搭建简易光片显微镜用于 整体 成像 秀丽隐杆线虫 发育

本实验的总体目标是利用荧光光片显微镜对 C Allergan 的发育过程进行成像。首先，需搭建基于光片的显微镜系统，该系统由一台正置显微镜和一组小型光学机械元件组成，用于生成光片。实验的第二步是将胚胎进行固定和装载。

最后的步骤是调整光片至胚胎并记录其发育过程。结果可通过分析三维和延时视频，展示秀丽隐杆线虫发育过程中荧光标记蛋白的动态变化。与共聚焦显微镜等现有方法相比，光片显微镜的主要优势在于能够实现更快的成像速度和更低的光毒性。

第三，该方法有助于深入了解封育过程中的变化，也可应用于其他体系，如油菜或斑马鱼。演示该操作流程将更加清晰明了。

Shales 是我实验室的工程师，Pauline Linac 是 van 实验室的工程师。本节介绍装置的组装过程，该装置组装完成后可保持不变，用于所有实验。将激光器、滤光片、望远镜和潜望镜全部放置在光学平台上后，固定圆柱透镜以生成光片。

调整另一个透镜以对焦。照明物镜的焦点应与检测物镜的物方焦点重合。现在，将光束投射到墙壁或屏幕上，并沿光束轴线移动照明物镜，直至投影的轮廓清晰。

在显微镜设置中包含四线发射滤光片和E-M-C-C-D相机。将第二个手动平移台以垂直方式固定到第一个平移台上。将组件拧紧至现有的显微镜载物台上。

取下设定的柱面透镜照明物镜后，将组件安装到显微镜上，并将照明装置重新放回载物台上。将 qve 持镜架固定在照明光路与检测光路的垂直交汇处。现在，检查光片情况。

将荧光素溶液注入玻璃小瓶中，并将其放置在载物台的支架上。光片应清晰可见，且相对于检测物镜应保持水平并居中。

接下来，移除柱面透镜。通过对照明物镜进行三维平移来优化光片，并采集图像以测量光片的厚度。该厚度取决于物镜的孔径。

然后务必更换柱面透镜。首先，用金刚石划线笔切割一块厚度为1毫米、尺寸为10毫米×20毫米的玻璃。

接下来，向其中一张载玻片的一侧加入 20 微升多聚赖氨酸（poly L lysine），待其干燥后，将其与另一张载玻片并置。固定位置后，在其上滴加一滴 5% 琼脂，并用第三张载玻片压在上面，利用其重量将琼脂摊平。待琼脂干燥后，取下第三张载玻片，并从剩余两张载玻片边缘起始处向未加多聚赖氨酸的载玻片一侧，切割出距离边缘三毫米的琼脂垫。

然后移除固定的载玻片，留下一部分突出的琼脂。在琼脂表面涂布20 µL多聚-L-赖氨酸，并使其自然干燥。现在将GR线虫放入盛有M9培养基的表面皿中，并置于解剖显微镜下。

用解剖刀在秀丽隐杆线虫的阴门水平位置进行切割，从而释放出卵。随后鉴定处于目标发育阶段的胚胎，并用微毛细玻璃吸管收集这些胚胎。将胚胎转移至预制载玻片边缘外侧的琼脂悬臂上，注意应放置在载玻片边缘附近，而非琼脂的边界处。

然后用微毛细移液管在去除液体的同时对胚胎进行排列。通过抽吸，胚胎将粘附于聚赖氨酸上。正确地摆放胚胎位置对于获得良好的记录至关重要，这需要使用具有合适孔径的毛细管。

如果孔太小，将难以释放胚胎；如果孔太大，则难以精确控制泄漏的流量并使胚胎排列整齐。用培养皿中的M9培养基覆盖载玻片，并在放大条件下确认胚胎仍然附着在琼脂上。现在，将带有胚胎的制备好的载玻片固定到适用于vete的样品架上。

该固定装置为实验室自制设备，设计用于适配显微操作仪。接下来，将显微操作仪固定在压电陶瓷载物台上，在明场照明下定位胚胎。然后启动控制声光可调滤波器的软件程序。

过滤相机和载物台。此处使用的软件为自主研发，但也可使用 Micromanager 免费软件。首先，选择激光线。

接下来，沿 x 轴调节载物台，直至光片亮度达到最亮。然后调节另外两个维度 Y 和 Z，直至信噪比达到最佳。每个胚胎可能都需要重复此步骤。

该关键步骤旨在通过调节自由移动的载物台、支撑物以及消除物镜之间的相互关系，以获得胚胎的连续动态模拟和最佳对比度，从而优化信噪比，实现良好的成像记录。现在开始采集延时图像，根据胚胎的荧光强度以及所分析生物学过程的速率，设置激光功率、曝光时间、增益和成像时间间隔。针对Zack。

利用表达组蛋白GFP构建体的秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行成像，设定切片间距及其起始与终止位置。每37秒采集20组切片图像，进行持续2小时的时间序列成像。在表达微管蛋白与GFP融合蛋白以及组蛋白与mCherry融合蛋白的品系中，细胞分裂过程清晰可见。每105秒进行一次记录，每次持续16分钟。

展示了三个时间点的3D渲染图像。有丝分裂纺锤体和凝缩染色体清晰可见，易于追踪细胞分裂过程。在第三种菌株中，APO脂蛋白Vit2与GFP融合，并用mCherry标记细胞膜进行成像。

在13分钟内，每隔27秒采集一组切片图像，共采集10组。快速移动的脂蛋白颗粒易于追踪。此处我们采用更为复杂的方法生成的光片进行成像。

光片可用于进一步提高空间分辨率。