，关闭液体处理管路和细胞解离溶液管路上的管夹。</li>
<li>将 CSM 移至装载位置。保持水平定位杠杆打开状态，通过转轮轻轻左右摇动器具，使溶液均匀分布于细胞层表面。在摇动过程中，可偶尔将器具返回平衡位置，以确保溶液均匀分布。尽管肉眼可能难以判断各层是否完全覆盖，但解离溶液将在细胞表面均匀分布。当溶液充分分布后，释放 CSM 上的杠杆，将 HYPERStack 锁定在装载位置。在此期间，根据所培养细胞的要求保持相应的解离时间。</li>
<li>当细胞完成脱落时，以浊度变化为参考，将 CSM 移至平衡位置。注意避免细胞过度消化。打开淬灭液袋管夹和 HYPERStack 液体处理管路的管夹，使淬灭培养基进入器具内。转移完成后，关闭 HYPERStack 液体处理管路上的管夹。</li>
<li>将 CSM 返回至装载位置，并保持水平定位杠杆打开，摇动器具使其左右摆动。</li>
<li>使用袋架将收获袋组件的位置降至低于 HYPERStack 的水平。将 CSM 调整至排空位置，打开器具液体处理管路的管夹，将细胞悬液转移回淬灭液袋中。将 CSM 返回至装载位置，使用管路封口器断开收获袋组件与器具的连接。细胞悬液现已准备就绪，可进行后续处理。</li>
</ol>
9. 典型结果
<ul>
<li>当从标准聚苯乙烯表面转换为透气性聚苯乙烯表面时，需要优化收获时间。在 HYPERStack 产品上，细胞倾向于更快地脱落。</li>
<li>在显微镜下观察细胞时，需夹闭通气管和液体操作管路。将 HYPERStack 器具倒置，使歧管朝下，放置在显微镜载物台上。</li>
<li>可采取预防措施以避免使用过程中滤膜被润湿，润湿会导致滤膜失去功能。只要不使 HYPERStack 器具过满，并在夹子打开时保持通气管和冲洗管处于抬高位置，即可避免润湿现象。</li>
<li>夹子闭合时对管路施加的压力会导致管路在夹子打开后仍保持关闭状态。反向捏压管路可使其重新打开。</li>
<li>培养基通过重力流入和流出 HYPERStack 器具的流速，取决于 HYPERStack 器具内培养基液面与培养基容器内液面之间的高度差。高度差越大，流速越快。最大流速受滤膜额定值限制，为 1.5 L/min。</li>
<li>保持 HYPERStack 器具内适当的填充体积，可防止细胞生长腔室中形成气泡。由于取样或在未加湿环境中孵育导致水分蒸发损失，可能产生气泡。取样量、取样频率以及孵育条件将决定最终用户是否需要额外补充液体。</li>
</ul>
<img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig1.jpg" alt="CHO细胞在T175培养瓶中的氧浓度图；以ppm为单位随时间变化的数据分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 标准细胞培养容器中培养基的氧气消耗情况。该图显示了3天内细胞水平处氧气浓度（以mg/L计）的下降趋势。
<img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig2.jpg" alt="T-175培养瓶中的氧气梯度图；氧气浓度随深度变化；数据分析；氧气含量，单位为mg/L。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 标准细胞培养容器中培养基内的氧气梯度。该图显示，在培养基与顶空交界面处的氧气浓度（mg/L）高于细胞层处。
<img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig3.jpg" alt="气管腔内氧气与温度变化图，时间与氧气百分比及温度变化的关系。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. HYPERStack 细胞培养过程中气管腔内的氧气百分比。该图显示，在96小时内，各层之间的氧气百分比（为每层透气膜底部提供气体）保持恒定。这表明细胞在生长至汇合过程中能够持续获取氧气。

HYPERStack 器皿的气体可渗透技术受美国专利 #7745209 保护。 
作者为康宁生命科学公司（Corning Life Sciences, Inc）的雇员，该公司生产本文所用仪器。

HYPERStack 培养容器已成功培养了工程细胞、原代细胞和干细胞。向容器中添加液体可通过无菌袋连接以重力流加液，也可通过从无菌培养基容器中泵送实现。该容器相比具有相同体积占地的堆叠培养板产品，其生长面积增加了2.5倍以上。HYPERStack-12 的生长面积为 6,000 cm2，HYPERStack-36 为 18,000 cm2，HYPERStack-120 则达到 60,000 cm2 的生长面积。通过增加表面积，用户能够从相同的细胞群体或批次中获得更多的细胞，并减少实验变异性。同时，用户还能通过使用更少的容器达到相同的细胞产量，从而节省空间和/或人力；或在不增加人员、洁净室区域或培养箱的情况下提高细胞产量。该系统采用低微粒生成的组装工艺制造，且不使用粘合剂。它是一个封闭系统，预装了管路组件和滤器，经三层包装，提供无菌状态。

