Name: 改进的可视化和定量分析，药物使用Micropatterned细胞的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: 学习使用微图案化细胞技术进行药物效应的可视化和定量分析。该方法通过Hela细胞的标准化细胞结构，在低剂量下检测药物效果，提高药物筛选的可靠性和自动化图像分析的效率。

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1. 细胞准备及在微图案上的接种
<ol>
<li>将2个CYTOOchips分别放入6孔板的2个独立孔中，确保在CYTOOchip的右下角可见“CYTOO”字样。 
微图案可使用Cy3或Cy5荧光染料进行标记。本实验所用的CYTOOChips带有Cy3荧光标记的微图案。 
注意：芯片应避光保存。
</li>
<li>通过胰酶消化收集HeLa细胞（约80%汇合度）。在显微镜下检查确认胰酶处理已使细胞充分分散。以300g离心4分钟收集细胞，随后轻柔重悬细胞沉淀。计数细胞，并用完全DMEM/F12培养基稀释至浓度为15,000个细胞/mL。</li>
<li>向每个含有CYTOOchip的孔中加入4 mL（60,000个细胞）细胞悬液。 
注意：应尽量减少移动培养板，避免培养液产生旋转流动，否则会导致细胞向孔中心聚集。</li>
<li>在生物安全柜中静置10分钟使细胞沉降，然后转移至细胞培养箱。10–20分钟后，细胞将开始黏附于微图案上。10分钟后定期在显微镜下观察。</li>
<li>一旦细胞完成贴壁，更换培养基，并按照以下步骤轻柔冲洗盖玻片表面：</li>
<li>保持培养板水平，用移液器从孔的侧边轻柔吸出培养基。 
注意：切勿让芯片干燥，即不可将所有液体完全吸净，应始终保留足够液体以覆盖CYTOOchip。</li>
<li>加入4 mL PBS，然后再次先从芯片中心开始吸液，再移向孔的侧边。按前述方法吸除PBS，避免芯片暴露于空气中。重复该清洗步骤3–4次。</li>
<li>在显微镜下检查是否有漂浮细胞：
<ul>
<li>若仍有大量漂浮细胞，重复清洗步骤。</li>
<li>若仅见极少量细胞，可吸除部分PBS，加入2 mL新鲜培养基，随后吸除并再加入4 mL新鲜培养基，重复两次。</li>
</ul>
</li>
<li>将培养板置于37°C、5% CO2的组织培养箱中，至少孵育3小时，以使细胞在微图案上充分铺展。 
注意：采用此方法，约有10–30%（2,000–6,500个）的微图案会被单个或多个细胞占据。 
注意：细胞在清洗前的黏附时间以及在微图案上完全铺展所需的时间因细胞系而异。</li>
</ol>
2. 	苯比斯塔汀处理
<ol>
<li>将blebbistatin溶于100% DMSO中，配制成17 mM的储存液。再用100% DMSO将储存液稀释至5 mM。最后用培养基进一步稀释，使blebbistatin的终浓度为5 μM，DMSO终浓度为0.1%。</li>
<li>对于对照条件，准备仅含0.1% DMSO的4 mL培养基。</li>
<li>吸除细胞培养液，分别更换为已准备好的4 mL处理组和对照组培养基。</li>
<li>将细胞在37°C条件下孵育1小时。</li>
</ol>
3. 细胞固定与肌动蛋白染色
<ol>
<li>细胞固定的溶液制备 
有关细胞骨架缓冲液（CB）和5% PFA的配制方法，请参见试剂部分。CB特别推荐用于肌动蛋白纤维和微管的荧光标记。
<ul>
<li>配制1×CB-蔗糖：将1 g蔗糖加入2 mL CB中。 
添加蔗糖有助于保持细胞内部结构的完整性。</li>
<li>配制4% PFA-CB-蔗糖：将1 mL 1×CB-蔗糖加入4 mL温热的5% PFA中。 
注意： 该溶液仅可在4°C下保存数天。</li>
</ul>
</li>
<li>PFA固定
<ul>
<li>用镊子夹住CYTOOchip上的CYTOO标志处，将其直接放入6孔板的一个孔中（无需洗涤），孔内预先加入2 mL 4% PFA-CB-蔗糖溶液</li>
<li>在室温下孵育10分钟</li>
<li>移除PFA-CB-蔗糖溶液，并用PBS洗涤一次</li>
<li>加入2 mL 100 mM NH4Cl，室温下再洗涤10分钟，以淬灭残留的PFA交联活性 
注意： 经PFA固定的载片可在4°C的PBS中保存数天，之后再进行细胞器染色用于荧光成像。</li>
</ul>
</li>
<li>使用Triton X-100对细胞膜进行通透处理 
通过去垢剂对细胞进行通透处理，可使抗体或其他探针穿透细胞膜，同时去除部分细胞质中的细胞骨架蛋白，避免其背景信号干扰，从而提高细胞骨架聚合物定位分析的对比度。
<ul>
<li>移除NH4Cl溶液，每孔加入2 mL含0.1% Triton X-100的CB溶液，室温处理3分钟</li>
<li>用2 mL PBS洗涤两次</li>
</ul>
</li>
<li>肌动蛋白染色 
