非手术治疗的小鼠气管内滴入肺和肺淋巴结流式细胞仪分析
May 2nd, 2011
我们说明进入肺部通过气管内麻醉小鼠的非手术治疗提供试验材料。这种方法允许肺暴露于细菌和病毒的病原体，细胞因子，抗体，珠子，化学品，染料。我们进一步描述采伐和肺和肺淋巴结（LDLNs），流式细胞仪检测处理。
该程序的总体目标是使用管饲针将材料非手术地测试到小鼠的肺部，然后分析肺部和肺引流淋巴结。这是通过首先将照明喉镜和弯曲的管饲针插入麻醉小鼠的气管来实现的。然后通过喉镜和管饲针将测试材料滴入动物的肺部。
接下来，提取肺和引流淋巴结。最后，肺和淋巴结被加工成单细胞悬液。最终，该方法有助于流式细胞术分析测试材料与肺免疫细胞的关联以及细胞运输到肺引流淋巴结的情况。
与鼻内和雾化暴露等现有方法相比，该技术的主要优点是它允许绕过鼻相关淋巴组织将测试材料定向输送到肺部。此外，与气管安装的手术大鼠相比，它易于执行。演示该程序的是 Richie 实验室的博士后 Elizabeth Enti 和晶状体实验室的研究生 Manji。
麻醉小鼠后，在 50 微升生理盐水中制备接种物。将接种物填充装有无菌弯曲管饲针的 1 毫升注射器。在注射器的接种物后面装入 100 微升的气穴，以确保所有液体都安装到肺部。
将鼠标放在斜木平台上，由门牙挂在电线上，然后用一条丝带轻轻地将其固定到位。接下来，用一只手打开喉镜，用另一只手抓住一对钝钝的镊子。使用喉镜的尖端和镊子轻轻地用镊子撬开嘴巴。
拉出舌头并将其放在一边。将喉镜刀片引向口腔后部。以 90 度角非常轻柔地向下按压喉镜，直到可以看到气管开口。
用一只手握住喉镜，另一只手拿着装有装有接种物的弯曲管饲针的 1 毫升注射器。将针头插入气管，直到针头的弯曲处靠近前门牙。均匀推动柱塞以输送接种物，而不会起泡。
尽快将针头从气管中拔出。将鼠标直立几秒钟，让接种物吸入肺部。将鼠标放在加热灯附近，让它唤醒。
安乐死后，将老鼠的手臂和腿固定在解剖板上。用剪刀沿着腹侧中间切开。轻轻拉动皮肤并露出腹膜。
在腹膜上切开以露出腹部器官。用镊子握住胸骨尖端，用剪刀刺穿隔膜。用平行于解剖板表面的剪刀沿肋骨腔的侧面剪断隔膜。
沿两侧的背腹线略微切开胸腔。抬起心脏右侧的胸腔。就在胸腺下方寻找两个淋巴结。
第三个稍大的淋巴结位于垂直于气管的小动脉血管下方。将淋巴结收集成 1 毫升淋巴结消化液，混合并置于冰上。采集淋巴结后，将肺采集到六孔板中。
将六孔板保持在冰上，吸出 PBS 并使用镊子和剪刀将裂片切成小块。用 26 号针头压住每个淋巴结，然后用第二根 26 号针头将其分开。为确保释放所有细胞，请添加 3 毫升用于肺的消化混合物和 1 毫升用于淋巴结的消化混合物。
在37摄氏度下孵育淋巴结25至30分钟，将肺部孵育30分钟后，将EDTA添加到每种消化混合物中，使其终浓度为10毫摩尔以停止反应，然后将它们置于冰上。使用 3 毫升注射器，将肺块穿过 18 号针头。通过 70 至 100 微米的细胞过滤器将肺碎片和淋巴结捣碎 3 次。
使用 1 毫升注射器柱塞的后端，用 10 毫升 HBSS 洗涤细胞过滤器，无需钙镁离心机。细胞在 4 摄氏度下以 500 倍重力采样 5 分钟。Reese's 将沉淀物弯曲在 5 毫升红细胞裂解液中，缓冲，并孵育 3 分钟。
在室温下，加入 10 mL不含钙和镁的 HBSS 淬灭裂解液，以 500 倍重力离心样品 5 分钟。将肺和肺引流淋巴结、单细胞悬液分别调至 10 毫升和 5 毫升。在血细胞仪中使用 Triam 蓝色排除对细胞进行计数。
在这两个图中，用 10 乘以 10 至第 8 个巴斯拉菌孢子攻击 AJ 小鼠，并在感染后 30 分钟通过流式细胞术分析肺部。这些点图显示了门控策略。这些面板显示了炭疽芽孢杆菌孢子阳性的 CD 45 阳性 CD 11 C 阳性肺细胞的百分比。
在该图中，AJ 小鼠经气管内注射，然后分析其肺引流淋巴结。代表性点图显示了肺引流淋巴结中 CD 11 C 高细胞的百分比，这些细胞在空通道上绘制了荧光珠。左图显示了注射 PBS 的小鼠的结果，右图显示了注射 5 乘以 10 到 9 个菌群的小鼠的结果，亮黄绿色微球和 10 微克 LPS。
这种方法可以帮助回答该领域的关键问题，例如哪些事件专门在肺部启动，以及吸入的抗原如何从肺部运输到引流淋巴结中。
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概述
本文介绍了一种通过气管向麻醉小鼠肺部输送测试材料的非手术方法。该技术允许暴露于各种物质中，并促进了肺部免疫细胞的后续分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 呼吸生物学
背景
- 理解肺部免疫反应对开发治疗方法至关重要。
- 传统方法可能涉及侵入性程序。
- 该技术允许更安全、更有效的测试。
- 流式细胞术是分析免疫细胞相互作用的关键工具。
研究目的
- 开发一种非手术方法用于肺部暴露于测试材料。
- 分析测试材料与肺部免疫细胞的关联。
- 研究免疫细胞向肺淋巴结的迁移。
使用的方法
- 将发光喉镜和弯曲的喂管针插入气管。
- 通过喉镜将测试材料输送到肺部。
- 提取肺部和引流淋巴结。
- 将组织处理为单细胞悬液以供分析。
主要结果
- 成功地将各种测试材料输送到肺部。
- 促进了肺部免疫细胞的流式细胞术分析。
- 提供了关于免疫细胞向淋巴结迁移的见解。
- 展示了一种用于肺部研究的非侵入性方法。
结论
- 该方法为肺部研究提供了宝贵的工具。
- 它增强了对肺部免疫反应的理解。
- 该方法可能导致改进的治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
This non-surgical intratracheal instillation method enables precise delivery of test materials directly to the lungs, bypassing upper respiratory tract confounders. It supports mechanistic de-risking in immunology and respiratory drug discovery by enabling quantitative analysis of antigen trafficking and immune cell engagement. The approach enhances predictive confidence in target validation and preclinical model relevance for inhaled therapeutics and vaccines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating lung-specific immune responses from nasal-associated lymphoid tissue interference.
