Name: 量化传播肿瘤细胞的频率使用斑马鱼的同源有限稀释细胞移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学习使用斑马鱼同源有限稀释细胞移植技术量化白血病传播细胞频率。该方法通过荧光标记和流式分选分离肿瘤细胞，移植至成年斑马鱼腹腔并监测90天，利用极限稀释分析软件精确计算肿瘤自我更新细胞比例，为癌症治疗研究提供重要模型。

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本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号分别为5T32CA09216-26（J.S.B.）、K01 AR055619-01A1和3 K01 AR055619-03S1（D.M.L.），以及亚历克斯柠檬水义卖基金会、哈佛干细胞研究所和美国癌症协会的资助。

1. 斑马鱼胚胎的DNA显微注射
<ol>
<li>线性化 rag2::cMyc 和 rag2::GFP11 通过消化制备DNA构建体 10μg 每种质粒与NotI酶切 37°C 过夜。</li>
<li>酚:氯仿抽提并沉淀质粒，然后将每份质粒重悬于 20μL H2O.</li> 
<li>通过在1%琼脂糖凝胶上电泳分析各消化质粒的1:1、1:5和1:10稀释液，测定DNA浓度 20μL, 10μL 和 5μL 高分子量DNA标准品。这种定量方法通常比分光光度计读数更准确。</li>
<li>将 DNA 稀释至终浓度为 60 ng/μL 在1M KCl + 0.5X TE中，用于通过30ng/注射至CG1品系（或其他同源品系）斑马鱼胚胎μL rag2::cMyc + 30 ng/μLμL rag2::GFP.</li>
<li>注射操作应按照先前演示的方法进行12, 13简而言之，雄性和雌性斑马鱼在注射前一晚被放置于交配室中。注射当天，将DNA注入注射针头，调节压力，使产生一个气泡，其体积约为 50μm 直径被排出（30皮克DNA），通过目镜测微尺进行测量。随后，在单细胞阶段对胚胎进行显微注射，将DNA直接注入细胞内，而非卵黄中。注射后的CG1胚胎及幼体存活率通常较低，仅有约5%的鱼能够成功整合外源转基因；因此， &gt;应注射600枚胚胎，以确保部分鱼只会发生白血病。</li> 
<li>将已注射的胚胎保存于 28.5°C，24小时后移除死亡的胚胎。随后在生命第5天将动物转移至大型水箱，并按先前所述方法进行培育14.</li>
</ol>
2. 在斑马鱼幼体中筛选原发性T细胞急性淋巴母细胞白血病
<ol>
	<li>注射后约28天，在培养皿中向25mL鱼系统水中加入200μL浓度为4ng/mL的Tricaine-S，麻醉幼年斑马鱼。</li>
	<li>使用落射荧光显微镜在20倍放大倍数下观察幼鱼体内荧光标记的T细胞急性淋巴母细胞白血病（T-ALL）发育情况，激发波长为485/20，发射滤光片为530/25，用于检测GFP荧光（图1）。</li>
	<li>将肿瘤阳性的幼鱼与阴性幼鱼分开。阴性幼鱼可在后续时间点再次检查，待肿瘤可能增大后重新评估，以确保未遗漏任何T-ALL阳性个体。</li>
	<li>至少每周一次使用落射荧光显微镜监测T-ALL阳性鱼，追踪肿瘤生长情况。</li>
</ol>
3. 荧光标记的原代白血病细胞的分离与纯化
<ol>
<li>当GFP阳性白血病细胞完全占据 &gt;将50%的动物置于含有9 mL鱼系统水的培养皿中，加入1 mL浓度为4 ng/mL的Tricaine-S，处死鱼类。</li>
<li>将鱼放入新的培养皿中，加入1 mL 0.9X PBS（含5%胎牛血清）以缓冲细胞。用刀片研磨鱼体，用移液器吹打混合物以分散大的细胞团块，然后将细胞悬液通过一个 40μm 将筛网过滤器放入50 mL离心管中。无需将所有组织团块完全解离为单细胞。</li> 
<li>移液器 500μL 将细胞转移至4 mL聚苯乙烯管中。加入 1μL 1 mg/mL 碘化丙啶（PI），用于标记死细胞。涡旋混匀后，将细胞置于冰上保存。</li>
<li>处死一只野生型 CG1 鱼，按上述方法研磨并过滤，以收集正常细胞，用于移植时作为肿瘤细胞的载体。向 50 mL 离心管中加入 4 mL 含 5% FBS 的 0.9X PBS，总体积为 5 mL。</li> 
<li>计数正常细胞，稀释至 3x105 细胞/mL，置于含5% FBS的0.9X PBS中，然后用移液器吸取 100μL/well 96孔板</li>
<li>使用荧光激活细胞分选仪（FACS），将GFP阳性、PI阴性的肿瘤细胞（图2A,B）分选至含有血细胞的96孔板中，分选剂量如下：每孔10个细胞分选至48个孔，每孔100个细胞分选至24个孔，每孔1000个细胞分选至12个孔，每孔10,000个细胞分选至6个孔。此外，另将10,000个细胞分选至不含正常血细胞的孔中，随后使用FACS重新分析，以评估分选细胞的纯度和活力（图2C）。</li> 
</ol>
4. 成年斑马鱼的极限稀释移植
<ol>
<li>通过在 2000×g 条件下离心 96 孔板 10 分钟，使细胞沉淀。</li>
<li>移除 95 μL 上清液，并将细胞重悬于剩余的 5 μL 液体中。</li>
<li>握住一条成年（>60 天龄）同源性斑马鱼，使其腹部朝上，使用 26G/2” 微量注射器将细胞悬液注入腹腔。移植前无需对斑马鱼进行麻醉。通常，45 条鱼注射 10 个白血病细胞，20 条鱼注射 100 个细胞，7 条鱼注射 1,000 个细胞，5 条鱼注射 10,000 个 T-ALL 细胞。</li>