<table><tbody><tr><td>1.5L 袋装培养基</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>1350ml 培养基 + 150ml 血清（如需要）</td></tr><tr><td>4.0L 袋装培养基</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>3600ml 培养基 + 400ml 血清（如需要）</td></tr><tr><td>HYPERStack 培养容器-12</td><td>Corning</td><td>10012</td><td></td></tr><tr><td>HYPERStack 培养容器-36</td><td>Corning</td><td>10036</td><td></td></tr><tr><td>灌注楔块</td><td>Corning</td><td>10040</td><td></td></tr><tr><td>堆栈操作器</td><td>Corning</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>HyQtainer 子组件取样装置</td><td>Hyclone</td><td>SH3B0324.01</td><td></td></tr><tr><td>600ml 袋装培养基淬灭液（10% FBS IMDM）</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>600ml 细胞解离溶液</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr></tbody></table>

使用具有透气材料技术的 hyperstack 器具进行封闭式细胞培养的方案

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

当微载体小球不是最佳选择时，大体积贴壁细胞培养目前普遍采用多层板式细胞生长产品。HYPERStack 器具可在封闭系统中实现从现有堆叠板产品的放大培养，并在相同体积占用空间下提供超过 2.5 倍的细胞产量。HYPERStack 器具通过透气材料发挥作用，允许气体交换，从而无需容器内部预留气相空间。由于无需气相空间，细胞生长区域可被最小化以节省空间，从而在相同的体积占用空间内容纳更多层的细胞生长表面积。
对于细胞治疗或疫苗生产等多种应用，细胞培养和收获过程需要使用封闭系统。HYPERStack 培养装置可通过连接培养基袋或其他方式的管路，实现细胞和试剂的添加与移除。
本方案将介绍HYPERStack培养容器中所用透气材料的技术原理、满足细胞代谢需求的气体扩散结果、封闭系统中的细胞培养方案以及多种收获方法。

介绍用于高产量贴壁细胞培养的康宁HYPERStack培养容器及其配件的技术、操作流程和使用方法。本操作流程将展示如何利用封闭式系统容器，相较于现有的堆叠式培养板产品，提高细胞收获量。