荧光标记的鬼笔环肽（phalloidin）仅结合天然构象的肌动蛋白，用于染色肌动蛋白纤维。
<ul>
<li>加入2 mL PBS中稀释1:2000的FITC标记鬼笔环肽溶液（含1.5% BSA）</li>
<li>室温孵育1小时</li>
<li>用2 mL PBS洗涤一次</li>
</ul>
</li>
<li>细胞核染色
<ul>
<li>加入2 mL Hoechst染色液（PBS中1 μg/mL）</li>
<li>室温孵育3分钟</li>
<li>用2 mL PBS洗涤两次</li>
</ul>
</li>
<li>载片封片
<ul>
<li>用镊子夹住CYTOOchip上的CYTOO标志处，将CYTOOchip转移至标准显微镜载玻片上，滴加25–30 μL Mowiol或其他封片剂进行封片。</li>
</ul>
</li>
</ol>
4. 显微镜设置与自动图像采集
目前存在多种成像软件包，可用于控制显微镜以实现快速自动化的图像采集与显示。本示例使用 Metamorph 成像软件，在配备 CCD Hamamatsu 相机和 Intensilight 汞光纤照明器的 Nikon Eclipse Ti 显微镜上进行自动采集。图像以 20 倍放大倍数在三个波长下采集，分别对应 DAPI（细胞核）、Cy-3（微图形）和 FITC-Phalloidin（肌动蛋白）。每个视野中可视化的微图形数量将根据相机和物镜设置的不同而有所变化。CYTOO 微图形在芯片上以固定的间隔（100 或 130 μm）排列，极大地方便了图像采集。
<ol>
<li>选择20倍放大倍率</li>
<li>打开多维采集（菜单栏中：Apps/Multidimensional Acquisition），并设置实验的各项参数：
<ul>
<li>波长数量：3 </li>
<li>波长类型：DAPI，FITC，Cy3</li>
<li>为每个波长设置曝光时间，首先聚焦于一个细胞视野</li>
<li>每个波长均可执行自动聚焦</li>
<li>选择数据保存位置</li>
</ul>
</li>
<li>选择Cy3波长，并调整相机位置，使12个微图案在相机视野中居中显示（图案排列为4列3行）。</li>
<li>创建一个用于多维采集的期刊运行。创建期刊的步骤如图1所示。</li>
<li>打开扫描台功能（菜单栏：Devices/Stage/Scan Stage）。为以20倍放大倍数获取24张图像（每张图像包含12个微图案），输入6列和4行，间距为-400 μm X 步长和 300 μm Y 步长。在“设置期刊执行”中，上传期刊 MDA.JNL，然后按“扫描”以启动在三个波长下对整个组织块的自动采集。 
注意： 此处所示的 X 和 Y 步长将根据相机视野中存在的微图案数量而变化。根据您的载物台设置，X 和/或 Y 方向可能需要使用负值以实现正确的移动方向。</li>
</ol>
5. 自动化图像处理与分析
现有的图像处理与分析软件包众多。以下所述流程概述了通过为开源程序 ImageJ 编写的两个自定义宏所执行的图像处理与分析步骤。第一个宏 CellRef 用于创建参考细胞，第二个宏 Hypotenuse 用于测量细胞膜的刚性/塌陷程度。这两个宏可通过 <a href="http://www.cytoo.com">www.cytoo.com</a> 索取获取。
<ol>
<li>创建以微图形为中心的三个通道的图像堆栈（宏 CellRef）。 
使用微图形可避免细胞聚集和成团，从而大大简化自动图像处理的第一步——单个细胞的定位与分割。利用荧光标记的微图形图像来定义并划定以微图形为中心的区域，然后将这些区域映射到其他通道获取的图像上并进行裁剪。随后将对应的裁剪图像按各波长组装成图像堆栈。同时，还将三个通道合并生成一个RGB堆栈（图2）。</li>
<li>应用单细胞选择滤波器（宏 CellRef） 
如上所述，10–30%（2000–6500）的微图形被单个细胞或多个细胞占据，其余微图形为空。为了筛选出仅含有单个细胞的微图形图像，该宏会检测每幅图像中的细胞核数量，并从所有堆栈（RGB及各波长）中剔除含有一个以上细胞核或无细胞核的图像（图3）。</li>
<li>使用细胞面积截断滤波器剔除未归一化或未完全伸展覆盖微图形的细胞（宏 CellRef） 
为去除可能逃逸细胞核筛选的分裂期细胞，需在FITC通道（标记肌动蛋白）中应用另一个滤波器。计算细胞面积，并将低于特定阈值（约为间期细胞面积的1/2）的细胞从所有堆栈中剔除。细胞轮廓面积由微图形的尺寸决定。</li>
<li>对细胞图像进行对齐（宏 CellRef） 
经过前述步骤，已筛选出包含单个微图形化细胞的图像。尽管这些图像均以微图形为中心，但彼此之间并不完全对齐。为完成图像处理，使用ImageJ插件（MultiStackReg）基于微图形位置对所有采集的图像及各通道进行重新对齐。此步骤生成对齐后的单个图像堆栈，可用于后续的单细胞分析或构建参考细胞（图4）。</li>
<li>构建参考细胞（宏 CellRef） 
