Name: 检测采用ELISA法的母语完整的核小体的翻译后修饰 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学习使用核小体ELISA（NU-ELISA）技术检测哺乳动物细胞核小体中的翻译后修饰水平。该方法比传统蛋白质印迹法更灵敏准确，可全面评估染色质修饰状态，为干细胞生物学和表观遗传学研究提供重要工具。

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NU-ELISA 方法的开发得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 RO1AG023687 的支持。

1. 哺乳动物细胞培养 
NU-ELISA 可在任何可在培养条件下生长的哺乳动物细胞类型上进行。我们倾向于制备中等到大批量的细胞，以便获得足量的核小体，用于制备多块加样量相同的ELISA板，从而可使用多种不同抗体（Abs）进行检测。以下培养规模可提供充足的材料：
对于小鼠胚胎干细胞，培养一至两块15 cm的细胞培养板，无需饲养层细胞。 
对于成纤维细胞，培养5至10块15 cm的细胞培养板至细胞汇合。
2. 细胞核的分离
注意：除特别说明外，所有步骤均在冰上进行，并使用预冷的缓冲液。
<ol>
	<li>每块培养板加入 3 ml 胰蛋白酶消化细胞，收集细胞并加入 20 ml 冰冷的 PBS/丁酸盐溶液。在 1000 rpm 条件下离心 5 分钟。</li>
 <li>用 10 ml PBS/丁酸盐溶液重悬细胞，在 1000 rpm 条件下离心 5 分钟。</li>
 <li>用 4 ml 含蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich P-8340）的裂解缓冲液重悬细胞，在冰上使用 B 型杵头进行 20 次 Dounce 匀浆。</li>
 <li>在 4°C 条件下以 2000g 离心 10 分钟。（上清液含有细胞质成分，本实验方案中不需要，但可根据需要保存用于其他用途）。</li>
 <li>用 2 ml 冰冷的洗涤缓冲液 C（含蛋白酶抑制剂）重悬沉淀。</li>
 <li>将重悬的样品铺在 5 ml 30% 蔗糖垫之上，使用摆桶转子在 2400g 条件下离心 5 分钟。细胞核将穿过蔗糖垫，而碎片则留在界面处。</li>
 <li>小心移除所有液体体积，并将细胞核重悬于 250 μl 冰冷的洗涤缓冲液 C 加蛋白酶抑制剂中。</li>
</ol>
3. 通过分离核小体 原位 微球菌核酸酶（MNase）消化
我们采用一种染色质消化的实验方法 原位 通过用MNase灌注细胞核，随后进行低渗处理，使游离的完整核小体进入上清液。 
<ol>
	<li>向样品中加入 3 μl 0.1 M CaCl2，放入 37°C 金属浴中，使其温度升至 37°C。</li>
 <li>加入 2 单位 MNase（微球菌核酸酶，Sigma-Aldrich，用 MNase 缓冲液溶解为 2 单位/10 μl），在 37°C 下孵育 12 分钟，期间频繁使用移液枪头混匀。</li>
 <li>加入 6 μl 0.5 M Na-EDTA（pH 8.0）以终止反应，置于冰上。</li>
 <li>在 2000g 离心 4 分钟，弃上清。将沉淀重悬于 300 μl 0.2 mM Na-EDTA 中，冰上放置 1 小时，期间偶尔轻柔吹打。 （这种低渗条件可使核小体从细胞核中释放出来）。</li>
