跨膜结构域齐聚倾向ToxR含量决定

以下实验的总体目标是研究天然膜环境中蛋白质、跨膜结构域或 T MD 的韧带化倾向。这是通过将大肠杆菌中的目标跨膜结构域表达为嵌合蛋白和麦芽糖结合蛋白来定位到周质和毒理中来实现的。R 作为转录报告基因，跨膜结构域诱导韧带化导致毒毒素 R 二聚化和 LXi 转录激活作为第二步，细胞被 ONPG 裂解并用 ONPG 处理，ONPG 被 β 半乳糖水解成光吸收物质 O 硝基邻苯二甲酸盐或 ONP。

接下来，通过测量 405 纳米处的光吸收来量化 ONP 水平。为了确定跨膜结构域的水平，韧带化结果揭示了基于 tox R 报告基因测定的跨膜结构域的韧带化倾向。与现有的生物物理方法（如 SDS 页面或荧光）相比，该技术的主要优点是，通过在大肠杆菌中表达而不是在膜模拟系统（如洗涤剂本身）中研究跨膜结构域的行为。

该方法可以帮助回答膜蛋白领域的关键问题，例如阐明跨膜螺旋结合所涉及的关键结构特征 在该方案开始之前，用商业合成的寡核苷酸制备表达所需嵌合蛋白的 7 个质粒，代表侧翼为 NHE 1 和 BMH 1 的感兴趣的 TDS。质粒制备后的限制性位点在冰上轻轻解冻 fhk 12 个感受态细胞。解冻后，将细胞转移到 15 mL培养管中，每种血浆 DNA 为 200 ng，转移到单独的试管中，并在冰上孵育细胞 30 分钟。

然后在 42 摄氏度下对细胞进行热休克 90 秒，然后在 800 微升 SOC 培养基中在冰上孵育 2 分钟，并在 37 摄氏度下振荡孵育样品 1 小时，孵育后接种 5 毫升含有氯霉素和 aose 的 LB 培养基和 50 微升转化混合物，每个样品使用 15 毫升培养管一式三份。最后，将样品在 37 摄氏度下振荡孵育 20 小时。为了测量 TDS 的所有韧带化，测定 β 半乳糖 tase 活性。

首先，将读板器预热至 28 摄氏度。使用 Z 缓冲液原液制备新鲜的 Z 缓冲液，如书面方案中所述。将 Z 缓冲液氯仿从试管转移到储液槽中，确保仅管道输送 Z 缓冲液氯仿的上层水层。

将 96 孔板放在一张纸上，画出网格以确保准确，移液将 100 微升 Z 缓冲液氯仿转移到 96 孔板的每个孔中，然后在四边形中转移 5 微升每种培养物。重复省略将用作空白的四个孔中的培养物。测量板的 OD 5 95 以确定细胞密度。

向板的所有孔中加入 50 微升 Z 缓冲液 SDS。然后在读板器中摇动板 10 分钟，以便在 50 μL ZPA for ONPG 细胞裂解后将细胞溶解到所有孔中。将板放回读板器，每 30 秒测量一次 OD 4 0 5，持续 20 分钟。

通过计算归一化为空白的 Miller 单位来确定 β lacto sase 活性的水平。进行 Western blotting 以验证构建体之间的等效蛋白质表达。首先，混合 50 微升一式三份培养物，然后使用微量离心机离心样品。

通过移液和复苏去除上清液。将残留沉淀悬浮在两个样品上样缓冲液中，每个样品在 8% 标准凝胶上加载 7.5 微升，并在转移后以 125 伏特进行电泳 1 小时 5 分钟。用抗 M-V-P-H-R-P 偶联抗体孵育膜，以在大约 70 道尔顿处观察到嵌合蛋白，有时在 48 道尔顿左右观察到一些降解产物。

在 45 千道尔顿处也观察到内源性 MVP。为了评估嵌合 TMD 构建体的正确膜插入，当在以麦芽糖作为唯一碳源的最小培养基中生长时，使用麦芽糖结合蛋白缺陷型 PD 28 细胞系，只有表达膜完整表达产物且麦芽糖结合蛋白正确定位在周质中的细胞才能生长。按照 fhk 12 细胞的说明转化 PD 28 细胞并接种 2 毫升 LB 培养基。

孵育后，在 37 摄氏度下以 300 RPM 振荡过夜，使细胞生长。通过离心沉淀细胞，并通过 Resus 悬浮液在 2 毫升 PBS 中洗涤，并用大吸头轻轻移液。沉淀后，细胞再次用 PBS 洗涤第二次，然后在 1 mL PBS 中进行最终离心和复苏悬浮液。

使用 25 微升重悬细胞接种 5 毫升最低培养基。将细胞在 37 摄氏度下摇动孵育 15 小时。将每个样品的 200 微升转移到 96 孔板中，并使用读板器获取 OD 5 9 5 读数。

每 2 小时重复一次此过程，直到 25 小时。使用 tox R 转录报告基因测定分析来自多跨膜整合蛋白潜伏膜蛋白 1 的单个跨膜结构域的所有韧带化倾向。正如高 Miller 单位所证明的那样，跨膜结构域 5 表现出强烈的 liga 上升倾向，这与阳性对照 GPAA 已建立的二聚化序列相当。

跨膜结构域 5D one 50 A 中的有害突变降低了序列对所有 liga 升高 LMP one 的能力，TM one 没有显着的所有 liga 升高，并且表现出非常低的 Miller 单位信号，刚好高于空白信号，空白是未转化的 FHK 12 细胞。观看本视频后，您应该对如何确定感兴趣的跨膜螺旋是否能够在自然膜环境中形成更高阶的复合物有一个很好的了解。在尝试此过程时，请务必非常小心地移液到 96 孔板中，以避免大误差并确保没有气泡。