Name: 高效转染树突状细胞的无细胞的成熟优化的协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学习使用优化的核转染技术对人单核细胞来源的树突状细胞进行高效转染，避免细胞成熟诱导。该方法通过siRNA实现RIG-I基因沉默，适用于免疫信号通路研究和基因功能分析。

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本项目由美国国立卫生研究院（NIH）国家过敏与传染病研究所合同编号 HHSN2662000500021C 资助。我们感谢 Ming Chen 提供的技术支持。

1. 设置 Amaxa 96 孔 Shuttle 核转染仪程序
<ol>
 <li>打开一个新的参数文件。</li>
 <li>通过在96孔板示意图上拖动光标，选择标准转染实验所用的孔数。每个实验样本至少使用3个孔进行合并。</li>
 <li>输入程序代码：在“部分1”中从下拉菜单选择“FF”，在“部分2”中选择“168”。</li>
 <li>在“Solution”（溶液）框中选择“Monocyte, human”。</li>
 <li>在“Control Option”（控制选项）下选择“standard”（标准）。</li>
 <li>点击“Apply”（应用）。</li>
 <li>如需包含无转染对照，请根据需要从示意图中选择额外的孔，然后在“Control Option”中选择“No Program Control”，并点击“Apply”。</li>
 <li>选中板图中所有剩余未使用的孔，然后点击“Undefine”（取消定义）。</li>
</ol>
2. 准备用于转染的树突状细胞
<ol>
 <li>所有操作应尽可能在无菌条件下于细胞培养罩内进行。通过将96孔补充剂按450比2025的比例加入人单核细胞96孔核转染溶液中，制备核转染溶液。混匀后置于室温平衡。每孔需要20μl核转染溶液。额外多配制10%以弥补移液误差。</li>
 <li>将所需数量的核转染杯模块按正确方向插入核转染杯板中，例如第一个插入第1和第2行。</li>
 <li>根据实验所需，按每孔500,000个细胞计算并收集树突状细胞（DCs），在400g离心10分钟成团，小心吸除上清液。</li>
 <li>用移液器轻轻吹打数次，将细胞重悬于核转染溶液中。</li>
 <li>根据特定处理条件（如GLO和RIG-I）将重悬细胞的适当体积分装至标记好的离心管中。</li>
 <li>每500,000个细胞加入0.25μg siRNA，通过移液混匀。在无转染对照样本中使用非靶向siRNA。</li>
 <li>根据实验设计，将上述混合物各20μl移入相应的核转染杯模块中，确保液体送达孔底。</li>
 <li>用盖子盖好核转染杯板，并在硬质表面上轻敲数次，以帮助排除气泡。</li>
</ol>
3. 转染树突状细胞
<ol>
 <li>将培养板插入 Nucleofector 96 孔 Shuttle 转染装置托盘中，点击“上传”然后启动。</li>
 <li>通过笔记本电脑显示屏监控转染过程的进度；绿色背景上的黑色十字表示该孔转染成功，红色背景上的黑色横条表示转染失败。</li>
 <li>转染过程完成后，取出培养板，使用多通道移液器向每孔加入 80 μl DC 培养基。</li>
 <li>在 37°C 和 5% CO2 条件下孵育 10 分钟。</li>
 <li>将核转染杯中的 100 μl 液体转移至含有 100 μl 预热 DC 培养基的矩阵管中，保持正确的方向。</li>
 <li>移除并丢弃未发生转染的管子。</li>
 <li>在 37°C 和 5% CO2 条件下孵育 24 小时或其它所需时间间隔。</li>
</ol>
4. 用新城疫病毒（NDV）感染细胞
<ol>
 <li>从培养箱中取出基质管，转移至细胞培养操作台，将每个实验样本的基质管内容物合并至离心管中</li>
 <li>在台式离心机中以5分钟低速离心收集细胞，小心吸弃上清液</li>
 <li>用含新城疫病毒（NDV）且感染复数（MOI）为1的无血清生长培养基重悬细胞，将离心管松盖后于37°C、5% CO2条件下孵育45分钟</li>
 <li>加入900μl树突状细胞（DC）生长培养基，继续孵育8–10小时</li>
</ol>
5. 收获细胞
<ol>
 <li>使用台式离心机离心微量离心管，使细胞沉淀，然后弃去上清液。</li>
 <li>根据您的实验方案收集细胞，用于RNA或蛋白质提取。</li>
</ol>
6. 代表性结果：
使用我们优化后的方案，将树突状细胞（DCs）进行转染 RIGI用靶向siRNA处理细胞24小时后，用新城疫病毒（NDV，一种可被RIG-I识别的副黏病毒）感染细胞，以激活干扰素反应通路。通过qRT-PCR分析，我们证实该基因在转录水平上的表达被敲低了75%。我们还观察到其表达水平出现类似的下降 IFNβ，这是RIG-I在IFN信号级联中的下游效应分子。此外，我们观察到表达 IFNβ 在未感染的对照转染细胞中不可检测，而 MxA，一个 IFNβ 下游响应基因的表达极低（图1A）。 
使用足量细胞进行树突状细胞的第二次转染，以进行靶向 RIGI 的 siRNA 转染，并包含 Western blot 分析。尽管 RT-PCR 结果与我们此前观察到的结果相似（RIG-I 和 IFNβ 表达分别下调 62% 和 66%）（图 1B），但针对 RIG-I 的 Western blot 结果显示，该基因的表达已被完全阻断（图 1C）。
<img src="/files/ftp_upload/2766/2766fig1.jpg" alt="基因表达分析，柱状图显示RIG-I、IFNβ、MxA拷贝数及蛋白印迹结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1A"> 图1. (A) 使用靶向RIG-I的siRNA或非特异性GLO siRNA转染MoDCs，并通过qRT-PCR检测RIG-I、IFNβ和MxA的表达水平。转染采用单核细胞特异性缓冲液及核转染程序FF168（Lonza Walkersville Inc.）。转染后细胞在37°C孵育24小时，随后部分细胞感染NDV（+），另一部分未感染（-）。继续孵育10小时后收集细胞并提取RNA。转录水平数据来自两次重复实验的结果。引自Bowles et al 16。 
(B) 与图1A所用不同血沉棕黄层来源的MoDCs，再次采用上述相同的转染方案，分别转染靶向RIG-I的siRNA或非特异性GLO siRNA。本实验额外增设未转染MoDCs作为对照组。所有细胞在转染后孵育24小时，随后均感染NDV，并继续孵育10小时，之后收集细胞用于RNA和蛋白质的提取。通过qRT-PCR测定的RIG-I、IFNβ和MxA转录水平代表两次重复实验的结果。引自Bowles et al 16。 
(C) 对图1B所述细胞的裂解物进行Western印迹分析。第1和第2泳道：未转染细胞的裂解物；第3和第4泳道：转染GLO siRNA细胞的裂解物；第5和第6泳道：转染靶向RIG-I siRNA细胞的裂解物。样品使用RIG-I抗体进行探测，同时以GAPDH作为上样对照，并设置重复上样。引自Bowles et al 16。

