改进的可视化和定量分析，药物使用Micropatterned细胞的影响
December 2nd, 2010
可用于胶粘剂的微图案，细胞结构正常化，增加检测药物作用的敏感性，改善的重现性和简化自动化图像采集和分析。这种技术将有利于药物/ siRNA的筛选试验，进行常规的细胞培养支持，并因此遭受过度的细胞 - 细胞变性。
以下程序的总体目标是展示在特定粘性微模型上实现细胞结构和位置的标准化如何实现图像采集的自动化和简单的图像处理，以及灵敏和稳健的药物效应定量，这在传统的玻璃盖玻片支架上是无法实现的。这是通过将螺旋细胞接种在 SI 两个芯片上来实现的，这两个芯片带有 L 形 SI 三个标记的微图案。细胞呈三角形，形成跨越 L 两端的主要应力纤维，接下来将模式细胞与 lebos 他汀类药物一起孵育或不处理，然后固定和染色以观察肌动子细胞骨架和细胞核。
然后使用 cell ref 宏获取和处理微模式细胞的图像，以生成用于分析的图像堆栈，并使用斜边宏来量化表型。最终，可以获得显示低剂量 BLEs 他汀类药物对微模式 HELOC 细胞有显着影响的结果，这在标准细胞培养条件下是无法检测到的。嗨，欢迎光临。
我们今天在这里向您介绍我们的实验方案，解释如何使用粘性微模式进行细胞分析，并向您展示实验数据，说明在这些粘性微模式上轻松定量极低剂量的药物。因此，当第一次看到这些微观模式时，您将立即了解它如何解决细胞分析过程中图像捕获中的可变性问题。因为通过拥有真正的单元阵列，就像微阵列一样，您可以轻松地将显微镜载物台从一个单元移动到另一个单元，以便能够逐步捕获图像。
但这当然不是它提供的微模式的唯一优势。它提供了更多的改进，因为事实上，在某些典型的微模式（例如交叉或 Y）上，我们实际上正在使内部细胞结构正常化，这意味着细胞器、有丝分裂纺锤体、细胞骨架和不同的蛋白质网络都位于细胞之间的相同位置或细胞之间的相同方向， 这使得预测和量化药物对这些特定模式的影响变得更加容易。现在，这似乎与通常在经典培养皿或微孔板中所做的作完全违反直觉。
嗯，因为你当然经常看到，细胞四处移动并采用不同的形态。而在粘附性微图案上，所有细胞都会开始看起来相似，因为它们对这种粘附性微图案做出反应并以相同的方式组织它们的结构。这实际上可能看起来有点人工，但当你仔细观察它时，培养皿不是更人工吗？
因为在组织中，细胞受到邻近细胞以及细胞外基质的约束。因此，他们接收到了大量的空间信息，这些信息决定了单元架构的方向。而这个在现场到微图案的广告就是我们正在做的事情。
我们正在将这些空间信息恢复到细胞中，所有细胞都对此做出响应并以相同的方式进行组织。现在，由于细胞都看起来很相似，我们可以引入参考细胞的概念，这意味着我们可以平均所有图像并获得单个图像，这确实代表了细胞在给定条件下的样子。然后，您可以添加一种药物并再次查看该参考细胞，看看它如何响应该药物而改变细胞的形态或组织。
将两个原位二芯片分别放入六孔板的两个独立孔中，确保原位二标志可读。用于本实验的原位 2 芯片具有用 FibroGen SI 3 染色的微图案，使用前应避光保存。收集胰蛋白酶汇合度约为 80% 的 hela 细胞，并在显微镜下以 300 G 离心 4 分钟并复苏，悬浮细胞，轻轻计数并稀释至每毫升 15， 000 个细胞的浓度。
在不完全的 D-M-E-M-F 12 培养基中，每孔分配 60， 000 个细胞。板应尽可能少地移动，以避免在培养基中引入旋转运动，这将倾向于将细胞集中在中心。让细胞在通风橱下沉淀 10 分钟，然后将它们移至细胞培养箱中。
在细胞培养箱中放置 10 至 20 分钟内，细胞将在 10 分钟后开始粘附，当细胞附着时，请在显微镜下定期检查。更换细胞培养基并通过重复以下过程四次去除多余的细胞。保持板平整，从孔的侧面轻轻吸出培养基。
小心保留足够的介质，以免芯片变干。加入 4 毫升 PBS，从芯片中心开始吸出。然后像以前一样移动到孔的一侧吸出大部分 PBS，在显微镜下检查是否有漂浮细胞。
如果残留大量漂浮细胞，请重复洗涤程序。如果存在极少的细胞，则吸出部分 PBS，并用 2 毫升新鲜培养基吸出并加入 4 毫升新鲜培养基，分两次。将细胞在细胞培养箱中孵育 3 小时，以使细胞充分铺展。
使用这种方法，10% 到 30% 的微 pattern 将被单个单元格占据，而其他 pattern 将是空的或被多个 cells 占据。要用 BLEs 他汀类药物处理细胞，请在 4 毫升培养基中用 0.1% DMSO 将 17 毫摩尔药物储备溶液稀释至终浓度为 5 微摩尔。对于对照，制备含有 0.1%DMSO 的培养基，仅吸出细胞培养基，并迅速用 BLEs、他汀类药物或对照溶液替换，以避免芯片变干。
将细胞在 37 摄氏度下孵育 1 小时。在此孵育过程中，准备细胞骨架缓冲液。将 1 克蔗糖加入 2 毫升 cb 中。
这有助于保留内部细胞结构。将 1 毫升 CB 蔗糖与 4 毫升 5% PFA 混合。在 CB 蔗糖溶液中加入 2 毫升 PFA。
在新鲜的 6 孔板的两个孔中。为了固定细胞，使用镊子拾取 CY 2 芯片，并将其放入含有 2 毫升 PFA 的 CB 蔗糖溶液的六孔板中。在室温下孵育细胞 10 分钟，去除 PFA 并用 PBS 洗涤细胞一次，然后用 2 毫升 100 毫摩尔氯化铵洗涤细胞 10 分钟。