 <li>在 4°C 下以 3000 g 离心 4 分钟。将含有游离核小体的上清液保留并置于冰上。</li>
 <li>再次用 300 μl 0.2 mM Na-EDTA 重悬沉淀，冰上放置 1 小时，期间偶尔轻柔吹打。</li>
 <li>在 4°C 下以 3000g 离心 4 分钟。保留上清液，并与第 5 步所得的第一次上清液合并。所得的单核小体制备物可分装后于 -80°C 保存。</li> 
</ol>
注意：可通过测量10 μl样品加入990 μl水后的260 nm处吸光度来粗略定量染色质含量。A260=10（已校正1/100稀释倍数）约对应1 mg/ml的染色质。此外，在上述操作过程中，可保留少量样品，后续分析其DNA含量，以监测MNase消化的质量和程度，理想情况下主要含有长度为146 bp的DNA片段。出现梯状条带表明MNase消化不完全。
注意：图1展示了细胞核分离和MNase消化步骤的示意图摘要。
4. 核小体-ELISA（NU-ELISA）
我们检测固定在96孔ELISA微孔板上的天然完整核小体组分中的翻译后修饰。对于每个样本，我们进行一系列2倍稀释，并将这些稀释液以每组三个复孔的方式包被到微孔中。
<ol>
	<li>将核小体用包被缓冲液稀释后，每孔50 μl，于4°C过夜包被MaxiSorp板。建议的核小体系列两倍稀释液从最上排至最下排依次为：0.1 μg、0.05 μg、0.025 μg、0.0125 μg、0.00625 μg、0.00313 μg、0.00156 μg，最下排仅加包被缓冲液（0 μg染色质）。（注意：此步骤需要使用酶标板盖。）</li>
 <li>次日早晨，使用洗板机在室温下用PBS/0.5% Tween-20溶液每孔200 μl洗涤酶标板4次，总洗涤时间为10分钟。</li>
 <li>每孔加入100 μl PBS/0.05% Tween-20/5% BSA，在室温下封闭1小时。</li>
 <li>将酶标板倒置并用力在水槽上方震荡，以去除封闭液。盖好后可于-20°C保存，或直接进入下一步。</li>
 <li>将一抗用PBS/0.05% Tween-20/5% BSA稀释1:1000（或按需稀释），每孔加入50 μl，置于旋转仪上室温孵育1小时。</li>
 <li>使用洗板机在室温下用PBS/0.5% Tween-20溶液每孔200 μl洗涤酶标板4次，总洗涤时间为10分钟。</li>
 <li>加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，用PBS/0.05% Tween-20/5% BSA稀释1:5000（或按需稀释），每孔加入适量体积，室温下置于旋转仪上孵育1小时。</li>
 <li>使用洗板机在室温下用PBS/0.5% Tween-20溶液每孔200 μl洗涤酶标板4次，每次洗涤总时间为10分钟。</li>
 <li>每孔加入50 μl TMB底物溶液，室温避光显色10分钟。每孔加入50 μl 2N H2SO4终止反应，并在450 nm波长下读取吸光度。（提示：读板前可使用酶标板转子以1500 rpm离心2分钟，以消除孔内气泡。）</li>
 <li>将读数导出至电子表格文件，用于定量和统计分析。</li> 
</ol>
试剂
<table border="1">
 <tbody>	
 	<tr>
 	<td>PBS/丁酸盐</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>135 mM NaCl</td>
 </tr>