<ol><li>Reis e Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+dendritic+cells%3A+translating+innate+into+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).</li>
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<li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoporation+of+dendritic+cells%3A+efficient+gene+transfer+by+electroporation+into+human+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells.</a> FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).</li>
<li>Prechtel, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+interfering+RNA+%28siRNA%29+delivery+into+monocyte-derived+dendritic+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation.</a> J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).</li>
<li>Bowles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+efficient+high-throughput+plasmid+and+siRNA+transfection+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells+without+cell+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation.</a> J. Immunol. Methods. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23, 19-28 (2005).</li>
<li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+MDA5+and+RIG-I+helicases+in+the+recognition+of+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses.</a> Nature. 441, 101-105 (2006).</li>
<li>Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mx+GTPase+family+of+interferon-induced+antiviral+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins.</a> Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

高效转染初始原代树突状细胞对于高通量分析以及逆向解析这类关键细胞中介导先天免疫向适应性免疫转换的炎症通路至关重要。然而，大多数研究者发现，使用常规转染技术时，这些细胞不仅难以实现高效转染，而且转染过程本身还容易诱导细胞成熟。我们探讨了是否可通过高通量方案优化，利用一种可同时独立操作的96孔商用核转染系统（Lonza），克服上述局限性。
通过荧光激活细胞分选（FACS）技术，我们检测了表达GFP的质粒作为转染效率的标记物，并以CD86和MHCII的免疫反应性作为细胞成熟程度的读数。一系列评估缓冲液和电穿孔程序的实验最终确定了能够实现&gt;50%转染效率且不引起成熟标志物升高的实验条件。
为进一步研究核转染过程是否可能激活树突状细胞（DCs），我们分析了其表达水平 IFNβ 及其下游应答基因 MxA 在mRNA水平上 MxA 表达对……极为敏感 IFNβ 产生，并可作为生物检定法用于检测极低水平的细胞因子18。通过qRT-PCR分析，我们未检测到明显信号 <...

