利用微图案化细胞改善药物效应的可视化与定量分析

以下实验的整体目标是展示如何通过在特定黏附性微图案上实现细胞结构和位置的标准化，从而轻松实现图像采集的自动化以及图像处理的简便化，并对药物效应进行灵敏且稳健的定量分析，而这些在传统的玻璃盖玻片支持物上是无法实现的。该目标通过将heli细胞接种于带有L形SI three标记微图案的SI two芯片上实现。细胞会呈现出三角形形态，并在L形的两个末端之间形成一条主要的应力纤维。随后，将图案化排列的细胞用lebos statin处理或不作处理，接着进行固定和染色，以观察肌动蛋白细胞骨架和细胞核。

然后使用细胞参考宏（cell ref macro）获取并处理微图形细胞的图像，以生成用于分析的图像堆栈，同时使用斜边宏（hypotenuse macro）对表型进行定量。最终可获得结果显示，低剂量的他汀类药物（BLEs statin）对微图形HELOC细胞具有显著效应，而这种效应在标准细胞培养条件下是无法检测到的。您好，欢迎。

今天我们在这里向您逐步介绍我们的实验方案，说明如何使用黏附性微图案进行细胞分析，并向您展示实验数据，以说明如何在这些黏附性微图案上轻松量化极低剂量的药物。当您首次看到这些微图案时，您将立即理解它如何解决细胞分析过程中图像采集的变异性问题。因为通过将细胞排列成高度有序的阵列，类似于微阵列，您可以轻松地逐个移动显微镜载物台，从而以逐步方式进行图像采集。

但微图案的优势当然不仅限于此。它还能带来更多的改进，因为在某些典型的微图案（如十字形或Y形）上，我们实际上能够使细胞内部结构趋于标准化，即细胞器、有丝分裂纺锤体、细胞骨架以及不同的蛋白质网络在各个细胞中的位置或方向都保持一致，这使得预测和量化药物对这些特定模式的影响变得更加容易。这一点可能与传统培养皿或微孔板中的常规操作方式截然不同，看似违反直觉。

这是因为，通常情况下，你会观察到细胞四处移动并呈现出不同的形态。而在黏附性微图案上，所有细胞都会开始变得相似，因为它们会对这种黏附性微图案产生响应，并以相同的方式组织其内部结构。这看似可能有些人为造作，但当你仔细思考时，培养皿本身难道不是更加人为的环境吗？

因为在组织中，细胞受到邻近细胞以及细胞外基质的限制，因此它们接收到了大量的空间信息，这些信息决定了细胞结构的取向。而利用微图案来模拟这种现场效应，正是我们正在开展的工作。

我们正在将这种空间信息恢复到细胞中，所有细胞都会对此作出响应，并以相同的方式进行组织。现在由于所有细胞外观相似，我们可以引入“参考细胞”的概念，即可以对所有图像进行平均，从而获得一幅单一图像，该图像能够真实代表细胞在特定条件下的形态。随后，您可以加入药物，再次观察该参考细胞，查看药物如何改变细胞的形态或结构组织。

将两个situ two芯片分别放入六孔板的两个独立孔中，确保situ two标志清晰可读。本实验所用的situ two芯片带有经FibroGen SI three染色的微图案，使用前应避光保存。用胰蛋白酶收集约80%融合的HeLa细胞，并在显微镜下检查其是否充分单细胞化，随后在300 ×g条件下离心4分钟，轻柔重悬细胞，计数后将细胞稀释至浓度为15,000个细胞/毫升。

在不完全的 D-M-E-M-F 12 培养基中，每孔接种 60,000 个细胞。操作过程中应尽量减少培养板的移动，以避免培养基产生旋转运动，否则会导致细胞向孔中心聚集。将细胞在生物安全柜中静置沉降 10 分钟后，转移至细胞培养箱中。

在细胞培养箱中孵育10至20分钟内，细胞将在10分钟后开始贴壁，需定期在显微镜下观察细胞是否已贴附。通过重复以下操作四次，更换细胞培养基并去除多余的细胞。保持培养板水平，从孔的侧边轻轻吸出培养基。

注意保留足够的培养基，避免芯片干燥。加入 4 mL PBS，从芯片中央开始吸液，然后移至孔的侧边，像之前一样吸出大部分 PBS，并在显微镜下检查是否有悬浮细胞。

如果仍有大量悬浮细胞存在，请重复洗涤步骤。如果细胞数量很少，吸除部分 PBS，并加入 2 毫升新鲜培养基，重复吸除并加入 4 毫升新鲜培养基两次。将细胞置于细胞培养箱中孵育 3 小时，以使细胞充分铺展。

采用该方法时，有10%至30%的微图案会被单个细胞占据，其余图案则为空置或被多个细胞占据。为用BLEs他汀处理细胞，将17毫摩尔的药物储备液用含0.1% DMSO的培养基稀释至终浓度为5微摩尔，总体积为4毫升。对照组则制备仅含0.1% DMSO的培养基，吸除细胞培养液后，迅速加入BLEs他汀溶液或对照溶液，以避免芯片干燥。

将细胞在 37 摄氏度下孵育一小时。孵育期间，配制细胞骨架缓冲液。将一克蔗糖加入两毫升 cb 中。

这有助于保存细胞内部结构。将1毫升CB蔗糖溶液与4毫升5% PFA混合。向CB蔗糖溶液中加入2毫升PFA。

在一块新的六孔板的两个孔中。使用镊子夹取CY2芯片，并将其放入含有2毫升PFA与CB蔗糖溶液的六孔板中，以固定细胞。在室温下孵育细胞10分钟，移除PFA，用PBS洗涤细胞一次，随后用2毫升100毫摩尔氯化铵溶液洗涤细胞10分钟。

