量化传播肿瘤细胞的频率使用斑马鱼的同源有限稀释细胞移植
July 14th, 2011
有限稀释细胞移植试验是用来确定传播肿瘤细胞的频率。本协议描述了一个产生，发展荧光标记的白血病和细节，如何限制稀释到成年斑马鱼的腹腔这些白血病细胞分离和移植的同源斑马鱼的方法。
极限稀释细胞移植测定是评估实验动物模型中自我更新潜力的金标准。在这个演示中，一个细胞期的同基因斑马鱼胚胎被注射 rag two MIC 和 RAG 两个 GFP，以产生转基因斑马鱼，该斑马鱼将发展为荧光标记的 T 细胞急性淋巴细胞白血病。到出生 60 天时，从斑马鱼中分离出原代白血病细胞，然后使用荧光激活细胞分选进行纯化。
接下来，将细胞以有限稀释度移植到成年斑马鱼的腹膜腔中，并监测鱼的肿瘤生长长达 90 天。最后，使用极端极限稀释分析统计软件程序来量化白血病在原始肿瘤内增殖细胞的频率。有限稀释细胞移植分析使研究人员能够准确评估大部分肿瘤块中包含的自我更新细胞的数量。
正是这些自我更新的细胞驱动癌症的形成，并最终导致癌症复发。在斑马鱼模型中进行有限稀释移植测定的主要优点是每个实验可以移植许多鱼，从而在确定自我更新的肿瘤增殖细胞的频率时具有更好的精度。这种方法提供了对 T 细胞（一种急性淋巴细胞白血病）中肿瘤增殖细胞的见解。
它也可以应用于了解其他斑马鱼癌症模型。实验室研究员 Jessica Blackburn 和才华横溢的技术人员 Sally Liu 今天将为您演示该程序 线性化 Rag two CM 和 RAG 两个 G-F-P-D-N-A 构建体用限制性内切酶消化 10 微克每个质粒，而不是在 37 摄氏度过夜。苯基氯仿提取和乙醇沉淀后，我们将每个质粒悬浮在 20 微升水中。
用 20 μL、10 μL 和 5 μL 的高范围 DNA 分子量标准对每种消化质粒进行 1：1、1 到 5 和 1 到 10 稀释液，测定 1% agro 凝胶上的 DNA 浓度。现在将 DNA 稀释至终浓度为 60 ng/μL，以注射到 CG one 菌株 syngen 中。斑马鱼胚胎注射 250 纳升/微升 30 纳克抹布、每微升 2 厘米和 30 纳克。
将两个 GFP 抹布到一个细胞阶段的斑马鱼胚胎中，小心地将 DNA 直接靶向细胞，而不是卵黄。将注射的胚胎储存在 28.5 摄氏度，并在出生后 5 天在 24 小时后取出死胚胎，注射后约 28 天将动物转移到大水箱中。通过在培养皿中向 25 毫升鱼系统水中加入 200 微升每毫升 4 纳克的 trica S 来麻醉斑马鱼幼鱼。
通过使用落射荧光显微镜检测 GFP 荧光，检查幼虫是否发育出荧光标记的 TALL 。将肿瘤阳性幼虫与阴性幼虫分开，以确保分析中不会遗漏白血病鱼。一旦肿瘤可能变大，可以在以后的时间点检查阴性幼虫 使用落射荧光显微镜每周至少监测一次荧光标记的白血病鱼以跟踪肿瘤生长。
当 GFP 阳性白血病细胞超过动物的 50% 时，每毫升添加 1 毫升 4 纳克。Trica S 在含有 9 毫升鱼系统水的培养皿中以牺牲鱼，将鱼放入含有 1 毫升 5% 胎牛血清和 0.9 XPBS 的新培养皿中，用剃须刀片浸渍鱼，移液混合物以解离大细胞团块。然后将细胞通过 40 微米的网状过滤器放入 50 毫升的试管中。
将500 μL 细胞移液到 4 mL聚苯乙烯管中。每毫升加入 1 微升 1 毫克碘化物以标记死细胞涡旋，然后将细胞置于冰上。还要准备野生型 CG one fish 来收集正常血细胞，这些血细胞在移植过程中以 4 毫升 5%FPS 的 0.9 X PB S 溶液作为肿瘤细胞的载体到 50 毫升试管中，总体积为 5 毫升。
计数正常血细胞，在 0.9 x PBS 中用 5% FBS 稀释至每毫升 10 至 5 个细胞的三倍，然后使用荧光激活细胞分选仪将 96 孔板的每孔 100 微升分选，将 GFP 阳性 PI 阴性肿瘤细胞分选到含有指定剂量血细胞的 96 孔板中。此外，将 10， 000 个细胞分选到没有正常血细胞的孔中，并使用事实重新分析，以评估分选细胞离心机的纯度和活力。将 96 孔板在 2000 GS 下沉淀 10 分钟以沉淀细胞。
取出 95 μL 的 snat 并将细胞重悬于剩余的 5 μL 中。使用 26 号半规格的微型注射器将细胞悬液注射到 60 天以上的成年同基因斑马鱼的腹膜腔中。斑马鱼在移植前不必进行麻醉。
移植后约 45 天，移植 10 个白血病细胞的 20 条鱼，100 个细胞的 7 条鱼和 5 个具有 10， 000 个高细胞的鱼。用落射荧光显微镜使用 4 85 20 激发波长和 5 30 25 发射滤光片检查受体斑马鱼。检测 GFP 荧光。
记录阳性鱼数与注射鱼总数之比。每 14 天重新检查一次鱼，最多 90 条，并记录阳性鱼的数量。当肿瘤阳性的鱼变得更加丰富时。
通过 trica US 过量处死动物，将结果输入表格并将数据上传到基于网络的极端极限稀释分析软件中，以确定原代 TALL CG 内自我更新的白血病细胞的频率 1 株胚胎注射 RAG 2 个 cmic 和 RAG 2 个 GFP 幼虫筛选原代 TALL 28 天后，与之前的工作一致， 大约 5% 的注射鱼的胸腺内有 GFP 阳性 T 细胞，其中 100% 的鱼会发展为白血病。在这里，从 65 日龄的患病动物中分选荧光标记的高尔细胞，并用于有限稀释细胞移植测定。首先，绘制步态以选择单个细胞。
然后选择碘化丙啶阴性细胞。最后绘制步态以仅选择 GFP 阳性白血病细胞进行分类。在这个 TALL 移植鱼的示例中，第 28 天早期肿瘤被视为注射部位附近的 GFP 阳性细胞区域。
虽然一些 TLS 进展得更严重，已经扩大以填充这些实验的腹膜腔，但移植了 220 多只动物，这可以由一个人在几个小时内轻松完成。使用 elda 软件的数据分析表明，平均每 135 个 T 细胞中就有一个是自我更新的白血病增殖细胞。观看此视频后，您应该对如何在有限稀释度下将肿瘤细胞移植到同基因斑马鱼的腹膜腔中，以及如何使用所得数据来确定给定肿瘤内肿瘤细胞增殖的频率有一个很好的了解。
利用转基因动物的进一步研究可能有助于确定控制这些肿瘤增殖细胞自我更新的机制。
概述
本文描述了在同系鱼中进行限制稀释细胞移植实验的协议，用于研究白血病中的肿瘤传播细胞。该方法包括生成荧光标记的鱼并分离白血病细胞以移植到成年鱼中。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 转基因模型
背景
- 限制稀释实验对于评估肿瘤的自我更新潜力至关重要。
- 同系鱼为研究白血病提供了模型。
- 荧光标记允许轻松识别肿瘤细胞。
- 了解肿瘤传播细胞可以为癌症治疗策略提供信息。
研究目的
- 量化白血病传播细胞的频率。
- 展示分离和移植白血病细胞的方法。
- 利用斑马鱼作为癌症研究模型。
使用的方法
- 将转基因构建体注射到斑马鱼胚胎中。
- 使用荧光活化细胞分选分离白血病细胞。
- 将白血病细胞移植到成年斑马鱼中。
- 使用统计软件监测肿瘤生长并分析结果。
主要结果
- 成功生成带有白血病的荧光标记斑马鱼。
- 分离可移植的活性白血病细胞。
- 使用极限稀释分析定量自我更新的白血病细胞。
- 展示斑马鱼模型在癌症研究中的精确性。
结论
- 斑马鱼中的限制稀释实验对于研究白血病有效。
- 该方法增强了对肿瘤生物学和自我更新的理解。
- 研究结果可能有助于改善癌症治疗。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of tumor-propagating cell frequency is critical for de-risking oncology targets and prioritizing therapeutic strategies. The syngeneic zebrafish limiting dilution assay enables high-throughput, reproducible measurement of self-renewing cell frequency, improving predictive confidence in preclinical models. This approach supports early discovery decisions by providing statistically robust data on tumor-initiating cell populations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying self-renewing cell frequency in tumor models.