</ol>
5. 分析确定白血病起始细胞频率
<ol>
	<li>移植后约28天，使用485/20 nm激发波长和530/25 nm发射滤光片的落射荧光显微镜检查移植鱼，检测GFP荧光。记录每批注射鱼中呈阳性的鱼的数量与总鱼数的比例。</li>
	<li>此后每14天重新检查一次鱼类，持续至90天，记录阳性鱼的数量。当发现肿瘤阳性鱼进入濒死状态时，采用过量Tricaine-S处死动物。</li>
	<li>将结果填入表格，如图3D所示。将数据上传至基于网页的ELDA（极限稀释分析）统计软件：<a href="http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html">http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html</a>15，该软件利用各移植剂量下肿瘤阳性与阴性动物的频率，计算出原发性T细胞急性淋巴细胞白血病中具有自我更新能力的白血病细胞频率。</li>
</ol>
6. 典型结果：
同源鱼类胚胎的DNA显微注射通常会导致注射后胚胎的存活率较低， &lt;24小时后有60%的胚胎存活。此外，注射后的同系鱼在幼体发育期间的存活率通常较低，常出现 &lt;28天存活率为20%。因此，为了获得能够发育出T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的转基因鱼，注射大量胚胎显得尤为重要。
以CG1品系胚胎为例，将其注射 rag2::cMyc+rag2::GFP转基因在发育中的胚胎中共分离，因此表达GFP的每个细胞也会表达cMyc。在注射后28天对幼鱼进行原发性T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的筛选（图1）。先前的研究表明，约5%的注射鱼在其胸腺中会出现GFP阳性的T细胞（图1），而这些鱼将100%发展为白血病，随着T细胞发生转化11尽管在第28天时，少数斑马鱼可能已发展出较晚期的白血病，易于检测，但大多数个体仅表现为GFP阳性胸腺（图1），因此需在高倍镜下逐个检查幼鱼，以确保筛选出所有阳性个体。GFP阳性的T-ALL细胞将逐渐占据 &gt;在第45至70天期间，动物存活率为50%。 
在本示例中，斑马鱼在出生后65天被处死，分离白血病细胞并通过FACS进行有限稀释移植分选。将碘化丙啶阴性且GFP阳性（图2）的单个细胞分选至96孔板中。对10,000个已分选细胞进行重新分析，以评估细胞活力（理想情况下&gt;95%）和纯度（理想情况下&gt;92%，图2）。移植后的T-ALL通常在28天内出现，但部分肿瘤可能需要超过60天才能形成。在本示例中，第28天时，早期肿瘤表现为注射部位附近出现GFP阳性细胞区域（图3B），而部分T-ALL进展更明显，已扩散至腹腔（图3C）。图3D展示了来自三种不同原发性T-ALL的有限稀释细胞移植实验数据。在这些实验中，共移植了超过220只动物，单人可在数小时内轻松完成。使用ELDA软件进行数据分析显示，平均每135个T-ALL细胞中即有一个具有自我更新能力的白血病起始细胞（图3E）。
<img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig1.jpg" alt="显示基因表达的斑马鱼荧光显微镜图像；绿色荧光蛋白标记。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 在单细胞阶段注射了rag::-cMyc+rag::-eGFP的斑马鱼幼鱼，在注射后28天筛选原发性白血病的生长情况。其中一条鱼（*）胸腺内出现GFP阳性的T细胞；该鱼将随T细胞逐渐转化而发展为T细胞急性淋巴母细胞白血病（T-ALL）。此阶段在第28天非常常见。另一条鱼（**）已出现进展期T-ALL，并已扩散至软组织。其余两条鱼未见肿瘤生长。图像拍摄放大倍数为16倍。
<img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig2.jpg" alt="流式细胞术图谱；单细胞分选；GFP表达；细胞活力分析结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 从患病动物中分选出荧光标记的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞，并用于极限稀释细胞移植实验。首先设定门控以选择单细胞（左上图），然后选择碘化丙啶（propidium iodide）阴性细胞（左中图）。最后设定门控以仅分选GFP阳性的白血病细胞（左下图）。分选后的细胞在移植前应重新分析以评估其活力和纯度（右图）。
<img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig3.jpg" alt="斑马鱼移植后白血病生长阶段及细胞移植数据；包含置信区间图表。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 在细胞移植后28天检测斑马鱼白血病的生长情况。鱼类样本表现为白血病阴性（A），或在注射部位出现小肿瘤（B），或呈现进展性白血病（C）。图像以7倍放大倍数拍摄。每个稀释度下白血病阳性鱼的数量与总移植鱼数量的比值记录如（D）所示。数据输入基于网络的ELDA程序，用于计算具有自我更新能力的白血病细胞数量以及上下95%置信区间（E）。

