设置简单的轻表为显微镜在托托成像 C。线虫发展
2014年5月5日
本协议描述了一个光片显微镜的建立和实施对C的体内成像线虫胚胎。
该程序的总体目标是使用荧光光片显微镜对 C Allergan 的发育进行成像。这是通过首先设置基于光片的显微镜来实现的，该显微镜由一个正置显微镜和一小组光机械元件组成，以生成光片。该程序的第二步是安装胚胎。
最后一步是将光片调整到胚胎上并记录其发育。结果可以通过分析 3D 和延时视频来显示 CL egan 发育过程中荧光标记蛋白的动力学。与其他现有方法（如共聚焦显微镜）相比，光船显微镜的主要优点是它可以以较低的光毒性实现更快的成像。
第三，这种方法可以提供对密封防止发展的见解。它也可以应用于其他系统，例如 roil 或 zebrafish。演示程序将很清楚。
Shales 是我实验室的工程师，Pauline Linac 是 van 实验室的工程师。本节描述了设置组件，对于所有实验，它可以保持组装状态。一旦激光器、滤光片、望远镜和潜望镜都放置在光学平台上，固定柱面透镜以生成光片。
调整不同的镜头进行对焦。照明物镜的焦点应与检测物镜的物体焦点重合。现在，将光束投影到墙壁或屏幕上，并沿光束轴移动照明物镜，直到投影的轮廓清晰。
在显微镜设置中包括四线发射滤光片和 E-M-C-C-D 相机。以垂直方式将第二个手动翻译阶段固定到第一个阶段。将组件拧到现有的显微镜载物台上。
取下设置好的柱面透镜照明物镜后，将组件放置在显微镜上，然后将照明设置放回载物台上。将 qve 支架安装在照明路径和检测路径的垂直交叉处。现在，检查光片。
用荧光素溶液填充玻璃杯，然后将其放入载物台上的支架中。光片应该是可见的。它应该是水平的，并且相对于检测物镜居中。
接下来，取下柱面透镜。通过照明物镜的 3D 平移优化光片，并获取图像以测量光片的厚度。这取决于物镜的孔径。
然后一定要更换柱面透镜。首先，切割一块 1 毫米厚的玻璃，尺寸为 10 毫米 x 20 毫米。使用钻石记号笔。
接下来，在一侧加入 20 μL 聚 L 赖氨酸，干燥后将其并列到第二张玻片上。在固定位置，加入一滴 5% 琼脂，并用第三张载玻片的重量将其抹平。琼脂干燥后，取出第三张载玻片，并在不含聚 L 赖氨酸的载玻片上从剩余两张载玻片的边缘切下琼脂垫 3 毫米。
然后取出固定的载玻片，留下琼脂的悬垂部分。用 20 微升聚 L 赖氨酸包被琼脂并使其干燥。现在在解剖显微镜下将 GR 蠕虫放入装有 M 9 培养基的手表玻璃中。
用手术刀齐平切割蠕虫到外阴，从而释放卵。然后识别出处于感兴趣阶段的胚胎，并用微量毛细管移液器收集它们。将胚胎转移到琼脂上，悬在准备好的载玻片上，就在载玻片边缘旁边，而不是琼脂的边界上。
然后用微量毛细管移液管对齐胚胎，同时去除液体。通过抽吸，胚胎会粘附在多元醇赖氨酸上。正确定位胚胎以获得良好的记录非常重要，这需要具有正确能力的毛细管。
如果太小，将很难释放胚胎。如果太大，将难以严格控制泄漏的流量和对齐胚胎，在培养皿中用 M 9 培养基覆盖载玻片，并使用放大倍率确认胚胎仍附着在琼脂上。现在，将准备好的带有胚胎的载玻片固定到适合兽医的样品架上。
支架是一个内部制造的装置，旨在适合兽医。接下来，将 vete 固定在 Pizo 电载物台上，并在明场照明下找到胚胎。现在启动控制可调谐声学光学的软件包。
筛选摄像机和舞台。这里的这个软件是内部编写的，但也可以使用 micromanager 免费软件。首先，选择激光线。
接下来，沿 x 轴调整载物台，直到光片处于最亮状态。然后调整其他两个维度 Y 和 Z，直到信噪比达到最佳状态。可能需要对每个胚胎重复此作。
这个关键是优化信号比以获得良好的记录 ly 翻译的自由阶段，支持和消除目标时我只是关系以获得胚胎的 ous 模拟和最佳对比度。现在，采集延时图像根据胚胎的荧光水平和分析的生物过程的速度设置激光功率曝光、时间增益和成像间隔。对于 Zack。
成像将切片之间的距离及其开始和结束位置设置为表达组蛋白 GFP 构建的 c elgan。每 37 秒拍摄 20 个切片堆栈，进行 2 小时的延时成像。在表达与 GFP 融合的微管蛋白的菌株中，细胞分裂清晰可见，他的结石与 m 樱桃融合记录每 16 秒 105 分钟。
3D 渲染在三个时间点显示。有丝分裂纺锤体和浓缩染色体清晰可见，很容易通过细胞分裂进行追踪。在第三种菌株中，与 GFP 融合的 APO 脂蛋白 vit two 通过细胞膜的 mCherry 标记进行成像。
在 13 分钟内，每 27 秒取 10 片切片。快速移动的脂蛋白颗粒很容易跟踪。这里我们使用由更复杂的方法形成的光片来生产。
可以实现光片以进一步提高空间分辨率。
概述
本协议描述了光片显微镜的设置及其在秀丽隐杆线虫胚胎活体成像中的应用。与共聚焦显微镜相比，该方法能够以更快的速度进行成像，并且具有更低的光毒性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 显微镜学
背景
- 光片显微镜为成像生物样品提供了一种独特的方法。
- 该技术特别适用于观察活体胚胎。
- 它在允许快速成像的同时最大限度地减少了光损伤。
- 应用范围延伸到秀丽隐杆线虫以外的各种模式生物。
研究目的
- 使用荧光光片显微镜可视化秀丽隐杆线虫胚胎的发育。
- 分析发育过程中荧光标记蛋白的动力学。
- 展示光片显微镜相对于传统方法的优势。
使用的方法
- 使用光机械元件设置光片显微镜。
- 将胚胎固定在带有琼脂垫的准备好的载玻片上。
- 优化光片对齐以进行成像。
- 进行胚胎的时间序列成像以捕捉发育过程。
主要结果
- 成功成像了秀丽隐杆线虫胚胎中的细胞分裂和蛋白动力学。
- 获得了有丝分裂纺锤体和染色体的3D渲染。
- 展示了跟踪快速移动蛋白的能力。
- 提供了对生物体发育过程的洞察。
结论
- 光片显微镜是一种用于活体成像的强大工具。
- 该方法增强了对胚胎发育的理解。
- 可以适用于其他模式生物的使用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Light sheet microscopy enables high-resolution, low-phototoxicity imaging of whole-organism development, supporting target validation in early discovery by providing quantitative, dynamic phenotypic data. This approach reduces biological uncertainty in preclinical models by allowing longitudinal tracking of cellular processes and protein dynamics in live systems. The method enhances predictive confidence in lead identification by delivering reproducible, scalable imaging outputs compatible with high-content screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through subcellular-resolution visualization of protein dynamics and cell divisions in developing embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing reproducible, quantitative readouts of developmental phenotypes under low-phototoxic conditions.