<table><tbody><tr><td>Amaxa Nucleofector 96孔Shuttle</td><td>Lonza Inc.</td><td>108S0109</td><td>序列号</td></tr><tr><td>Amaxa 人单核细胞96孔Nucleofector试剂盒</td><td>Lonza Inc.</td><td>VHPA-2007</td><td>包含人单核细胞96孔Nucleofector溶液、96孔补充剂以及Nucleocuvette和板</td></tr><tr><td>RIG-I siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-012511-00</td><td></td></tr><tr><td>GLO siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>D-001600-01-20</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td>添加10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 &amp;#x03BC;g/ml链霉素以制备树突状细胞生长培养基</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>3070.03</td><td></td></tr><tr><td>树突状细胞</td><td>纽约血液中心</td><td></td><td>树突状细胞通过标准程序从血沉棕黄层中纯化获得</td></tr></tbody></table>

高效转染树突状细胞且不诱导细胞成熟的优化方案

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

树突状细胞（DCs）可被视为免疫系统的哨兵，在免疫应答的启动及对感染的反应中发挥关键作用1。初始DC通过模式识别受体（PRRs）识别病原体抗原，这些受体能够识别被称为病原体相关分子模式（PAMPS）的特定保守结构。DCs对PAMPs的识别会触发细胞内信号级联反应，导致其活化并转化为成熟DC。该过程通常表现为I型干扰素及其他促炎性细胞因子的产生、MHCII和CD86等细胞表面标志物的上调，以及成熟DC向引流淋巴结的迁移，在此与T细胞相互作用，启动适应性免疫应答2,3。因此，DCs连接了先天性免疫系统与适应性免疫系统。
解析树突状细胞（DC）对各种病原体反应背后的分子网络，对于深入理解这些信号通路及其诱导基因的调控机制至关重要。这也将有助于推动针对传染病和肿瘤的树突状细胞疫苗的开发。然而，由于难以转染原代DC，这一研究方向受到了严重阻碍4。
病毒转导方法（如慢病毒系统）通常被采用，但存在诸多局限性，例如操作复杂以及生物危害风险（及其相关成本）5,6,7,8。此外，病毒基因产物的递送会增加被转导树突状细胞（DCs）的免疫原性9,10,11,12。电穿孔技术虽已有应用，但结果参差不齐13,14,15，而我们是首个报道使用高通量转染方案并确凿证明其有效性的研究团队。
本报告总结了一种优化的商业化方案，用于高效转染人原代树突状细胞（DCs），该方法细胞毒性低，且不会诱导树突状细胞成熟16。转染效率（以GFP质粒为指标）和细胞存活率分别超过50%和70%。流式细胞术（FACS）分析证实，转染细胞中成熟标志物CD86和MHCII的表达水平未升高，同时qRT-PCR结果显示IFNβ基因无上调表达。采用该电穿孔方案，我们证实了siRNA可成功转染树突状细胞，并在mRNA和蛋白质水平上有效沉默靶基因RIG-I——一种关键的病毒识别受体16,17。

我们提出了一种优化的高通量核转染方案，可高效转染人原代单核细胞来源的树突状细胞，导入质粒DNA或siRNA，且不会诱导细胞成熟。我们进一步提供了成功沉默靶基因RIG-I的证据，其mRNA水平和蛋白水平均显著下调。

