检测采用ELISA法的母语完整的核小体的翻译后修饰

该程序的总体目标是准确确定从 100 万个细胞中获得的总细胞核小体制备物中翻译后修饰的相对水平。这是通过首先制备哺乳动物细胞的高质量均质培养物来实现的。然后，通过使用 downs、均质器和离心机进行机械破碎，从细胞中分离细胞核。

下一步是通过消化细胞核内存在的染色质并进行一系列低渗提取来获得完整的核小体。最后，使用 ELIZA 测定法和适当的对照来询问核小体，以识别特定的翻译后修饰。最终，可以获得显示核小体样品中存在的特异性修饰的相对水平的结果。

与蛋白质印迹和染色质免疫沉淀等现有方法相比，该技术的主要优点是可以很容易地确定许多核小体修饰状态的整体情况。该方法比蛋白质印迹更灵敏、更准确，并且可以在大多数配备一般分子生物学实验的实验室中进行。这种方法可以帮助回答干细胞和表观遗传学领域的关键问题，例如当主要分化和重编程事件发生时会发生什么。

要开始该程序，首先用每 15 厘米板 3 毫升胰蛋白酶对细胞进行胰蛋白酶茴香化，以提取新鲜胰蛋白酶化的细胞。加入 20 毫升冰冷的 PBS 丁酸盐。将细胞转移至 50 mL 锥形管中，离心管以 1000 RPM 的速度收集细胞 5 分钟，吸出上清液并加入 10 mL 冰冷的 PBS 丁酸盐洗涤，再次以 1000 RPM 离心细胞悬液 5 分钟。

去除上清液，并将细胞沉淀重悬于 4 毫升含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中，如书面方案所述。接下来，将细胞移液到 A 型 B 杵下均质器中，在冰下匀浆 20 次。然后将匀浆转移到冰上的离心管中。

将样品以 2000 G 离心 10 分钟。在 4 摄氏度。删除 super named，其中包含细胞质材料和 resus。

将沉淀悬浮在 2 毫升冰冷洗涤缓冲液 C 中加入蛋白酶抑制剂，将重悬的材料轻轻分层到冷离心管中的 5 毫升 30% 蔗糖垫上。为了在水平吊篮中以 2， 400 G 离心 5 分钟分离细胞核，转子细胞核将迁移穿过垫，细胞碎片保留在界面处。离心后，小心地去除所有液体体积，并将细胞核重新悬浮在 250 微升含蛋白酶抑制剂的冰冷洗涤缓冲液 C 中，将细胞核转移到 1.5 毫升微量离心管中。

要开始分离核小体，向细胞核中加入 3 微升 0.1 摩尔氯化钙，并置于 37 摄氏度的加热块中，直到温度达到平衡。然后在 10 μL 微量 Cocal 核酸酶中加入 2 个单位的微量 Cocal 核酸酶，缓冲，并在 37 °C 下孵育 12 分钟。经常用移液器吸头混合。

孵育后，用 6 微升 0.5 摩尔钠 E-D-T-A-P-H 8 终止反应，并置于冰上冷却。接下来，离心后将样品以 2000 G 离心 4 分钟，弃去 snat 并重悬沉淀。在 300 μL 0.2 毫摩尔或 EDTA 钠中，将样品在冰上孵育 1 小时，偶尔轻轻移液混合。

在 3000 G 下离心 4 分钟后。在 4 摄氏度下，收集上清液，其中含有新的 Fuge 管中的游离核小体，并故意将其他核小体 reus 储存在冰上。像以前一样，将沉淀悬浮在 300 微升 0.2 毫摩尔或 EDT 钠中，并在冰上孵育 1 小时，偶尔轻轻混合。

孵育后，离心样品。再次，将所得 snat 与冰上微量离心管中的剩余样品混合。要开始核小体 Eliza 测定，请加载一个 96 孔 Eliza 板，其中有五个核小体和包被缓冲液的 2 倍连续稀释，从顶部孔中每 50 微升 0.1 微克开始，所有稀释系列应一式三份加载。

请记住仅将带有涂层缓冲液的孔作为对照。第二天将板在 4 摄氏度下孵育过夜。使用洗板机以每孔 200 微升 0.5% 的 20 % PBS 溶液在室温下洗涤板，共 4 次，共 10 分钟。

现在每孔加入 100 μL 封闭溶液，并在室温下在旋转器上孵育 1 小时。孵育后，通过在水槽上快速摇动倒置板来去除封闭缓冲液。接下来，将稀释的一抗以 50 μL/孔的体积加入 5% PSA 的 0.05% 溶液中，在 20 种 PBS 溶液中加入，在室温下在旋转器上孵育溶液 1 小时。

一抗孵育后，像使用洗板机之前一样清洗板。洗涤程序完成后，每孔加入 50 μL 辣根过氧化物酶偶联的二抗，用含 5%BS、A 和 0.5%20 的 PBS 稀释，二抗孵育后，在旋转器上室温孵育 1 小时。像以前一样清洗板。

使用洗板机显影板。向每个孔中加入 50 μL TMB Eliza 底物，并孵育 10 分钟。在室温下，ELIZA 板的孔会变成蓝色，强度与每个孔中存在的核小体修饰量成正比。

好吧，那就停止反应吧。通过每孔添加 50 μL 两种正常硫酸。颜色将变为棕色，以 1500 RPM 离心板 2 分钟以驱散任何气泡。

该板现在已准备好在色标读板机上进行定量。最后，读取 450 纳米的板并导出结果进行分析。一旦掌握，这项技术如果执行得当，可以在两天内完成 开发后。

这项技术为干细胞研究领域的研究人员打开了大门，以探索整个表观蛋白质组水平对分化和重编程事件的表观遗传反应。