<ol><li>Zhou, B. -B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-initiating+cells%3A+challenges+and+opportunities+for+anticancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Tumour-initiating cells: challenges and opportunities for anticancer drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 8, 806-823 (2009).</li>
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<li>Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27, 4242-4248 (2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在癌症研究中使用斑马鱼的一个主要优势是，可以在相对较低的成本下使用大量动物。这一点在极限稀释细胞移植实验中尤为重要，因为该实验通过计算移植后发生肿瘤的动物比例来确定肿瘤起始细胞的频率。在本文所介绍的方法中，每次实验使用的移植受体动物超过70只，从而能够准确估算肿瘤传播细胞的数量。所使用的动物数量和移植的肿瘤细胞剂量应根据特定的癌症模型进行优化；例如，如果初步实验表明肿瘤起始细胞较为稀少，则有效的移植剂量可分别为每次移植100,000、50,000、10,000和1,000个细胞。
同源型斑马鱼品系在极限稀释分析中具有重要用途。然而，这些品系尚未在所有实验室中广泛使用，且某些斑马鱼癌症模型仅存在于异源性鱼类中。在经过免疫消融的野生型品系中也可进行极限稀释细胞移植实验，但所计算出的自我更新细胞频率可能比使用同源型斑马鱼时高出10至100倍8。需要注意的是，在向非免疫匹配且经辐照的受体进行移植时，应使用更高剂量的细胞，因为部分肿瘤细胞在移植至异源微环境后无法存活。此外，当受体动物的免疫系统在21天后恢复时，许多肿瘤将开始消退，因此应在移植后每隔7天对动物进行一次肿瘤生长评估。
本文所述方法适用于任何斑马鱼癌症模型，目前已用于测定T细胞急性淋巴母细胞白血病8以及实体瘤模型横纹肌肉瘤16中的肿瘤起始细胞频率。这些肿瘤通过将致癌基因和荧光标记物共同注射到胚胎中而实现荧光标记；由于DNA共同分离，任何表达致癌基因的细胞也将同时表达荧光蛋白17。推荐使用荧光标记，因为它无需处死动物即可追踪肿瘤生长，并可通过FACS简单地分离肿瘤细胞；但也可使用针对肿瘤特异性标志物的抗体对肿瘤细胞进行标记以促进其纯化，尽管在斑马鱼中进行抗体染色可能需要优化。
最后，一旦确定了特定肿瘤类型中肿瘤传播细胞的发生率，就可以利用这些检测方法来鉴定调控其细胞频率的机制。例如，可以在进行极限稀释移植前，用通路特异性抑制剂处理原代肿瘤细胞，或者直接对移植的斑马鱼个体进行药物处理。此外，还可以通过在受精卵单细胞阶段向斑马鱼注射目的基因，从而操控肿瘤本身的遗传特性，使所形成的原代肿瘤过表达该基因。在这些实验中，任何对自我更新细胞频率的影响都将在极限稀释实验中被观察到。