- Operational Value: Provides reproducible delivery of antigens or compounds to lungs for consistent target engagement assessment.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets involved in antigen presentation and T-cell activation pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable flow cytometry readouts of test material association with lung immune cells and trafficking to draining lymph nodes.
- Operational Value: Standardizes tissue processing into single-cell suspensions for high-throughput immunophenotyping.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening of immunomodulators or vaccine candidates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models human lung antigen exposure and immune cell migration to lymph nodes for preclinical efficacy testing.
- Mechanistic De-risking: Clarifies causal relationships between lung exposure and immune activation, reducing ambiguity in target mechanism.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on quantitative immune trafficking data from lungs to lymph nodes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical immunology studies, particularly for inhaled biologics and small molecules.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of lung-specific immune initiation and pathway clarification of antigen-presenting cell activation.
- Screening: Enables assay standardization and reproducible quantitative outputs for comparing test material immunogenicity.
- Analytics: Delivers flow cytometry-based measurements of cell-associated antigen and trafficking kinetics to inform comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects lung immune events to preclinical validation via lymph node trafficking, supporting biomarker-aligned advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable lung exposure platform across immunology, infectious disease, and respiratory therapy programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in lung immune responses.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of lung exposure and immune analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in immunology pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on lung-specific immune trafficking and target engagement data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse anesthesia, surgical preparation, and tissue dissection for consistent tracheal access.
- Dependent on laryngoscopy equipment, bent gavage needles, and sterile inoculation supplies for reliable delivery.
- Necessitates standardized tissue digestion and flow cytometry protocols across teams for reproducible immune profiling.
- Adaptation considerations include varying inoculum volumes and digestion times across mouse strains or disease models.
- Practical limitations include technical skill dependency for tracheal visualization and potential variability in inoculum distribution.