在微图形上培养细胞意味着所有细胞具有相似的形态。这种归一化特性使得大量细胞图像能够精确对齐和叠加。通过对整个堆栈中每幅图像的信号进行累加，可以可视化并测量“平均药物效应”。最终的整体图像，即参考细胞，是图像表征与分析中一种独特且有用的工具，仅可通过微图形化细胞获得（图4）。在ImageJ中，参考细胞通过堆栈中经过滤波和对齐的图像进行投影生成（Image&gt;Stacks&gt;Z-project）。可采用多种投影方式，如平均强度或最大强度投影，但通常选择中值投影，以消除图像堆栈中的主要异常值。为便于结果观察，应用LUT（查找表）将单色图像转换为彩色编码的频率图。</li>
<li>测量与量化感兴趣参数（宏 Hypotenuse） 
本视频文章使用L形微图形，因其可将肌动蛋白细胞骨架组织成单一的主要应力纤维。通过此种方式突出肌动蛋白，可从多个方面评估苯并嘧啶（blebbistatin）对细胞骨架的影响：测量肌动蛋白应力纤维的曲率变化、染色强度、长度或厚度，以及肌动蛋白丝或细胞形态的形态计量学特征变化等。这些参数既可在单个细胞图像上测量，也可直接在最终的参考细胞上进行。 
此处，通过使用名为Hypotenuse的第二个ImageJ宏统计塌陷细胞的数量，来表征5 μM blebbistatin的作用（图7）。简而言之，首先利用L形微图形的阈值图像定义细胞三角形状的理论斜边；随后对肌动蛋白染色图像进行阈值处理，以近似实际细胞形态。然后测量细胞三角形的理论斜边与实际凹陷细胞膜之间的区域面积。当细胞发生塌陷时，理论斜边下方会出现一定面积。通过计算塌陷细胞的百分比，用于比较对照组与处理组条件。</li>
</ol>
6. 代表性结果
图5展示了在1.6-1.8步骤所述关键洗涤操作后即刻以及数小时后，细胞在微图案上的预期形态。在CYTOOchips上培养15分钟后，可见呈圆形的HeLa细胞以相等间距分布，表明细胞已黏附于纤连蛋白微图案上（图5a）。当细胞在轻轻摇动培养容器后仍保持固定不动时，说明黏附过程已完成。为了减少多个细胞占据同一微图案的情况，随后用PBS冲洗芯片，以去除漂浮在抗细胞黏附区域上方的细胞。数小时后，充分伸展的细胞将呈现如图5b所示的形态。
在细胞经漂白菌素处理、固定以及肌动蛋白和细胞核染色后获得的典型单细胞图像如图6所示。通过ImageJ CellRef宏自动采集多幅图像并进行图像处理后，生成一张颜色编码的频率图，显示了所有细胞图像中肌动蛋白强度的平均值（图6c和6f）。对照细胞在未处理与处理条件下的比较结果表明，该方法可便捷地观察目标表型，尤其适用于细胞药物效应的探索。
图7展示了一个关于肌球蛋白抑制剂blebbistatin对细胞作用效果的可能分析示例。该图显示了通过ImageJ Hypotenuse宏检测到的50个对照细胞和50个经5 μM blebbistatin处理的细胞中，发生塌陷的细胞数量（即理论斜边下方存在空白区域的细胞）。经blebbistatin处理的细胞群体中塌陷细胞数量增加，反映出细胞内应力纤维的松弛，以及由于blebbistatin抑制了细胞内肌动球蛋白收缩力而导致的细胞膜张力降低。

<img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig1.jpg" alt="用于多维采集的期刊编辑设置；具有拖放功能的软件界面。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 使用 Metamorph 创建新期刊的流程。
<img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig2.jpg" alt="微图案区域识别与图像堆栈创建示意图；通道：Cy3, DAPI, FITC, RGB." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 自动图像处理流程的流程图。
<img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig3.jpg" alt="图像切片中的细胞核检测过程；Cy3、DAPI、FITC 和 RGB 叠加图像的滤波结果；显微镜成像结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 单个细胞的滤除过程。
<img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig4.jpg" alt="FITC 叠加分析，用于构建肌动蛋白参考细胞；细胞成像过程示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 
图 4. 构建参考细胞。
<img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig5.jpg" alt="生物物理学研究，相差显微镜图像，细胞膜结构，实验结果" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5. 细胞接种。A) 冲洗步骤后贴附于微图案上的Hela细胞（4倍放大）；B) 在L型微图案上完全铺展后的HeLa细胞（10倍放大）。