	<tr>
 	<td>2.5 mM KCl</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>8 mM Na2HPO4</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>1.5 mM KH2PO4</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>10 mM Na-丁酸盐</td>
 </tr> 
 </tbody>
</table>
<table border="1">
	<tbody>
 	<tr>
 	<td>裂解缓冲液</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>250 mM 蔗糖</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>10 mM Tris-HCl, pH 7.4</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>10 mM 丁酸钠</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>4 mM MgCl2</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>0.1% Triton X-100</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>


<table border="1">
	<tbody>
 	<tr>
 	<td>洗涤缓冲液 C</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>250 mM 蔗糖</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>10 mM Tris-HCl, pH 7.4</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>10 mM 丁酸钠</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>4 mM MgCl2</td>
 </tr>
 
 </tbody>
</table>
<table border="1">
	<tbody>
 	<tr>
 	<td>蔗糖垫</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>含30% (w/v) 蔗糖的洗涤缓冲液C</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 	<td>微球菌核酸酶缓冲液</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>5 mM NaPO4 缓冲液，pH 7.0 </td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>0.025 mM CaCl2</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
	<tbody>

 <tr>
 	<td>包被缓冲液 </td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>80 ml 溶液 A + 170 ml 溶液 B + 250 ml dH2O</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>溶液 A: 0.2 M Na2CO3 </td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>溶液 B: 0.2 M NaHCO3</td>
 </tr>
 </tbody>
</table> 
5. 代表性结果
采用NU-ELISA方法，制备一系列完全相同的微孔板，可用于加载以单核小体形式制备的染色质。我们通常制备多块加样相同的微孔板，以便分别使用针对不同组蛋白翻译后修饰（PTM）的特异性抗体（Abs）进行检测。我们还始终制备一块使用可识别组蛋白而不依赖其修饰状态的抗体进行检测的微孔板，作为总染色质上样量的对照。该对照对于后续定量比较来自不同样本的核小体中PTM含量至关重要。为了定量特定染色质样本中PTM的水平，我们采用以下方法对原始吸光度值进行校正：首先，利用未加染色质的对照孔所获得的数值扣除背景信号（背景信号通常可忽略不计）；然后，将PTM特异性信号标准化为使用识别与修饰状态无关的核小体抗体检测的、加样量相同的微孔板所获得的NU-ELISA结果（为此目的，我们曾使用针对组蛋白H2A或H2B的多克隆抗体）。随后，我们计算每种染色质稀释度的均值和方差，并采用ELISA检测中线性区段的数据。此前已有文献详细报道过NU-ELISA的数学与统计分析方法4
<img src="/files/ftp_upload/2593/2593fig1.jpg" alt="细胞核分离流程图：显示微球菌核酸酶（MNase）消化、低渗提取及沉淀保留。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. NU-ELISA 步骤示意图。A. 收获哺乳动物细胞； B. 通过Dounce匀浆法将细胞核从细胞中分离出来， C. 破碎的细胞被加在30% w/v蔗糖垫的上方， D. 离心后，细胞核沉积在沉淀中； E，F。 染色质被消化 原位 通过微球菌核酸酶（MNase）处理为主要生成单核小体； G, H, I通过低渗处理和对残留核物质进行反复离心提取可溶性单核小体。 J. 来自不同样本（本例中标记为样本1和2）的单核小体被依次包被在等量上样的微孔板上，并使用特异性识别组蛋白修饰位点的抗体（PTM特异性抗体）和不依赖组蛋白修饰的抗体（PTM非依赖性抗体）进行检测，以确定染色质的总上样量。 K. 两种样本的PTM含量不同但总体染色质含量相似（通过抗H2B免疫反应性判断），其差异性信号检测水平的示意图。

<ol><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+and+an+epigenetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation and an epigenetic code.</a> Bioessays. 22, 836-845 (2000).</li>
<li>Dai, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epiproteomic+signatures+distinguish+embryonic+stem+cells+from+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells.</a> Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).</li>
<li>Tanasijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+accumulation+of+epigen+etic+heterogeneity+during+human+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture.</a> Epigenetics. 4, 330-338 (2009).</li>
<li>Thomas, J. O. Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThomas%2C+JO+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 12-14 (1998).</li>
<li>Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C. Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThorne%2C+AW+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 38-39 (1998).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

NU-ELISA 提供了一种用于确定特定细胞类型中核小体蛋白质翻译后修饰（PTM）整体状态的方法。NU-ELISA 研究表明，在不同细胞类型的比较中，核小体的整体修饰状态存在差异4。此外，当细胞暴露于表观遗传调控剂（如曲古抑菌素A）或小鼠胚胎干细胞发生分化时，NU-ELISA 检测到的 PTM 谱也会发生变化4。该方法已成功应用于人类胚胎干细胞染色质的研究5。需要注意的是，NU-ELISA 在目前的形式下仅能检测细胞表观基因组总和中存在的 PTM 综合特征。这与全基因组染色质免疫沉淀技术有显著区别，后者可确定特定 PTM 在特定基因位点上的分布情况。

