小鼠非手术气管内灌注及通过流式细胞术分析肺组织和肺引流淋巴结

本实验的总体目标是利用灌胃针非手术地将待测物质导入小鼠肺部，并随后分析其肺组织及肺引流淋巴结。该过程首先将照明喉镜和弯曲的灌胃针插入麻醉小鼠的气管中，然后通过喉镜和灌胃针将待测物质滴注至动物肺部。

接下来，取出肺组织和引流淋巴结。最后，将肺组织和淋巴结处理成单细胞悬液。该方法最终可实现通过流式细胞术分析测试物质与肺部免疫细胞的结合情况，以及细胞向肺引流淋巴结的迁移过程。

与现有的鼻内给药和气溶胶暴露等方法相比，该技术的主要优势在于能够将测试物质直接递送至肺部，从而避开鼻相关淋巴组织。此外，与手术类气管插管法相比，该方法操作更为简便。本次实验操作将由 Richie 实验室的博士后 Elizabeth Enti 和 lens 实验室的研究生 Manji 进行演示。

将小鼠麻醉后，在50微升生理盐水中制备接种物。用带有无菌弯曲灌胃针的一毫升注射器吸取接种物，并在接种物后方吸入100微升空气，以确保所有液体均被注入肺部。

将小鼠放置在由门齿悬挂在金属丝上的倾斜木制平台上，并用一条丝带轻轻固定其位置。然后用一只手打开喉镜，另一只手握住一把钝头镊子。使用喉镜的尖端和镊子轻轻撬开小鼠的口腔。

拉出舌头并将其固定在侧方。将喉镜片引导至口腔后部。以90度角非常轻柔地向下按压喉镜，直至看到气管开口。

用一只手固定喉镜的同时，另一只手取装有接种物且配有弯头灌胃针头的一毫升注射器。将针头插入气管，直至针头弯曲处到达门齿前方。均匀推动活塞，将接种物注入，避免产生气泡。

尽快将针头从气管中抽出。将小鼠保持直立姿势数秒钟，以使接种物吸入肺部。将小鼠放置在加热灯附近，使其苏醒。

安乐死后，将小鼠的四肢用大头针固定在解剖板上。用剪刀沿腹部中线做切口。轻轻拉开皮肤，暴露腹膜。

在腹膜上做切口以暴露腹腔器官。用镊子夹住胸骨尖端，用剪刀刺穿膈肌。沿肋骨两侧平行于解剖板表面剪开膈肌。

沿两侧稍偏背腹线切开胸腔。抬起心脏右侧的肋骨。在胸腺正下方寻找两个淋巴结。

第三个稍大的淋巴结位于一条与气管垂直的小动脉血管下方。将淋巴结收集至含有1毫升淋巴结消化液的容器中，混匀后置于冰上。收集完淋巴结后，将肺组织收集至六孔板中。

将六孔板置于冰上，吸除 PBS，然后用镊子和剪刀将组织叶切成小块。用一支26号针头固定每个淋巴结，再用另一支26号针头将其撕解分散。为确保所有细胞充分释放，每份肺组织加入3毫升消化液，每份淋巴结加入1毫升消化液。

将淋巴结在37摄氏度孵育25至30分钟，肺组织在37摄氏度孵育30分钟后，向每种消化混合物中加入EDTA，使其终浓度为10毫摩尔，以终止反应，然后将样品置于冰上。使用3毫升注射器，将肺组织碎片通过18号针头推压。将肺组织和淋巴结组织碎片反复通过70至100微米细胞筛网研磨三次。

使用1毫升注射器活塞的末端，用10毫升不含钙和镁的HBSS冲洗细胞滤筛，然后在4°C下以500 × g离心5分钟。将沉淀重悬于5毫升红细胞裂解缓冲液中，并在3分钟内孵育。

在室温下，加入 10 毫升不含钙和镁的 HBSS 以终止裂解，将样品在 500 × g 条件下离心 5 分钟。将肺组织和肺引流淋巴结的单细胞悬液分别调整至 10 毫升和 5 毫升。使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板中进行细胞计数。

在这两张图中，AJ 小鼠被接种了 1×10⁸ 个枯草芽孢杆菌孢子，感染后 30 分钟通过流式细胞术分析肺组织。这些散点图展示了设门策略。这些图示显示了肺组织中 CD45 阳性、CD11C 阳性细胞中呈炭疽杆菌孢子阳性的细胞所占百分比。

在本图中，AJ 小鼠经气管注射后，分析其肺引流淋巴结。代表性散点图显示了肺引流淋巴结中携带荧光微珠的 CD11C 高表达细胞百分比，横坐标为一个空通道信号。左图显示注射了 PBS 的小鼠结果，右图显示注射了 5 × 10⁹ 个亮黄绿色微球（含 10 µg LPS）的小鼠结果。

该方法有助于回答该领域中的关键问题，例如肺部特异性启动了哪些事件，以及吸入的抗原如何从肺部转运至引流淋巴结。