为了淬灭残留的 PFA 交联活性，加入 2 毫升含有 0.1%tritton X 100 的 PBS 3 分钟，用 PBS 染色肌动蛋白丝洗涤两次，用 2 毫升 ZI 偶联 fain 在 1 至 2000 的 PBS 中洗涤两次，在 1.5% BSA 和 1.5% BSA 的 PBS 中孵育 1 小时。然后用 2 毫升 PBS 洗涤细胞一次。接下来，维持细胞核。
加入 2 毫升每毫升 1 毫克的 PBS 溶液，并在室温下孵育 3 分钟。用 2 毫升 PBS 洗涤两次。使用 25 至 30 微升的安装解决方案（如 al）将侧面两个芯片安装在标准载玻片上。
为了获取三种波长的图像，我们使用 Metamorph 成像软件和 NIK icon eclipse T 显微镜。配备 CCD Hema Matsu 相机和 intens lite 汞光纤照明器。首先选择 20 倍放大倍率。
接下来，在菜单栏中，打开 Multidimensional Acquisition。设置实验的不同参数。首先指明保存数据的位置。
将波长数设置为 3，选择 SI 3 波长并定位盖玻片，使 12 个微图案在相机视野中居中。每个视场可视化的微图案数量将根据相机和物镜设置而有所不同。设置每个波长的曝光时间并自动对焦。
对于 PS 3，创建一个运行多维采购的日记账，并将其另存为 MDA jnl。打开扫描载物台功能可采集 24 张图像，每张图像包含 12 个微图案。在设定的日志中输入六列和四行负 400 微米 x 步长和 300 微米 y 步长来执行，上传日志 MDA jnl press scan 以开始自动采集三个波长的 24 张图像。
在本视频中，L 微模式用于触发单个主要肌动蛋白应力纤维的形成，该纤维支撑细胞的未附着部分，并简化了与位于普通纤连蛋白上的细胞相比，BLEs 他汀类药物对细胞影响的可视化和测量。对于自动图像处理和分析，我们从一堆原始图像中概述了为开源程序 image J 编写的两个定制宏，第一个宏提取单个单元格并创建参考单元格。第二个宏观测量细胞膜的塌陷。
第一步是从 Raw 图像中分割单个单元格。荧光标记的微图案图像用于去除以微图案为中心的区域，这些区域在每个波长的图像上被裁剪，并为每个波长重新组装成堆栈。为了选择具有单个细胞的微观模式，宏观检测每个图像的细胞核数量，并在所有堆栈中消除那些包含多个细胞核或没有细胞核的
细胞核。最后，使用 image J plugin multi-stack reg 根据微图案位置重新对齐所有采集的图像和所有通道。此步骤会生成单个图像的行堆栈，这些图像现在可用于单个单元格分析或创建参考单元格。在图 J 中，参考单元格是通过从堆栈中投影过滤和对齐的图像来构建的。
可以应用多种投影方法，但通常选择中值投影来消除图像堆栈的异常值。参考单元是一种独特而有用的工具，用于仅通过微图形单元获得的表示和图像分析。为了便于检查，应用了查找表或 LUT 将单色图像转换为编码的频率图。
为了表征 BLEs 他汀类药物的作用，使用第二个图像 J 宏分析了细胞的刚性和塌陷。简而言之，L 微模式的阈值图像用于定义细胞三角形形状的理论斜边。接下来对 acton 染色图像进行阈值处理以定义细胞形状。
然后测量理论斜边和实际凹细胞膜之间的面积差，在理论斜边下方呈现区域的细胞被认为是塌陷的。通过比较处理和对照条件下塌陷细胞的数量来表征 5 微摩尔 BLEs 他汀类药物的影响。用 BLEs 他汀类药物治疗或未处理的 L 微模式细胞的典型图像显示细胞是固定的并染色的微模式。
肌动蛋白和细胞核分别以红色、绿色和蓝色显示。与对照条件相比，注意 BLEs 他汀类药物对细胞形状的影响。此处显示了与 BLEs、他汀类药物或普通纤连蛋白对照孵育后的代表性细胞。
固定细胞并染色，肌动蛋白和细胞核分别为绿色和蓝色。请注意处理条件和受控条件之间的相似性。显示了从用 BLEs 他汀类药物处理或未处理的细胞中获得的参考细胞的典型图像。
请注意这种方法易于观察所研究的表型的潜力。这是使用 macro hypotenuse 分析 BLEs 他汀类药物对细胞影响的示例。虽然 25% 的对照细胞塌陷，但在 5 个微摩尔 BLEs 他汀类药物处理的细胞中，这一比例增加了 75% 的三倍，反映了肌动蛋白收缩网络减弱。
看完这篇文章后，您现在应该很好地了解了胶粘剂微模型如何解决高内涵分析中的几个瓶颈。首先，使用胶粘剂微图案使图像捕获处理分析变得更加简单。其次，微观模式允许在非常低的剂量下检测药物的非常细微的影响，因为您可以通过使它们的形态和行为正常化来减少细胞间的变异性。
最后，与在细胞分析中获得良好结果通常需要的数千个细胞相比，使用我们的参比细胞，您只需要几十个细胞即可获得可靠且重要的结果。
概述
本研究展示了粘附微图案如何能够规范细胞结构，增强药物效应检测，并在自动化图像分析中提高重复性。该技术特别适用于药物和siRNA筛选测定，解决了细胞间的可变性问题。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 药物筛选
- 图像分析
背景
- 传统的细胞培养方法往往导致过度的可变性。
- 粘附微图案为细胞提供空间信息，规范了它们的结构。
- 细胞形态的一致性提高有助于药物效应的定量。
- 细胞定位的均一性促进了图像采集的自动化。
研究目的
- 展示使用粘附微图案进行细胞分析的方法。
- 展示用规范结构的细胞定量药物效应的方法。
- 强调微图案相对于传统培养方法的优势。
使用的方法
- 在特定的粘附微图案上接种Hela细胞。
- 用药物培养细胞并可视化细胞骨架。
- 使用宏命令进行图像处理和分析。