NU-ELISA 实验的初始步骤借鉴了先前从哺乳动物细胞核中分离单核小体的方法6,7。这些改进后的方法能够快速地从哺乳动物细胞中获得高质量且完整的单核小体，所得组分在染色质内容上具有代表性，但同时含有大量其他核内物质。由于该实验使用特异性抗体，因此与需要更高纯度的质谱分析方法不同，NU-ELISA 实验能够较好地耐受非核小体来源的污染物质。然而，NU-ELISA 比蛋白质印迹法更敏感且更具定量性4，因此为检测核小体上的翻译后修饰提供了优于蛋白质印迹和质谱分析的良好替代方案。

<table><tbody><tr><td>微球菌核酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td>配制成每10&amp;#x03BC;l缓冲液含2 U的分装液，于-20&amp;#x00B0;C保存</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp 微孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-135</td><td>粘性板盖也可通过Fisher订购</td></tr><tr><td>自动洗板机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Step TMB-ELISA底物</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34028</td><td>4&amp;#x00B0;C保存，使用前或按说明书要求恢复至室温</td></tr><tr><td>微孔板读板仪</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>大多数比色法微孔板读板仪型号均适用</td></tr></tbody></table>

通过elisa检测天然完整核小体上的翻译后修饰

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

真核生物的基因组以染色质形式存在，其中包含DNA和蛋白质。染色质的基本单位是核小体，每个核小体包含一段146个碱基对的DNA，以及各两个拷贝的组蛋白H2A、H2B、H3和H41。组蛋白的N端尾部富含赖氨酸和精氨酸，可在转录后被乙酰化、甲基化及其他转录后修饰（PTMs）所修饰。核小体的PTM修饰模式可影响与其关联的DNA的转录活性，从而提供一种表观遗传性质的基因调控机制2,3。我们开发了一种称为核小体ELISA（NU-ELISA）的方法，用于定量测定从细胞中提取的核小体的全局PTM特征。与蛋白质印迹法相比，NU-ELISA具有更高的灵敏度和定量能力，适用于探究特定细胞类型的表观蛋白质组状态。本文视频期刊文章展示了执行NU-ELISA分析的详细步骤。

核小体ELISA（NU-ELISA）是一种灵敏且定量的方法，用于检测天然完整核小体制备物中翻译后修饰的全局模式。这些修饰包括组蛋白特定氨基酸残基上的甲基化、乙酰化和磷酸化，因此NU-ELISA可提供一种全局蛋白质组学检测手段，用于分析特定细胞类型的总体染色质修饰状态。