使用具有透气材料技术的 HYPERStack 器具进行封闭式细胞培养的方案

当微载体珠不是理想选择时，大体积贴壁细胞培养目前通常采用堆叠式培养板细胞扩增产品进行标准化操作。

本实验的总体目标是演示 Corning Hypers stack 培养容器在封闭系统中的正确使用方法。首先通过重力加液法将培养基接种并注入容器中，随后在每一层中分离细胞悬液，并对细胞进行培养孵育。孵育结束后，移除用过的培养基。该实验方案的最后一步是从超堆叠培养容器中收获细胞。最终获得气体扩散结果，以显示在使用超堆叠封闭系统培养至汇合时，细胞获取氧气的能力。高通量堆叠培养皿采用透气材料的主要优势在于其可为细胞生长提供更大的表面积。通过消除容器中的顶空，我的同事 p pardo 将演示如何使用高通量堆叠培养皿的封闭系统操作流程。高通量堆叠培养皿由多个层（stat）组成，每一层即为一个独立的细胞培养单元，由顶板和透气膜构成。细胞在此隔室内进行培养。液体管路将模块内的各层微流控层连接在一起。通过管路将模块连接，形成由12层的倍数构成的反应容器。该管路系统可让用户对整个容器进行一次性的流体操作。空气管路系统还将各层 stat 层连接在一起，但在添加液体时用于排出容器中的空气，并设有填充线，用于各层之间的填充操作。stat 层是一个开放的空气空间，称作气管空间，可通过每层的透气膜实现气体交换。液体处理管路连接至液体歧管，是一种可定制的组件，用于完成所有封闭系统的液体操作，可在保持无菌条件的同时释放多余空气。使用通气管路。通气管路连接至空气歧管，并配有空气过滤器。与液体处理管路相连的是冲洗管路和滤器，用于在填充容器后将液体处理管路中的液体排出。本实验方案中还使用了康宁堆栈操作器（Corning Stack manipulator，简称CSM），这是一种辅助装置，用于在使用过程中将容器准确放置到指定位置。本演示中，以一种具有36层透气膜的封闭式细胞培养容器为例进行展示。然而，使用CSM时，有关在12层培养瓶上使用加样楔进行此操作的详细步骤可参见随附的书面方案。首先，在接种培养基管之前，准备3.9升袋装培养基。将血清袋与培养基袋连接并充分混合，以获得所需的血清浓度。使用大号袋夹在袋子中夹住约 300 毫升的培养基。这将确保在灌装过程中使用所有接种的细胞，且培养基袋中无残留细胞。将培养基置于袋架上以接种培养基。用细胞悬液填充连接在管路中的注射器。通过管路焊接，将装有细胞悬液的注射器连接到培养基袋上。从注射器到袋子使用三段16英寸以上的管路。将细胞悬液注入培养基袋中并充分混匀。接种后的培养基袋可通过管路焊接或使用多功能连接器，连接至容器的3/8英寸液体处理管路。今天我们将使用管路焊接方法。关闭容器的液体处理管和冲洗管上的夹子。将36层容器放入CSM的装载位置。将通气滤器管钩入CSM上的固定夹中。拧紧盖子，并将 CSM 移至填充位置，使空气过滤器处于最高位置，以防止填充过程中被润湿。10 度的倾斜角度还可在填充过程中使液体在各层之间平衡，并通过填充管路排出空气。将培养基袋与反应器置于同一水平位置，同时保持追加管路夹闭。打开液体处理管夹和培养基袋夹，使液体流入容器。使用培养基袋支架将培养基袋抬高，以帮助细胞悬液流入容器。持续填充容器，直至所有接种的培养基完全进入容器。培养基袋的上部应仍含有 300 毫升培养基。当液体接近上部通气管路时，打开培养基袋上的夹子，继续向容器中灌注。通过降低培养基袋的高度来减缓灌注速度，以防止过度填充。缓慢将液面升至填充线，并夹紧液体处理管路。将CSM中的容器移至隔离位置，使两组歧管均处于最高位置。将培养基袋降至容器高度以下。将追加滤器保持在直立位置，打开追加管夹。这会将液体处理管中的培养基排回至培养基袋中。待管路排空后，关闭培养基袋管路上的管夹。保持chase管过滤器处于直立位置。打开容器液体管路上的夹子，使残留液体流入容器并达到平衡。等待一到两分钟，以完成此过程。接下来，将容器在 CSM 中旋转，使歧管位于左侧。将容器降至 CSM 的装载位置。关闭追加管路和液体处理管路两端的夹具。现在可将培养基袋从容器中移除，也可保持连接以备后续收获步骤使用。若需存放已连接的培养基袋，请将其卷起并置于容器储物托盘的固定带下方。最后，将容器转移至培养箱。在搬运容器时，应注意防止任何液体进入通气滤膜。通过将歧管端略微向上倾斜即可实现此操作。开始收获程序时，将细胞收集管、关联溶液和淬灭袋焊接在一起，形成收获袋组件，并确保所有管路夹具均处于关闭状态。从培养箱中取出容器，将其放入CSM的装载位置。松开固定带下方的培养基袋，并将其悬挂在袋上。随后直立放置，拧紧盖子以固定容器。将通气管路钩入固定夹中，并将CSM移至填充位置。确保培养基袋悬挂在支架上时低于反应容器。打开培养基袋管路及容器液体处理管路的夹子，使培养基流入连接的收集袋中。当容器内液体排空至约四分之三时，将CSM设置更改为最终排空位置。当容器和液体管路为空时，抬起管路，使培养基流过废液袋管路上的夹子。随后关闭液体管路上的夹子和废液袋管路上的夹子。通过管路焊接将废液袋更换为收获袋组件。使用细胞解离袋支架将细胞解离袋组件抬升至高于容器的位置。将CSM置于填充位置。打开细胞解离溶液管夹和收获袋组件夹，将溶液转移至容器中。转移完成后，关闭液体处理管路和细胞解离溶液管路的夹子。接着，在保持水平定位杆打开的状态下，将 CSM 移至装载位置。使用轮子轻轻左右摇动容器，使溶液均匀分布在细胞层上。在摇动过程中，容器偶尔可返回填充位置，以保持溶液的均匀分布。溶液充分分布后，松开CSM上的杠杆，将容器锁定在填充位置。在细胞所需的解离时间内，保持容器处于此位置。以浊度作为判断细胞脱落的依据。细胞脱落后，将 CSM 移至加载位置。打开淬灭袋夹具和液体处理管路夹具，使淬灭介质进入容器。关闭液体处理管路上的夹具。转移完成后，将CSM返回至装载位置，并握住水平定位手柄，使容器左右摆动。利用袋架，将收获袋组件的位置降至容器液面以下。将 CSM 调整至空位。打开容器液体处理管夹，将细胞溶液转移回淬灭袋中。将 CSM 返回至装载位置，并使用管路密封器断开收获袋组件与容器的连接。现在，细胞悬液已准备好用于传统的细胞培养系统。在Headspace条件下，培养基中的氧气在三天内平均消耗约50%。在培养过程中，该数据展示了在同一培养系统中，细胞水平处氧气浓度随时间下降的情况（单位为毫克/升）；在培养基高度为三毫米的情况下，培养基与Headspace交界处的氧浓度梯度比细胞层处高出近50%。图中显示了细胞生长期间高氧堆栈气管空间中的氧气百分比。结果显示，在96小时内，各层之间为每层透气膜底部提供氧气的氧气浓度保持恒定。这证明了细胞在生长至汇合过程中能够持续获取氧气。观看本视频后，您应充分了解如何在封闭系统中填充和收获康宁超堆叠培养容器。

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