<img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig6.jpg" alt="显示对照和使用blebbistatin处理条件下细胞骨架变化的细胞形态图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 6"> 
图 6. 对照和药物处理条件下非图案化细胞与微图案化细胞的比较。HeLa细胞接种3小时后，用5 μM blebbistatin处理1小时（下图）或不作处理（上图）。在对照组非图案化细胞（a）中，肌动蛋白组装成多条纤维，而在5 μM blebbistatin处理后这些纤维几乎完全解聚（d）。在L形微图案上，对照组细胞呈现三角形形态（b），并在L形的两个顶点之间形成一条主要的肌动蛋白纤维（应力纤维）。与非图案化细胞（d）相比，blebbistatin在L形微图案化细胞中诱导出显著的表型变化（e）。通过由20个细胞构建的“参考细胞”展示模式，可快速直观地观察药物效应，并实现对照与处理条件之间的比较。与单个细胞类似，对照组“参考细胞”中可见一条清晰且强亮的应力纤维（c），而经blebbistatin处理的细胞则发生塌陷，主要应力纤维消失（f）。
<img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig7.jpg" alt="细胞形态学分析；示意图；肌球蛋白抑制剂对细胞塌陷的影响；统计比较图表。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 7"> 
图7. 使用宏工具Hypothenuse分析肌球蛋白抑制剂（blebbistatin）对细胞作用的示例。在对照组细胞中，有25%的细胞发生塌陷，而在5 μM blebbistatin处理的细胞中，塌陷比例增至三倍，达到75%，反映出肌动球蛋白收缩网络的减弱（n=50个细胞）。

<ol><li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+guides+the+orientation+of+the+cell+division+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix guides the orientation of the cell division axis.</a> Nat Cell Biol. 7, 947-953 (2005).</li>
<li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropy+of+cell+adhesive+microenvironment+governs+cell+internal+organization+and+orientation+of+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19771-19776 (2006).</li>
<li>Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nat Methods. , (2010).</li>
<li>Bischofs, I. B., Klein, F., Lehnert, D., Bastmeyer, M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+network+mechanics+and+active+contractility+determine+cell+and+tissue+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Filamentous network mechanics and active contractility determine cell and tissue shape.</a> Biophys J. 95, 3488-3496 (2008).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li>
<li>Dupin, I., Camand, E., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+cadherins+control+nucleus+and+centrosome+position+and+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Classical cadherins control nucleus and centrosome position and cell polarity.</a> J Cell Biol. 185, 779-786 (2009).</li>