通过ELISA检测天然完整核小体上的翻译后修饰

真核生物的基因组以染色质形式存在，染色质包含DNA和蛋白质。染色质的基本单位是核小体，其含有146 bp的DNA片段缠绕在组蛋白八聚体上。

本实验的总体目标是准确测定从一百万个细胞中提取的全细胞核小体样品内翻译后修饰的相对水平。首先需要制备高质量且均一的哺乳动物细胞培养物，随后通过Dounce匀浆器进行机械破碎并结合离心方法，从细胞中分离细胞核。下一步是通过消化细胞核内的染色质并进行一系列低渗提取，以获得完整的核小体。最后，使用适当的对照通过ELIZA检测分析核小体，以鉴定特定的翻译后修饰。最终可获得结果，显示核小体样品中特定修饰的相对水平。与现有的蛋白质印迹法和染色质免疫沉淀法相比，该技术的主要优势在于能够快速获得多种核小体修饰状态的整体图景。该方法比蛋白质印迹法更灵敏、更准确，并且可在大多数具备常规分子生物学实验条件的实验室中进行。该方法有助于回答干细胞和表观遗传学领域的关键问题，例如在主要的分化和重编程事件发生时会发生什么变化。开始实验操作时，首先用每15厘米培养皿3毫升胰蛋白酶对细胞进行消化，以获得新鲜消化的细胞。加入20毫升预冷的PBS丁酸盐溶液，将细胞转移至50毫升锥形管中，在1000 RPM条件下离心5分钟以收集细胞。吸除上清液后，加入10毫升预冷的PBS丁酸盐溶液重悬细胞，再次在1000 RPM条件下离心5分钟。 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于4 mL含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中，具体操作如书面实验方案所述。接着，用移液器将细胞转移至冰上预冷的Dounce匀浆器（B型杵）中，上下吹打20次进行匀浆。然后将匀浆液转移至冰上的离心管中。在 2000 G 条件下离心样品 10 分钟，温度为 4 摄氏度。弃去上清液，上清液中含有胞质成分和 resus。将沉淀物重悬于2 mL预冷的含蛋白酶抑制剂的洗涤缓冲液C中，轻轻将重悬后的样品铺加到一根预冷离心管中5 mL、30%蔗糖垫上。为分离细胞核，在摆桶转子中以2,400 ×g离心5分钟，细胞核将穿过蔗糖垫，而细胞碎片则留在界面处。离心后，小心移除所有液体体积，并将细胞核重悬于250 µL预冷的含蛋白酶抑制剂的洗涤缓冲液C中，然后将细胞核转移至1.5 mL微量离心管中。开始分离核小体时，向细胞核中加入3 µL 0.1 M氯化钙，置于37 °C金属浴中，直至温度平衡。随后在10 µL微球菌核酸酶缓冲液中加入2单位微球菌核酸酶，混匀后于37 °C孵育12分钟。孵育过程中需频繁使用移液器吸头混匀。孵育结束后，加入6微升0.5摩尔的pH 8.0 EDTA钠盐终止反应，并将样品置于冰上冷却。随后在2000 ×g离心4分钟，离心后弃去上清液，将沉淀物重悬于300微升0.2毫摩尔的EDTA钠盐溶液中，冰上孵育1小时，期间轻轻吹打混匀数次。在4°C条件下，以3000 G离心4分钟后，收集上清液，其中含有游离核小体，转移至新的离心管中，并置于冰上保存，以谨慎重复利用额外的核小体。将沉淀物重悬于300微升0.2毫摩尔的EDTA钠溶液中，操作同前，并在冰上孵育1小时，期间偶尔轻柔混匀。孵育结束后，离心样品。再次将所得上清液与冰上微量离心管中剩余的样品混合。开始进行核小体ELISA实验时，向96孔ELISA板中加入一系列五次两倍倍比稀释的核小体溶液和包被缓冲液，从最上一排孔的0.1微克/50微升开始，每个稀释系列均需设置三个复孔。请记得设置仅含包被缓冲液的孔作为对照。次日，在4°C条件下将酶标板孵育过夜。使用洗板机在室温下用含0.5% Tween-20的PBS溶液洗涤酶标板，每孔200 µL，共洗4次，累计洗涤时间为10分钟。现在每孔加入 100 µL 封闭液，在室温下于旋转摇床上孵育 1 小时。孵育结束后，将板倒置并在水槽上方快速振荡以去除封闭液。接着，每孔加入 50 µL 用含 5% PSA 的 0.05% PBS-Tween 20 溶液稀释的一抗，于室温在旋转摇床上孵育 1 小时。一抗孵育结束后，使用洗板机按照之前的方法洗涤平板。洗板程序完成后，在每孔中加入50 µL用含5% BSA和0.5% Tween-20的PBS稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，置于旋转器上室温孵育1小时。二抗孵育结束后，再次按照之前的方法洗涤平板。使用洗板机进行显色反应。每孔加入50 µL TMB ELISA底物，室温孵育10分钟。ELISA板各孔将呈现蓝色，颜色深浅与每孔中核小体修饰的含量成正比。此时应终止反应，每孔加入50 µL的2 N硫酸。颜色将变为棕色，随后以1500 ×g离心2分钟，以消除任何气泡。此时，该酶标板已可使用比色法酶标仪进行定量检测。最后，在450纳米波长下读取酶标板数据，并导出结果用于分析。若操作得当，掌握该技术后可在两天内完成实验。该技术为干细胞研究领域的研究人员探索整个表观蛋白质组水平上分化和重编程事件的表观遗传学响应打开了大门。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

检测采用ELISA法的母语完整的核小体的翻译后修饰

泛素化是一种由三种酶共同完成的关键翻译后修饰过程。参与该修饰过程的基因突变与多种人类疾病相关。本文中，我们描述了在培养细胞中进行体内（in vivo）以及在试管中进行体外（in...