<table><tbody><tr><td>NotI 限制性内切酶</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189</td><td></td></tr><tr><td>苯酚:氯仿</td><td>EMD Millipore</td><td>6805-OP</td><td></td></tr><tr><td>5M KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>100X Tris-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>高分子量 DNA Marker</td><td>Fermentas</td><td>R0621</td><td></td></tr><tr><td>同源性斑马鱼</td><td></td><td>参考文献&lt;sup&gt;6-8&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 生产</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>26G/2&quot; 微量注射器</td><td>Hamilton Co</td><td>80366</td><td></td></tr><tr><td>40&amp;mu;m 细胞滤网</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr></tbody></table>

利用同系斑马鱼中的有限稀释细胞移植法量化肿瘤传播细胞的频率

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

具有自我更新能力的癌细胞是肿瘤中唯一能够无限促进肿瘤生长的细胞类型，因此被称为肿瘤传播细胞或肿瘤起始细胞。人们认为，靶向并清除这些自我更新的细胞将能够阻断肿瘤进展并防止复发，从而显著改善患者的预后1。确定肿瘤中自我更新细胞频率的最常用方法是极限稀释细胞移植实验，该实验将肿瘤细胞以递增的剂量移植到受体动物体内；通过计算产生肿瘤的动物比例，来推算原始肿瘤样本中自我更新细胞的数量2, 3。理想情况下，每次极限稀释实验应使用大量动物，以准确测定肿瘤传播细胞的频率。然而，涉及小鼠的大规模实验成本较高，大多数极限稀释实验每次仅使用10至15只小鼠。
斑马鱼作为一种癌症模型已日益受到重视，这主要归功于其易于进行遗传操作，以及能够以较低成本开展大规模实验。此外，斑马鱼中建立的癌症类型被发现与其对应的人类疾病高度相似4。尽管可通过亚致死剂量照射受体动物，将肿瘤细胞从一条鱼移植到另一条鱼，但受体免疫系统在21天后通常会再生，从而导致肿瘤消退5。近年来建立的同源性斑马鱼品系极大促进了肿瘤移植研究6-8。由于这些个体在遗传上完全相同，移植的肿瘤细胞可在受体鱼体内稳定植入，并能长期监测肿瘤的生长情况。同源性斑马鱼特别适用于限制性稀释移植实验，因为肿瘤细胞无需适应异源微环境中的生长，从而避免了对自我更新细胞频率的低估9, 10。此外，研究人员已成功利用同源性斑马鱼完成单细胞移植8，并且可一次性高效、经济地完成数百只动物的移植，这些优势均有助于更准确地估算自我更新细胞的频率。
本文介绍了一种在同源性斑马鱼中建立原发性荧光标记的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL），并通过极限稀释法将这些肿瘤移植到成年斑马鱼中以测定自我更新细胞频率的方法。尽管以白血病为例进行说明，但该方案适用于利用斑马鱼中的任何癌症模型来测定肿瘤传播细胞的频率。

限制性稀释细胞移植实验用于测定肿瘤传播细胞的频率。本方案描述了一种生成同基因型斑马鱼的方法，这些斑马鱼可发育出荧光标记的白血病，并详细说明如何分离这些白血病细胞，并以限制性稀释方式将其移植至成年斑马鱼的腹腔内。