<li>Gomez, E. W., Chen, Q. K., Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+geometry+patterns+epithelial-mesenchymal+transition+via+intercellular+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tissue geometry patterns epithelial-mesenchymal transition via intercellular mechanotransduction.</a> J Cell Biochem. 110, 44-51 (2010).</li>
<li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4872-4877 (2010).</li>
<li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+to+suppress+multipolar+divisions+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes.</a> Genes Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li>
<li>Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 11594-11599 (2005).</li>
<li>Pouthas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+migrating+cells%2C+the+Golgi+complex+and+the+position+of+the+centrosome+depend+on+geometrical+constraints+of+the+substratum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum.</a> J Cell Sci. 121, 2406-2414 (2008).</li>
<li>Thery, M., Jimenez-Dalmaroni, A., Racine, V., Bornens, M., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+theoretical+study+of+mitotic+spindle+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experimental and theoretical study of mitotic spindle orientation.</a> Nature. 447, 493-496 (2007).</li>
<li>Thery, M., Pepin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 63, 341-355 (2006).</li>
</ol>

除Anne Béghin外，所有作者均为CYTOO S.A的员工，该公司生产本文所述的试剂和仪器。

微图形图案的选择
尽管5 μM 旋杯霉素在标准培养基质上的效应几乎无法察觉，但在能够将肌动蛋白集中形成单一主要应力纤维的微图案上，可实现有效的定量分析。这有助于增强对细胞骨架的可视化，从而准确量化旋杯霉素对细胞的作用。在实验设计中，微图案的形状选择至关重要，需根据研究所要突出的表型变化进行设计。
结论
微图案有助于可视化和量化药物效应，尤其是在低浓度条件下。在基于细胞的检测中，用黏附性微图案替代均质平面基底可提高所获得数据的准确性、灵敏度和质量。因此，为获得可靠的统计结果，所需用于分析的细胞数量更少3。黏附性微图案为改进功能研究以及在较低药物浓度下探索表型变化提供了切实可行的机会，从而避免诱发毒性或间接的药物效应。若采用适当的筛选平台，微图案可满足制药公司对改进基因/药物筛选应用的需求。以下引用了一些近期利用微图案分析和量化细胞现象的研究实例3-13。

