双分子互补亲和纯化，分离两种相互作用的蛋白质

要使用双分子互补亲和纯化检测和分离一对特定的相互作用蛋白，请将一对双分子荧光互补质粒-转染剂混合物加入含有哺乳动物细胞的培养板中。

一个质粒编码一种相互作用的蛋白质——诱饵蛋白——与报告荧光蛋白片段融合。另一个质粒编码另一种结合蛋白——猎物蛋白——与荧光蛋白的互补片段融合。

孵化。转染剂促进质粒细胞摄取。成功转染的细胞表达细胞膜定位蛋白。

诱饵-猎物蛋白的相互作用使荧光蛋白片段更接近。这导致片段融合和重新折叠，形成功能性荧光蛋白，其荧光可以在荧光显微镜下可视化。

含有非离子去污剂的裂解缓冲液代替培养基，以破坏细胞膜，释放融合蛋白。将细胞裂解物收集在管中。离心机。

含有融合蛋白的上清液转移到新鲜的管中。添加与荧光蛋白靶向单域抗体纳米抗体偶联的琼脂糖珠，纳米抗体识别折叠荧光蛋白上的三维表位并结合。

离心机。将融合蛋白结合的琼脂糖珠重悬于缓冲液中。加热以将融合蛋白与琼脂糖珠解离。执行 SDS-PAGE 以分离单个蛋白质，然后使用荧光蛋白片段特异性抗体进行蛋白质印迹。

仅检测到带有荧光片段标记的相互作用蛋白质，从而确认它们的分离。

首先，将HEK293T细胞接种在含有 10 毫升 DMEM 的 10 厘米培养皿中。然后，在 500 微升转染缓冲液中稀释 2.5 微克每种双分子荧光互补载体。

加入 10 微升转染试剂，并将混合物涡旋 10 秒钟。然后，短暂离心样品，并在室温下孵育 10 分钟。接下来，将 DNA 转染混合物滴加到培养皿中。然后，将样品孵育 8 至 24 小时。

按照文本方案中所述制备细胞裂解缓冲液和补充的细胞裂解缓冲液。然后，用冰冷的PBS洗涤细胞两次。吸出PBS，并加入1毫升冰冷补充的细胞裂解缓冲液。

接下来，将盘子放在冰上，孵育五分钟。然后，使用细胞刮刀取出细胞并将它们转移到冷冻的微量离心管中。在 4 摄氏度下以 18,000 倍重力离心管 5 分钟，以去除细胞碎片。然后，将透明上清液转移到新鲜的微量离心管中。

1 毫升 PBS 中洗涤适量的琼脂糖珠。然后，以 300 倍重力离心珠子，并小心地除去上清液。接下来，向每个样品中加入20微升琼脂糖珠，并在4摄氏度下孵育两小时，端到端旋转。

300倍重力离心珠子，并在细胞裂解缓冲液中洗涤3次。然后，将洗涤的珠子重悬于 50 微升稀释的样品缓冲液中。最后，将样品在 95 摄氏度下加热两到三分钟。