- Operational Value: Supports biological de-risking through limiting dilution transplantation in genetically identical hosts.
- Strategic Value: Enhances target confidence by providing limiting dilution-derived frequency metrics for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative tumor-propagating cell frequency data for assay standardization.
- Operational Value: Enables scalable transplantation of hundreds of zebrafish per experiment for reproducible limiting dilution analysis.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness through one-cell transplant capability and long-term engraftment in syngeneic hosts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system for monitoring tumor propagation over 90 days post-transplant.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation via serial transplantation and tumor tracking.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking limiting dilution output to relapse potential.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical modeling by delivering quantitative self-renewal metrics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via limiting dilution transplantation of leukemia cells.
- Screening: Delivers assay reproducibility and quantitative outputs through limiting dilution cell dosing and tumor incidence scoring.
- Analytics: Enables extreme limiting dilution analysis to derive statistical frequency of tumor-propagating cells.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through long-term engraftment and tumor propagation monitoring in syngeneic zebrafish.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for limiting dilution assays across zebrafish cancer models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through accurate self-renewing cell frequency measurement.
- Operational Value: Standardization and scalability via high-number zebrafish transplantation and FACS purification.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions and reduced late-stage biological risk through limiting dilution-derived tumor-propagating cell quantification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on limiting dilution analysis of leukemia-propagating cell frequency.
Implementation Considerations
- Required expertise in zebrafish husbandry, transgenic injection, and fluorescence-activated cell sorting.
- Need for microinjection equipment, FACS, epi-fluorescence microscopy, and extreme limiting dilution analysis software.
- Standardization across labs requires consistent syngeneic zebrafish strains and limiting dilution dosing protocols.
- Adaptation to other cancer models depends on fluorescent labeling and tumor cell isolation feasibility.
- Practical limitation: immune regeneration in non-syngeneic hosts may cause tumor regression, necessitating syngeneic models for long-term studies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:40
DNA Microinjection of Zebrafish Embryos
2:47
Screening for Primary T-ALL in Zebrafish Larvae
3:25
Isolation and Purification of Fluorescently-labeled Primary Leukemia Cells
4:57
Limiting Dilution Transplantation into Adult Zebrafish
5:31
Analysis to Determine: Leukemia-initiating Cell Frequency
6:15
Representative Results
7:26
Conclusion