<table><tbody><tr><td>CYTOOchips 20x20 L-M-FN</td><td>CYTOO</td><td>10-114</td><td>CYTOOchips 可用于吸附您选择的蛋白质</td></tr><tr><td>PBS 1×</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>计数板（Kova 载玻片）</td><td>Prolabo</td><td>71287.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 + Glutamax-I</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>PAA Laboratories</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>青霉素 &amp;amp; 链霉素</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Dutscher</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65838</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>尼康仪器公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1×细胞骨架缓冲液（CB）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MES : M8250 KCl : I2636 MgCl₂ : M2393 EGTA : E3889</td><td>10 mM MES pH 6.1, 138 mM KCl&lt;br/&gt; 3 mM MgCl₂&lt;br/&gt; 2 mM EGTA</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2395</td><td></td></tr><tr><td>PFA 32 %</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>PFA 5%</td><td></td><td></td><td>将10 mL 32% PFA与54 mL CB 1.185X混合</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>PBS片剂</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7806</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5282</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;scht</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Euromedex</td><td>BN0640</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl 0.1M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M11209</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光显微镜 </td><td>尼康仪器公司</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>待补充</td><td>待定</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> http://rsbweb.nih.gov/ij/</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用微图案化细胞改善药物效应的可视化与定量分析

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

迄今为止，大多数高内涵分析（HCA）研究均采用在组织培养处理过的微孔板中、于均质基底上生长的贴壁细胞系进行。在此类条件下，细胞向各个方向铺展和分裂，导致细胞形态、结构和行为存在固有的变异性。整个细胞群体中较高的细胞间差异性阻碍了高内涵分析的成功应用，尤其是在药物开发领域。微图案技术能够使每个细胞的形态和内部极性均一化，为解决这一关键瓶颈提供了巨大机遇1-2。
为了促进微图形化技术的应用与使用，CYTOO 开发了一系列即用型微图形，提供盖玻片和微孔板两种格式。在本视频文章中，我们详细介绍了从细胞接种到 CYTOOchip 微图形上、药物处理、固定与染色，再到自动图像采集、自动图像处理以及最终数据分析等所有步骤的操作方案。通过该示例，我们展示了微图形如何促进基于细胞的检测分析。在均质基底上培养的细胞中，细胞骨架的改变难以量化；而将细胞培养在微图形上时，由于每个细胞的黏附接触位置均系统性地被固定，导致肌动蛋白网络呈现出可重复的组织结构。这种细胞内结构的标准化使得即使是对肌动蛋白细胞骨架产生微小影响的效应也能够被量化，本文所述的一系列操作方案即通过使用肌动蛋白-肌球蛋白相互作用抑制剂——苯并吡喃酮（blebbistatin）——证明了这一点。