具有无限促进肿瘤生长能力的自我更新癌细胞是肿瘤中唯一具备此种特性的细胞类型，因此被称为……

极限稀释细胞移植实验是评估实验动物模型中自我更新潜能的金标准。在本实验中，将单细胞期的同系斑马鱼胚胎注射 rag2 MIC 和 RAG2 GFP，以产生可发育出荧光标记的T细胞急性淋巴母细胞白血病的转基因斑马鱼。在出生后60天，从斑马鱼中分离出原代白血病细胞，然后通过荧光激活细胞分选进行纯化。接下来，将细胞以极限稀释法移植到成年斑马鱼的腹腔中，并持续监测鱼类肿瘤生长情况，最长可达90天。最后，使用极限稀释分析统计学软件程序来定量原始肿瘤中白血病传播细胞的频率。极限稀释细胞移植分析可使研究人员准确评估肿瘤组织中所含自我更新细胞的数量。正是这些具有自我更新能力的细胞推动了癌症的形成，并最终导致疾病复发。在斑马鱼模型中进行极限稀释移植实验的主要优势在于，每次实验可移植大量斑马鱼，从而在确定自我更新型肿瘤传播细胞频率时获得更高的精确度。该方法有助于深入了解T细胞急性淋巴细胞白血病中的肿瘤传播细胞。该方法也可用于研究其他斑马鱼癌症模型。今天，实验室的博士后研究员 Jessica Blackburn 和技术员 Sally Liu 将为您演示实验操作流程：为线性化 Rag2 CM 和 RAG2 G-F-P-D-N-A 载体，需在 37°C 条件下，用限制性内切酶 NotI 对每种质粒各 10 微克进行过夜消化。经苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀后，将每种质粒溶解于 20 微升水中。通过将每种消化后的质粒与20微升、10微升和5微升的高分子量DNA Marker按1:1、1:5和1:10的比例稀释，在1%琼脂糖凝胶上测定DNA浓度。随后将DNA稀释至终浓度为60纳克/微升，用于注射CG一株syngen。向斑马鱼胚胎注射250纳升、浓度为30纳克/微升的rag二CM和30纳克/微升的DNA。将Rag2-GFP注入单细胞期斑马鱼胚胎，小心地将DNA直接注入细胞而非卵黄中。将注射后的胚胎置于28.5°C条件下培养，在受精后24小时及5天时移除死亡胚胎。注射约28天后，将存活个体转移至大型养殖水箱中。在培养皿中向25毫升养殖用水加入200微升浓度为4纳克/毫升的Tricaine，以麻醉斑马鱼幼体。使用落射荧光显微镜检测GFP荧光，观察幼鱼中荧光标记的TALL发育情况。将肿瘤阳性的幼鱼与阴性幼鱼分开，以确保在分析中不会遗漏任何白血病鱼。阴性幼鱼可在后续时间点再次检查，待肿瘤可能增大后再进行观察。每周至少使用落射荧光显微镜观察一次荧光标记的白血病鱼，以监测肿瘤的生长情况。当GFP阳性白血病细胞在动物体内占比超过50%时，向含有九毫升鱼系统用水的培养皿中加入一毫升浓度为每毫升四纳克的Trica S，以处死斑马鱼。将鱼转移至新的培养皿中，该培养皿内含有一毫升含5%胎牛血清的0.9倍PBS溶液，用刀片研磨组织，通过移液操作使大的细胞团块解离，随后将细胞悬液经40微米细胞滤网过滤至50毫升离心管中。用移液器将500微升细胞加入到一个4毫升的聚苯乙烯管中。加入1微升浓度为1毫克/毫升的碘化丙啶，以标记死细胞，涡旋混匀，然后将细胞置于冰上。同时准备野生型CG1鱼，收集正常血细胞，用于在移植过程中作为肿瘤细胞的载体；将4毫升含5% FPS的0.9倍PBS加入50毫升管中，总体积为5毫升。将正常血细胞用含5% FBS的0.9 × PBS稀释至3 × 10⁵ 个细胞/毫升，然后每孔加入100 µL至96孔板中。使用荧光激活细胞分选仪，将GFP阳性、PI阴性的肿瘤细胞按指定剂量分选到含有正常血细胞的96孔板各孔中。此外，将10,000个细胞分选至不含正常血细胞的孔中，并使用FACS重新分析，以评估分选细胞的纯度和活力。将96孔板在2000 × g离心10分钟，使细胞沉淀。移除95 µL上清液，并将细胞重悬于剩余的5 µL中。使用26.5号微量注射器将细胞悬液注射到60日龄以上的成年同系型斑马鱼的腹腔内。移植前无需对斑马鱼进行麻醉。移植约28天后，将45条斑马鱼每条接种10个白血病细胞，20条斑马鱼每条接种100个细胞，7条斑马鱼每条接种1000个细胞，以及5条斑马鱼每条接种10,000个TALL细胞。使用激发波长为485/20、发射滤光片为530/25的落射荧光显微镜检查受体斑马鱼，以检测GFP荧光。记录每批注射鱼类中呈阳性的鱼的数量占注射鱼总数的比例。每隔14天对鱼类进行一次重新检查，持续最多90天，并记录呈阳性的鱼的数量。当肿瘤呈阳性的鱼数量增多时。通过三卡因过量处死动物，将结果输入表格，并将数据上传至基于网络的极限稀释分析软件，以确定原代 T-ALL CG1 品系胚胎中自我更新型白血病细胞的频率。这些胚胎被注射了 RAG2-cmyc，RAG2-GFP 幼鱼经筛选获得原代 T-ALL。根据先前的研究，在注射后 28 天，约 5% 的注射鱼在其胸腺中出现 GFP 阳性的 T 细胞，且这些鱼将 100% 发生白血病。在此，从 65 日龄患病动物中分选出荧光标记的 T-ALL 细胞，并用于极限稀释细胞移植实验。首先，绘制门控以选择单个细胞。然后选择碘化丙啶阴性细胞。最后绘制门控以仅选取GFP阳性的白血病细胞进行分选。在此例移植了T-ALL的斑马鱼中，第28天时的早期肿瘤表现为注射部位附近存在GFP阳性细胞区域。尽管部分 TLS 肿瘤进展更为明显，在本实验中已扩展至充满腹腔，但总共移植了超过 220 条动物，这一过程可由一人在数小时内轻松完成。使用 elda 软件进行数据分析显示，平均每 135 个 T 全细胞中即有一个具有自我更新能力的白血病传播细胞。观看本视频后，您应能充分掌握如何将肿瘤细胞以极限稀释法移植至同系斑马鱼的腹腔，以及如何利用所得数据确定特定肿瘤内肿瘤传播细胞的频率。利用基因修饰动物开展的进一步研究可能有助于揭示调控这些肿瘤传播细胞自我更新的机制。