树突状细胞（DCs）可被视为免疫系统的哨兵，在免疫应答的启动及对感染的反应中发挥关键作用1。检测……

本实验的总体目标是通过siRNA转染在DCS细胞中敲低目的基因的表达。首先需要对AM Maxin Nucleo效应器进行编程。实验的第二步是将DCS细胞与siRNA混合，并将所得的细胞溶液用移液器加入Nucleo QVE模块中。该实验步骤的第三步是将培养板放入Amaxa Shuttle样品槽中，以启动转染过程。实验步骤的最后一步是用病毒侵染细胞，以激活干扰素反应。最终可通过定量RT-PCR和蛋白质印迹法获得显示基因敲低的结果。该技术对于表征树突状细胞中的信号通路具有重要价值，并可能促进基于树突状细胞的免疫治疗的发展。为了对 Maxon 96 孔穿梭核因子转染仪进行编程以用于树突状细胞转染，请先打开一个新的参数文件。通过在 96 孔板示意图上拖动光标，选择您将用于标准转染的孔数。每个实验样本至少使用三个孔进行合并。现在在第一部分输入程序代码，选择 F、F，在第二部分从下拉菜单中选择 1 68。然后在溶液框中选择 monocyte human，接下来在对照选项下选择 standard，然后点击 apply。为了设置无转染对照，需要从图示中选择额外的孔。然后在对照选项中选择无程序对照，并再次点击应用。混合核转染溶液后，将其静置至室温。按照图示方向，将所需数量的nucleo vete模块正确插入nucleo VETE板中，先将第一个模块插入1号和2号玫瑰色孔，然后依次插入后续所有试管。从细胞培养瓶中转移足够量的DCS至50毫升离心管中，使每孔含有500,000个细胞，将细胞在4°C条件下以400 ×g离心10分钟，然后小心去除上清液。接着，向离心管中加入核转染溶液，通过轻轻吹打数次重悬DCS细胞。现在根据将要进行的特定处理标记EP管，并将重悬的细胞分装至已标记的EP管中。向相应的EP管中加入终浓度为每500,000个细胞0.25微克的siRNA，然后用移液器吹打混匀细胞悬液。对于无转染对照样品，使用非靶向siRNA。然后根据预先设定的实验布局，用移液器将20微升SI RA DC细胞悬液加入核转染模块中，确保液体被输送至孔的底部。用盖子盖住核转染板，并在硬质表面上轻敲数次，以促进气泡排出，从而完成对树突状细胞（DCs）的转染。将准备好的核转染板插入核转染效应96孔穿梭托盘中。然后点击上传并启动按钮。在显示屏上跟踪转染过程的进展。绿色背景上的黑色十字表示该孔中的转染成功，而红色背景上的黑色横条表示转染过程中细胞转染失败。转染过程完成后，预热树突状细胞（DC）生长培养基，取出培养板，向每孔中加入80 µL预热的DC生长培养基。使用多通道移液器，将培养板在37摄氏度、5% CO2条件下孵育10分钟。孵育期间，按照与核小板设置相同的方向，向基质管中加入100微升预热的DC生长培养基。孵育结束后，将细胞悬液从核小杯中全部100微升转移至预先准备好的基质管中。然后移除并丢弃未发生转染的试管。最后，将基质管在24小时或其他所需时间间隔内进行孵育。为每根正在孵育的基质管标记相应的eInor管。然后将基质管从培养箱转移至细胞培养操作台，将每个实验样本的基质管合并至预先标记的 eend dfs 中。接着，在台式离心机中以 400 ×g 离心 10 分钟，轻柔地沉淀细胞。离心后弃去上清液，用含有新城病病毒（Newcastle disease virus，NDV）且感染复数（MOI）为 1 的无血清培养基轻轻重悬细胞。以无菌操作方式覆盖表皮内啡肽，然后将试管孵育45分钟。孵育结束后，加入900 µL DC生长培养基，并将试管再次孵育8至10小时。收集转染并感染的树突状细胞。通过台式离心机离心离心管，使细胞沉淀，操作同前，并移除上清液。单核细胞分别转染靶向RIG-I的siRNA或非特异性对照siRNA，并按加号所示感染新城疫病毒（NDV），或按减号所示保持未感染状态。通过定量RT-PCR检测，发现RIG-I在转录水平的表达被敲低了75%。同时观察到干扰素β的表达也出现类似程度的下降。作为RIG-I在干扰素信号通路中的下游效应分子，其表达亦被显著抑制。此外，在未感染的对照转染细胞中，干扰素β的表达未被检测到。而MXA和干扰素β下游应答基因的表达则极低。本实验展示了在树突状细胞中使用靶向RIG-I的siRNA进行第二次转染的数据，实验操作同前一图所示。然而，所有细胞均感染了新城疫病毒（NDV），并额外增设了一组未剪切单核细胞来源的树突状细胞作为对照。基因沉默结果与前一张图中观察到的结果相似。使用RGA探针进行的蛋白质印迹结果显示，该基因的蛋白表达已完全被阻断。第一道和第二道显示的是未切除细胞裂解液的数据。第三和第四泳道显示转染了 glow irna 的细胞裂解液，第五和第六泳道显示转染了靶向 RIG I 的 S Irna 的细胞裂解液。一旦掌握，该技术可在一小时内完成，包括同时敲低多个基因。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

