高效转染树突状细胞的无细胞的成熟优化的协议

该程序的总体目标是通过 SI RNA 转染敲低 DCS 中的靶基因表达。这是通过首先对 AM Maxin Nucleo 效应器进行编程来实现的。该程序的第二步是将 DCS 和 siRNA 混合在一起，并将所得细胞溶液移液到 Nucleo QVE 模块中。

该程序的第三步是将板放入 amaxa 穿梭托盘中以开始转染过程。该程序的最后一步是用病毒感染细胞以激活干扰素反应。最终，可以通过定量 R-T-P-C-R 和 Western blotting 获得显示基因敲低的结果。

该技术对于表征树突细胞中的信号通路很有价值，并可能有助于基于树突细胞的免疫疗法的发展。要对用于 DC 转染的 Maxon 96 孔穿梭核因子进行编程，请打开一个新的参数文件。通过将光标拖动到 96 孔板图上，选择要用于标准转染的孔数。

每个实验样品至少使用三个孔进行合并。现在在第一部分中输入程序代码，选择 F、F 和 i 第二部分，从下拉菜单中选择 1 68。然后从解决方案框中，选择单核细胞人，然后在控制选项下选择标准，然后单击应用。

要包含无转染对照，需要从图中选择其他孔。然后从控制选项中，选择无程序控制并再次单击应用。混合 nucleo 情感溶液后，让它加热至室温。

所需数量的 nucleo vete 模块按正确方向放入 nucleo VETE 板中，如图所示，将第一个模块插入 rose 1 和 2，然后以此类推，用于以下所有试管。将足够的 DCS 从细胞培养瓶中转移到 50 mL试管中，每孔有 500， 000 个细胞用于转染，在 4 摄氏度下以 400 G 离心细胞 10 分钟，然后小心去除上清液。接下来，将 Nuclear Affection 溶液添加到试管中，然后通过轻轻上下吹打几次来重悬 DCS。

现在根据要进行的特定处理标记 eend DPH 管，然后将重悬的细胞分装到标记的管中。将终浓度为每 500， 000 个细胞 0.25 μg 的 SI RNA 添加到适当的 epi endorf 管中，然后通过移液混合细胞悬液。对无转染对照样品使用非靶标 SI RNA。

然后根据先前编程的实验布局，将 20 微升 SI RA DC 细胞悬液移液到 nucleo vete 模块中，确保液体输送到孔底部，用盖子盖住 nucleo vete 板，并在硬表面上敲击板几次，以利于去除气泡转染 dcs。将准备好的 nucleo Yvette 板插入 nucleo 效应器 96 孔穿梭盘中。然后点击 上传并开始 按钮。

跟踪显示屏上的转染过程进度。绿色背景上的黑色叉号表示在该孔中转染成功，而红色背景上的黑色条形表示在转染细胞时转染不成功。预热 DC 生长培养基：转染过程完成后，取出板并向每个孔中加入 80 μL 预热 DC 生长培养基。

现在使用多通道移液器在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育板 10 分钟。在孵育期间，将 100 μL 预热的 DC 生长培养基添加到基质管中，其方向与设置的 nucleo 比色皿板的方向相同。孵育期后，将所有 100 微升细胞悬液从 nucleo CVE 转移到预先排列的基质管中。

然后取出并丢弃未进行转染的试管。最后，将基质管孵育 24 小时或其他所需的时间间隔。为每个孵育基质管标记 einor管。

然后将基质管从培养箱转移到细胞培养罩中，并将每个实验样品的基质管汇集到预先标记的 eend dfs 中。接下来，在台式离心机中旋转 eend DPH 管 10 分钟，轻轻沉淀细胞。在 400 G 时，去除 snat，将细胞重悬于含有新城疫病毒或 NDV 的无血清生长培养基中，MOI 松散为 1。

以无菌方式覆盖 epi 内啡肽，然后将试管孵育 45 分钟。孵育期结束后，加入 900 μL DC 生长培养基，并将试管再孵育 8 至 10 小时。收获转染和感染的 dc。

像以前一样，通过在台式离心机中旋转 einor管来沉淀细胞，并去除 snat 单核细胞 dc，用靶向 RIG I 的 IRNA 或非特异性辉光 irna 转染并感染 NDV，如加号所示或保持未感染，如减号所示，通过定量 R-T-P-C-R-A 将 R RGA 敲低 75% 检测到在转录水平上，观察到 的表达降低干扰素 β。还观察到干扰素信号级联反应中 RGA 的下游效应子。此外，在未感染的对照转染细胞中未检测到干扰素 β 的表达。

而 MXA 和干扰素 β 下游反应基因的 DIFF 值最小。这里。本实验中显示了如上图所示，使用靶向 irna 的 rigi 进行第二次转染 DCS 的数据。然而，所有细胞都感染了 NDV，并掺入了使用未切除的单核细胞 DCS 的附加对照。

基因沉默结果与上图中观察到的结果相似。探测 RGA 的蛋白质印迹显示该基因的蛋白表达已被完全阻断。泳道 1 和 2 显示来自未切除细胞的裂解物数据。

泳道 3 和 4 显示辉光 irna 转染细胞的裂解物，泳道 5 和 6 显示转染靶向 S Irna 的 RIG I 细胞的裂解物掌握后，该技术可在一小时内完成，包括同时敲低多个基因。