能够正常化细胞结构的黏附性微图案可用于提高药物效应检测的灵敏度，改善实验重复性，并简化自动图像采集与分析。该技术将有助于在传统细胞培养支持物上进行的药物/siRNA筛选实验，此类实验通常因细胞间变异性过大而受限。

迄今为止，大多数高内涵分析（HCA）研究均采用在组织培养处理过的均质基质上生长的贴壁细胞系进行……

以下实验的整体目标是展示如何通过在特定黏附性微图案上实现细胞结构和位置的标准化，从而轻松实现图像采集的自动化以及图像处理的简便化，并对药物效应进行灵敏且稳健的定量分析，而这些在传统的玻璃盖玻片支持物上是无法实现的。该目标通过将heli细胞接种于带有L形SI three标记微图案的SI two芯片上实现。细胞会呈现出三角形形态，并在L形的两个末端之间形成一条主要的应力纤维。随后，将图案化排列的细胞用lebos statin处理或不作处理，接着进行固定和染色，以观察肌动蛋白细胞骨架和细胞核。然后使用细胞参考宏（cell ref macro）获取并处理微图形细胞的图像，以生成用于分析的图像堆栈，同时使用斜边宏（hypotenuse macro）对表型进行定量。最终可获得结果显示，低剂量的他汀类药物（BLEs statin）对微图形HELOC细胞具有显著效应，而这种效应在标准细胞培养条件下是无法检测到的。您好，欢迎。今天我们在这里向您逐步介绍我们的实验方案，说明如何使用黏附性微图案进行细胞分析，并向您展示实验数据，以说明如何在这些黏附性微图案上轻松量化极低剂量的药物。当您首次看到这些微图案时，您将立即理解它如何解决细胞分析过程中图像采集的变异性问题。因为通过将细胞排列成高度有序的阵列，类似于微阵列，您可以轻松地逐个移动显微镜载物台，从而以逐步方式进行图像采集。但微图案的优势当然不仅限于此。它还能带来更多的改进，因为在某些典型的微图案（如十字形或Y形）上，我们实际上能够使细胞内部结构趋于标准化，即细胞器、有丝分裂纺锤体、细胞骨架以及不同的蛋白质网络在各个细胞中的位置或方向都保持一致，这使得预测和量化药物对这些特定模式的影响变得更加容易。这一点可能与传统培养皿或微孔板中的常规操作方式截然不同，看似违反直觉。这是因为，通常情况下，你会观察到细胞四处移动并呈现出不同的形态。而在黏附性微图案上，所有细胞都会开始变得相似，因为它们会对这种黏附性微图案产生响应，并以相同的方式组织其内部结构。这看似可能有些人为造作，但当你仔细思考时，培养皿本身难道不是更加人为的环境吗？因为在组织中，细胞受到邻近细胞以及细胞外基质的限制，因此它们接收到了大量的空间信息，这些信息决定了细胞结构的取向。而利用微图案来模拟这种现场效应，正是我们正在开展的工作。我们正在将这种空间信息恢复到细胞中，所有细胞都会对此作出响应，并以相同的方式进行组织。现在由于所有细胞外观相似，我们可以引入“参考细胞”的概念，即可以对所有图像进行平均，从而获得一幅单一图像，该图像能够真实代表细胞在特定条件下的形态。随后，您可以加入药物，再次观察该参考细胞，查看药物如何改变细胞的形态或结构组织。将两个situ two芯片分别放入六孔板的两个独立孔中，确保situ two标志清晰可读。本实验所用的situ two芯片带有经FibroGen SI three染色的微图案，使用前应避光保存。用胰蛋白酶收集约80%融合的HeLa细胞，并在显微镜下检查其是否充分单细胞化，随后在300 ×g条件下离心4分钟，轻柔重悬细胞，计数后将细胞稀释至浓度为15,000个细胞/毫升。在不完全的 D-M-E-M-F 12 培养基中，每孔接种 60,000 个细胞。操作过程中应尽量减少培养板的移动，以避免培养基产生旋转运动，否则会导致细胞向孔中心聚集。将细胞在生物安全柜中静置沉降 10 分钟后，转移至细胞培养箱中。在细胞培养箱中孵育10至20分钟内，细胞将在10分钟后开始贴壁，需定期在显微镜下观察细胞是否已贴附。通过重复以下操作四次，更换细胞培养基并去除多余的细胞。保持培养板水平，从孔的侧边轻轻吸出培养基。注意保留足够的培养基，避免芯片干燥。加入 4 mL PBS，从芯片中央开始吸液，然后移至孔的侧边，像之前一样吸出大部分 PBS，并在显微镜下检查是否有悬浮细胞。如果仍有大量悬浮细胞存在，请重复洗涤步骤。如果细胞数量很少，吸除部分 PBS，并加入 2 毫升新鲜培养基，重复吸除并加入 4 毫升新鲜培养基两次。将细胞置于细胞培养箱中孵育 3 小时，以使细胞充分铺展。采用该方法时，有10%至30%的微图案会被单个细胞占据，其余图案则为空置或被多个细胞占据。为用BLEs他汀处理细胞，将17毫摩尔的药物储备液用含0.1% DMSO的培养基稀释至终浓度为5微摩尔，总体积为4毫升。对照组则制备仅含0.1% DMSO的培养基，吸除细胞培养液后，迅速加入BLEs他汀溶液或对照溶液，以避免芯片干燥。将细胞在 37 摄氏度下孵育一小时。孵育期间，配制细胞骨架缓冲液。