蛋白质泛素化检测

通过结合天然染色质免疫沉淀与交联染色质免疫沉淀，并联合高分辨率质谱技术，ChroP...

ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

本文描述了可用于表征ATP依赖性染色质重塑酶的生化检测方法，这些方法可评估其以下能力：1）催化ATP依赖性的核小体滑动；2）与核小体底物结合；以及3）以核小体或DNA依赖的方式水解ATP。...

用于分析ATP依赖型染色质重塑酶活性的生化检测方法

本方案概述了一种利用质谱法（MS）全面表征组蛋白翻译后修饰的整合工作流程。该流程包括从细胞培养物或组织中纯化组蛋白、组蛋白衍生化与消化、采用纳米流速液相色谱进行质谱分析，以及数据分析的详细说明。本方案设计可在2至3天内完成。...

使用自下而上质谱法分析组蛋白翻译后修饰的完整工作流程：从组蛋白提取到数据分析

本方案描述了含有不同同位素标记的姐妹组蛋白的核小体的重建方法。同时，在使用预先修饰的组蛋白拷贝后，可生成不对称翻译后修饰的核小体。这些样品可直接用于高分辨率核磁共振（NMR）波谱技术，同时研究姐妹组蛋白上的修饰串扰机制。...

用同位素标记不同的姐妹组蛋白重建核小体

我们提出了一种有效且可重复的方法，用于从胚胎期和出生后脑组织中分离和培养神经前体细胞，以进行组蛋白3第79位赖氨酸二甲基化（H3K79me2）的染色质免疫沉淀（ChIP）——该组蛋白修饰位于组蛋白3的球状结构域内。...

神经前体细胞的分离与培养及组蛋白3赖氨酸79二甲基化标记的染色质免疫沉淀

针对目标蛋白的多种内源性翻译后修饰进行研究可能极具挑战性。本文所述技术采用优化的裂解缓冲液和滤膜系统，并结合特异性靶向特定翻译后修饰的亲和基质，利用单一、简化的系统即可检测目标蛋白的乙酰化、泛素化、SUMO化2/3以及酪氨酸磷酸化修饰。...

利用全面的免疫沉淀富集系统鉴定靶蛋白的内源性翻译后修饰谱

泛素化是一种翻译后修饰，在细胞过程中发挥重要作用，并受到去泛素化的严密调控。这两种反应的异常与人类疾病密切相关。我们提供了使用纯化组分在体外进行泛素化和去泛素化反应的实验方案。...

体外核小体组蛋白泛素化与去泛素化实验

本方案重点介绍了一种改进的方法，用于检测和定量由拓扑异构酶抑制剂和甲醛诱导的DNA-蛋白质交联（DPC）及其翻译后修饰（PTM），包括泛素化、SUMO化和ADP-核糖基化，从而能够研究DPC及其翻译后修饰的形成与修复过程。...

DNA-蛋白质交联及其翻译后修饰的定量检测

基于液相色谱、捕集离子淌度质谱和飞行时间质谱（LC-TIMS-ToF MS/MS）的分析工作流程，用于高置信度和高重复性的“自下而上”组蛋白修饰分析，并依据主要参数（保留时间 [RT]、碰撞截面 [CCS] 和精确质荷比...

使用液相色谱、捕获离子淌度谱和飞行时间质谱进行组蛋白修饰筛选

近期在骨骼过度生长患者中发现人类纺锤体相关蛋白家族成员4（SPIN4）的遗传变异，这是一种新型发育障碍。本文介绍了一种实验方案及新研究成果，描述了在核小体背景下通过生物化学方法鉴定SPIN4结合底物——修饰组蛋白的过程。...

通过肽阵列与天然核小体下拉法鉴定人纺锤蛋白家族成员4（SPIN4）的修饰组蛋白结合底物

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