- 比较微图案细胞和标准培养条件下的药物效应。
主要结果
- 使用微图案在低剂量下检测到显著的药物效应。
- 细胞在不同图案中表现出一致的形态和组织。
- 由于细胞排列均匀，图像捕捉的自动化过程变得简单。
- 在标准培养条件下无法检测到这些结果。
结论
- 粘附微图案提高了药物筛选测定的可靠性。
- 细胞结构的规范化提高了药物效应的定量。
- 该方法解决了传统细胞培养中固有的可变性问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
Micropatterned cell systems address a critical bottleneck in high-content analysis by reducing cell-to-cell variability that obscures subtle drug effects. This normalization enables detection of low-dose compound impacts that are undetectable in conventional culture, improving assay sensitivity and reproducibility. The approach supports early-stage target validation and lead identification by providing quantitative, architecture-controlled readouts for cytoskeletal and phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through standardized cellular architecture that reduces noise in phenotypic readouts.
- Operational Value: Supports functional target validation by providing reproducible organization of cytoskeletal elements like actin stress fibers.
- Predictive Value: Increases confidence in target engagement signals by allowing detection of subtle cytoskeletal changes at low drug doses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems with uniform morphology for downstream compound screening.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through consistent cell positioning and internal polarity across micropatterns.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by reducing the number of cells needed for statistically significant results via reference cell analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems by maintaining normalized architecture that mirrors in vivo spatial constraints from extracellular matrix and cell-cell interactions.
- Mechanistic De-risking: Allows quantitative assessment of drug effects on intracellular architecture, reducing ambiguity in mechanism of action.
- Preclinical Model Alignment: Provides a bridge from discovery to preclinical work by generating quantitative, morphology-based phenotypes predictive of cellular response.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early biology through lead identification, where normalized cellular systems improve the reliability of phenotypic screening and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling consistent visualization of cytoskeletal reorganization in response to perturbation.