为了淬灭残留的PFA交联活性，加入含有0.1% Triton X-100的2毫升PBS，作用3分钟以透化细胞，用PBS洗涤两次，然后在含1.5% BSA的PBS中加入2毫升ZI偶联的荧光染料（1:2000稀释），用于染色肌动蛋白纤维，室温孵育1小时。随后用2毫升PBS洗涤细胞一次。接下来，对细胞核进行染色。

加入2毫升浓度为1毫克/毫升的PBS稀释液，室温孵育3分钟。用2毫升PBS洗涤两次。使用25至30微升封片剂（如al）将两个芯片固定在标准载玻片上。

为了在三个波长下获取图像，我们使用 Metamorph 成像软件和一台 NIK icon eclipse T 显微镜，该显微镜配备 CCD Hema Matsu 相机和高强度汞灯光纤照明器。首先选择 20 倍放大倍数。

接下来在菜单栏中，打开多维采集以设置实验的不同参数。首先，指定保存数据的位置。

将波长数量设置为三个，选择SI三波长，并放置盖玻片，使12个微图案位于相机视野中心。每个视野中观察到的微图案数量会因相机和物镜配置的不同而有所变化。设置每个波长的曝光时间并进行自动聚焦。

对于 PS 三，创建一个运行多维采集的实验记录，并将其保存为 MDA jnl。打开扫描台功能，以采集 24 张图像，每张图像包含 12 个微图案。在设置实验记录中输入 6 列和 4 行，x 步长为 -400 微米，y 步长为 300 微米，执行并上传实验记录 MDA jnl，按下扫描以启动在三个波长下 24 张图像的自动采集。

在本视频中，L 微米图案被用于诱导形成单个主要的肌动蛋白应力纤维，该纤维支撑细胞的未附着部分，并简化了BLEs他汀类药物对细胞影响的可视化与测量，相较于铺在普通纤连蛋白上的细胞更为简便。为了实现图像的自动处理与分析，我们介绍了两个为开源程序 ImageJ 编写的自定义宏：从一系列原始图像堆栈中，第一个宏提取单个细胞并创建参考细胞；第二个宏则用于测量细胞膜的塌陷程度。

第一步是从原始图像中分割出单个细胞。利用荧光标记的微图案图像，界定以微图案为中心的区域，按各波长对图像进行裁剪，并将裁剪后的图像重新组合成各波长对应的图像堆栈。为了筛选出含有单个细胞的微图案，该宏会检测每幅图像中的细胞核数量，并在所有堆栈中剔除包含多个细胞核或无细胞核的图像。

最后，使用 ImageJ 插件 Multi-Stack Reg 根据微图案位置对所有采集的图像和所有通道进行重新对齐。此步骤生成单个图像的线性堆栈，可用于单细胞分析或构建参考细胞。在 ImageJ 中，参考细胞是通过对来自堆栈的滤波后且已对齐的图像进行投影而构建的。

可采用多种投影方法，但通常选择中位数投影以消除图像堆栈中的异常值。参考细胞是一种独特且有用的工具，仅可通过微图形细胞获得，用于表示和图像分析。为了便于观察，应用查找表（LUT）将单色图像转换为编码的频率图。

为了表征他汀类药物对BLEs的作用，使用第二个Image J宏程序分析了细胞的刚性和塌陷情况。简言之，利用L微图案的阈值图像来定义细胞三角形状的理论斜边。随后对肌动蛋白染色图像进行阈值处理，以确定细胞形态。

通过测量理论斜边与实际凹陷细胞膜之间的面积差异，来判断细胞是否发生塌陷：位于理论斜边下方面积的细胞被视为已塌陷。通过比较经处理组与对照组中塌陷细胞的数量，表征了5 µM BLEs他汀的作用效果。图中展示了经或未经BLEs他汀处理的L型微图案细胞的典型图像，细胞经固定并染色后进行微图案观察。

肌动蛋白和细胞核分别以红色、绿色和蓝色显示。注意BLEs他汀对细胞形态的影响，与对照条件相比。此处展示的是在普通纤连蛋白上孵育后，经BLEs他汀或对照处理的代表性细胞。

细胞经固定并染色，其中肌动蛋白和细胞核分别显示为绿色和蓝色。请注意处理组与对照组条件之间的相似性。图中展示了经BLEs他汀处理或未处理的细胞所获得的参照细胞的典型图像。

请注意该方法在便于观察所研究表型方面的潜力。以下是利用宏观斜边法分析BLEs他汀对细胞作用的一个示例。在对照组细胞中，有25%发生塌陷，而在5 µM BLEs他汀处理的细胞中，塌陷比例增至三倍，达到75%，反映出肌动蛋白收缩网络的减弱。

观看本视频后，您应该能够充分理解黏附性微图案如何解决高内涵分析中的多个瓶颈问题。首先，黏附性微图案的使用使图像采集、处理和分析变得更加简便。其次，微图案能够检测药物在极低剂量下的细微效应，因为通过标准化细胞形态和行为，显著降低了细胞间的变异性。

最后，与通常进行细胞分析需要数千个细胞才能获得良好结果相比，使用我们的参考细胞仅需数十个细胞即可获得可靠且具有显著性的结果。