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating longitudinal, multi-parameter datasets that correlate molecular perturbations with developmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, 3D time-lapse imaging with subcellular resolution, enabling reliable compound effect assessment in whole-organism contexts.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through precise light sheet alignment and stabilization, minimizing variability in longitudinal imaging sessions.
- Scalability: Compatible with multi-well observation chambers and automated stage control, supporting medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling consistent phenotypic assessment across model systems using standardized imaging protocols.
- Mechanistic De-risking: Allows direct observation of target engagement effects on developmental processes, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative thresholds for go/no-go decisions based on developmental toxicity and phenotypic normalization metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead optimization, offering a non-destructive, quantitative imaging modality for phenotypic screening and mechanistic studies in whole-organism models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time tracking of fluorescently labeled proteins and cellular structures during embryogenesis.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation, light sheet characterization, and embryo mounting protocols that ensure imaging consistency.
- Analytics: Generates quantitative 3D and time-lapse readouts (e.g., mitotic spindle dynamics, protein trafficking) that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant phenotypic readouts in C. elegans, a validated model for conserved developmental pathways.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular, left-assembled system on an optical table, enabling repeated use across projects with minimal recalibration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, longitudinal observation of protein dynamics and cellular behavior.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized opto-mechanical alignment, slide preparation, and embryo mounting procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of developmental toxicity, reducing late-stage attrition due to unidentified biological risks.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative, imaging-based phenotypic scores that inform advancement decisions across target classes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, fluorescence microscopy, and sample preparation for live imaging.
- Needs stable optical table, laser sources, objectives, translation stages, and EM-CCD or sCMOS camera for detection.
- Demands cross-team standardization of slide preparation, embryo staging, and imaging parameters to ensure reproducibility across users and sites.
- Adaptation considerations include embryo size, optical clearing, and mounting medium compatibility when extending to other model systems (e.g., zebrafish, Drosophila).
- Practical limitations include embryo immobilization efficiency and light sheet uniformity over large fields of view, which may require optimization for longer imaging sessions.