- Screening: Delivers assay readiness through automated image acquisition and processing enabled by uniform cell positioning on micropatterns.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as hypotenuse-based membrane collapse measurements that allow sensitive comparison of drug-treated versus control conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by generating reproducible phenotypes that align with biomarker-aligned pathway modulation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform technology rather than a single-use technique, adaptable across multiple targets and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through standardized cellular architecture.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability via automated acquisition and reference cell generation from tens of cells rather than thousands.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by enabling detection of low-dose drug effects, reducing false negatives in early screening.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative, architecture-normalized data for lead compound triage.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, micropattern handling, and fluorescence microscopy for proper cell seeding and pattern visualization.
- Depends on instrumentation capable of automated multi-wavelength image acquisition and software supporting custom macro-based processing (e.g., ImageJ).
- Necessitates cross-team standardization of micropattern selection, staining protocols, and analysis thresholds to ensure reproducibility across users and sites.
- Involves adaptation considerations when extending to different cell types or pattern geometries beyond L-shaped actin-fiber-inducing designs.
- Includes practical limitations such as the need for optimized cell density to achieve single-cell pattern occupancy and avoid multiplet or empty patterns.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:10
Introduction
3:52
Cell Preparation and Seeding on Micropatterns
6:14
Blebbistatin Treatment, Cell fixation and Immunofluorescent Staining
8:58
Microscope Setup and Automated Image Acquisition
11:02
Automated Image Processing and Analysis
13:40
Representative Micropattern Imaging Results
14:47
Conclusion