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生物学

量化传播肿瘤细胞的频率使用斑马鱼的同源有限稀释细胞移植

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斑马鱼异种移植实验：一种评估治疗药物在斑马鱼体内对肿瘤发生抑制效果的方法

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斑马鱼幼鱼异种移植模型的建立及肿瘤行为分析

临床前模型旨在增进对癌症生物学的认识并预测治疗效果。本文描述了利用肿瘤组织碎片建立基于斑马鱼的患者来源异种移植模型（zPDXs）的方法。对zPDXs进行化疗处理，并通过检测移植组织中细胞的凋亡情况来评估其治疗效果。...

建立胰腺癌斑马鱼患者来源异种移植模型用于化疗敏感性测试

我们描述了一种将异种移植物移植到透明斑马鱼胚胎卵黄中的实验方案，该方案通过一种简单快速的分期方法进行了优化。注射后的分析包括检测异种移植细胞的存活情况以及通过流式细胞术评估疾病负荷。...

一种在透明斑马鱼胚胎中进行肿瘤异种移植分析的简单、快速且有效的方法

我们采用细胞增殖染色法来鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴母细胞白血病模型中的静息细胞。该染料在不分裂的细胞中得以保留，而在细胞增殖过程中信号减弱，从而能够筛选出处于静止状态的细胞以进行后续分析。本方案提供了一种功能性工具，用于在细胞静息背景下研究自我更新能力。...

利用细胞增殖染色鉴定斑马鱼T细胞急性淋巴细胞白血病模型中的静息细胞

本方案提供了从细胞系和新鲜患者样本在短暂免疫抑制的斑马鱼胚胎中建立人急性淋巴细胞白血病（ALL）异种移植模型并进行问题排查的逐步操作指南，同时包含使用流式细胞术评估药物反应的指导原则。该实验流程也可根据需要调整用于实体瘤研究。...

快速 体内 利用斑马鱼胚胎中的白血病细胞移植预测药物反应

学习使用斑马鱼同源有限稀释细胞移植技术量化白血病传播细胞频率。该方法通过荧光标记和流式分选分离肿瘤细胞，移植至成年斑马鱼腹腔并监测90天，利用极限稀释分析软件精确计算肿瘤自我更新细胞比例，为癌症治疗研究提供重要模型。

利用同系斑马鱼中的有限稀释细胞移植法量化肿瘤传播细胞的频率

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