将一克蔗糖加入两毫升 cb 中。这有助于保存细胞内部结构。将1毫升CB蔗糖溶液与4毫升5% PFA混合。向CB蔗糖溶液中加入2毫升PFA。在一块新的六孔板的两个孔中。使用镊子夹取CY2芯片，并将其放入含有2毫升PFA与CB蔗糖溶液的六孔板中，以固定细胞。在室温下孵育细胞10分钟，移除PFA，用PBS洗涤细胞一次，随后用2毫升100毫摩尔氯化铵溶液洗涤细胞10分钟。为了淬灭残留的PFA交联活性，加入含有0.1% Triton X-100的2毫升PBS，作用3分钟以透化细胞，用PBS洗涤两次，然后在含1.5% BSA的PBS中加入2毫升ZI偶联的荧光染料（1:2000稀释），用于染色肌动蛋白纤维，室温孵育1小时。随后用2毫升PBS洗涤细胞一次。接下来，对细胞核进行染色。加入2毫升浓度为1毫克/毫升的PBS稀释液，室温孵育3分钟。用2毫升PBS洗涤两次。使用25至30微升封片剂（如al）将两个芯片固定在标准载玻片上。为了在三个波长下获取图像，我们使用 Metamorph 成像软件和一台 NIK icon eclipse T 显微镜，该显微镜配备 CCD Hema Matsu 相机和高强度汞灯光纤照明器。首先选择 20 倍放大倍数。接下来在菜单栏中，打开多维采集以设置实验的不同参数。首先，指定保存数据的位置。将波长数量设置为三个，选择SI三波长，并放置盖玻片，使12个微图案位于相机视野中心。每个视野中观察到的微图案数量会因相机和物镜配置的不同而有所变化。设置每个波长的曝光时间并进行自动聚焦。对于 PS 三，创建一个运行多维采集的实验记录，并将其保存为 MDA jnl。打开扫描台功能，以采集 24 张图像，每张图像包含 12 个微图案。在设置实验记录中输入 6 列和 4 行，x 步长为 -400 微米，y 步长为 300 微米，执行并上传实验记录 MDA jnl，按下扫描以启动在三个波长下 24 张图像的自动采集。在本视频中，L 微米图案被用于诱导形成单个主要的肌动蛋白应力纤维，该纤维支撑细胞的未附着部分，并简化了BLEs他汀类药物对细胞影响的可视化与测量，相较于铺在普通纤连蛋白上的细胞更为简便。为了实现图像的自动处理与分析，我们介绍了两个为开源程序 ImageJ 编写的自定义宏：从一系列原始图像堆栈中，第一个宏提取单个细胞并创建参考细胞；第二个宏则用于测量细胞膜的塌陷程度。第一步是从原始图像中分割出单个细胞。利用荧光标记的微图案图像，界定以微图案为中心的区域，按各波长对图像进行裁剪，并将裁剪后的图像重新组合成各波长对应的图像堆栈。为了筛选出含有单个细胞的微图案，该宏会检测每幅图像中的细胞核数量，并在所有堆栈中剔除包含多个细胞核或无细胞核的图像。最后，使用 ImageJ 插件 Multi-Stack Reg 根据微图案位置对所有采集的图像和所有通道进行重新对齐。此步骤生成单个图像的线性堆栈，可用于单细胞分析或构建参考细胞。在 ImageJ 中，参考细胞是通过对来自堆栈的滤波后且已对齐的图像进行投影而构建的。可采用多种投影方法，但通常选择中位数投影以消除图像堆栈中的异常值。参考细胞是一种独特且有用的工具，仅可通过微图形细胞获得，用于表示和图像分析。为了便于观察，应用查找表（LUT）将单色图像转换为编码的频率图。为了表征他汀类药物对BLEs的作用，使用第二个Image J宏程序分析了细胞的刚性和塌陷情况。简言之，利用L微图案的阈值图像来定义细胞三角形状的理论斜边。随后对肌动蛋白染色图像进行阈值处理，以确定细胞形态。通过测量理论斜边与实际凹陷细胞膜之间的面积差异，来判断细胞是否发生塌陷：位于理论斜边下方面积的细胞被视为已塌陷。通过比较经处理组与对照组中塌陷细胞的数量，表征了5 µM BLEs他汀的作用效果。图中展示了经或未经BLEs他汀处理的L型微图案细胞的典型图像，细胞经固定并染色后进行微图案观察。肌动蛋白和细胞核分别以红色、绿色和蓝色显示。注意BLEs他汀对细胞形态的影响，与对照条件相比。此处展示的是在普通纤连蛋白上孵育后，经BLEs他汀或对照处理的代表性细胞。细胞经固定并染色，其中肌动蛋白和细胞核分别显示为绿色和蓝色。请注意处理组与对照组条件之间的相似性。图中展示了经BLEs他汀处理或未处理的细胞所获得的参照细胞的典型图像。请注意该方法在便于观察所研究表型方面的潜力。以下是利用宏观斜边法分析BLEs他汀对细胞作用的一个示例。在对照组细胞中，有25%发生塌陷，而在5 µM BLEs他汀处理的细胞中，塌陷比例增至三倍，达到75%，反映出肌动蛋白收缩网络的减弱。观看本视频后，您应该能够充分理解黏附性微图案如何解决高内涵分析中的多个瓶颈问题。首先，黏附性微图案的使用使图像采集、处理和分析变得更加简便。其次，微图案能够检测药物在极低剂量下的细微效应，因为通过标准化细胞形态和行为，显著降低了细胞间的变异性。最后，与通常进行细胞分析需要数千个细胞才能获得良好结果相比，使用我们的参考细胞仅需数十个细胞即可获得可靠且具有显著性的结果。

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