高效转染树突状细胞的无细胞的成熟优化的协议

本视频展示了一种基于小干扰RNA（siRNA）的技术，用于干扰自噬流。通过电穿孔法将靶向FIP200 mRNA的siRNA导入单核细胞来源的未成熟树突状细胞（iDCs），导致FIP200表达下调，从而抑制核纤层蛋白的破坏。 通过 自噬。加入单纯疱疹病毒（HSV）后，由于缺乏核纤层蛋白的破坏，病毒子代的核输出受到抑制 通过...

基于siRNA的单纯疱疹病毒感染未成熟树突状细胞中自噬的抑制

本文描述了用于肿瘤免疫治疗的自体树突状细胞（DCs）大规模制备的最常用方法。该方法利用IL-4和GM-CSF诱导单核细胞分化为树突状细胞。未成熟的树突状细胞经刺激成熟后，负载抗原，再回输至患者体内。...

用于免疫治疗的肿瘤抗原负载成熟树突状细胞的制备

本实验利用逆转录病毒转导和串联转染技术，构建一种可在无四环素条件下表达慢病毒载体（LV）各组分的细胞系。该慢病毒载体编码绿色荧光蛋白（GFP），并假型化携带一种糖蛋白SVGmu，后者特异性识别树突状细胞表面的受体。...

一种受四环素调控的细胞系可产生高滴度慢病毒载体，特异性靶向树突状细胞

本方案介绍了一种高效且可靠的方法，通过电穿孔技术将siRNA或质粒DNA转染至人THP-1巨噬细胞，可在实现高转染效率的同时，保持细胞的高活力以及巨噬细胞完整的分化与极化能力。...

高效转染人THP-1巨噬细胞的核转染方法

不同的树突状细胞亚群作为稀有群体存在于淋巴器官中，因此难以分离出足够数量和高纯度的细胞用于免疫学实验。本文介绍一种高效、高产量的方法，用于分离目前所知的所有小鼠脾脏树突状细胞主要亚群。...

一种高效且高得率的小鼠树突状细胞亚群分离方法

不成熟树突状细胞可被选择性地分化为耐受性或成熟树突状细胞，以调节免疫与耐受之间的平衡。本研究提供了一种从不成熟单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）生成的方法 体外...

具有不同代谢表型的未成熟、成熟及耐受性树突状细胞的制备

本文提供了一种在小鼠骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞中表达荧光融合蛋白的详细实验方案。该方法基于利用逆转录病毒载体转导骨髓前体细胞，随后将其分化为巨噬细胞和树突状细胞。 体外.

小鼠骨髓来源树突状细胞和巨噬细胞中荧光融合蛋白的表达

转免疫化（TI）装置或培养板及相关实验方案已在实验条件下开发，用于模拟体外光化学疗法（ECP）的关键特征，从而生成生理活化且可调控的树突状细胞（DCs），用于癌症免疫治疗。...

生成生理免疫原性树突状细胞的新方法

本文介绍了一种体内增强肠道归巢调节性T细胞诱导的实验方案。在该方案中，树突状细胞被改造为能够局部从头合成高浓度的活性维生素D（1,25-二羟基维生素D或1,25[OH]2D）和活性维生素A（视黄酸或RA）。...

体内增强肠道归巢性调节性T细胞的诱导

本文介绍一种经济高效的方法，通过在含10 ng/mL...

从小鼠骨髓分离和培养树突状细胞的经济高效方案

本方案描述了 体内 通过强制表达转录因子 PU.1、IRF8 和 BATF3，在肿瘤微环境中将小鼠癌细胞重编程为类似 1...

可操作的 体内 将肿瘤细胞重编程为类似1型传统树突状细胞的细胞

学习使用优化的核转染技术对人单核细胞来源的树突状细胞进行高效转染，避免细胞成熟诱导。该方法通过siRNA实现RIG-I基因沉默，适用于免疫信号通路研究和基因功能分析。

高效转染树突状细胞且不诱导细胞成熟的优化方案

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