利用荧光融合蛋白报告器可视化并定量分析基因毒素诱导的细胞内PARP1/PARP2活化
April 17th, 2026
本文介绍了一种基于细胞的可视化、亚细胞定位及定量分析固定哺乳动物细胞中多（ADP-核糖）（PAR）富集灶的方法。该检测法能够定量DNA损伤诱导PARP激活的位点，包括与碱基切除修复或单股断裂修复相关的部位，均发生在基因毒素暴露细胞的细胞核中。
我们实验室研究正常细胞和转化细胞中依赖PARP1和PARP2的DNA修复及DNA损伤反应通路。该领域的一个挑战是如何在避免细胞裂解的情况下定量分析细胞中PARP1和PARP2的活化。这使得亚细胞定位研究成为可能。
首先，在1.5毫升无菌微离心管中加入375微升胎儿牛血清和青霉素-链霉素游离心组。然后，将10微升脂质转染试剂和所有必需质粒加入试管。轻轻敲击微离心管，混合培养基、转染试剂和质粒DNA。
在室温下培养15至30分钟，以促进DNA和转染试剂复合物的形成。接着，将质粒和转染试剂混合物滴入60毫米盘中，内含培养的293FT细胞，不取出培养基，并将细胞放回培养箱48小时。然后，从转染的293FT细胞中收集培养基。
要分离慢病毒颗粒，需将收集的培养基通过无菌0.45微米滤网过滤，以分离慢病毒颗粒中的细胞残渣。转导时，培养24小时并确认细胞汇聚度在20%至40%之间。接着，将一毫升病毒、一毫升培养基和两微升聚苯加入15毫升锥形管，轻柔倒置混合。现在，将培养基从六孔板上取出。
将病毒、介质和聚苯乙烯混合物加入每个井中。将带有转导混合物的细胞放入含有湿度、32摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，浸泡16至18小时。验证RNF146氨基酸（100至182个EGFP）的表达，每个含有盖片的培养皿中种子20万个LivePAR表达细胞。
让细胞24到36小时附着在覆盖层上，调理培养基，开始复制。然后将表达LivePAR的细胞暴露在给定试剂中。将化合物直接加入含有细胞的培养基中，然后在培养皿中轻轻旋转培养基，以分布化合物。
将60毫米的盘子在37摄氏度下孵育60至90分钟。要固定细胞，取出培养基并用PBS清洗细胞。在室温下，将细胞先用4%甲醛浸泡在PBS中，浸泡15分钟。
去除甲醛后，用PBS洗涤细胞三次。然后，以7：3的比例向细胞中加入3毫升冷甲醇和丙酮，使其固定。将盘子放在零下20摄氏度，浸泡九分钟。
然后，去除甲醇丙酮溶液。用PBS清洗细胞三次后，移液器将15微升含DAPI的抗淡化介质移液到玻片上。轻轻地将盖套装在装载介质上，使电池朝内，同时尽量减少气泡。
将盖子套套固定在玻璃滑套上，并在边缘涂上少量透明指甲油封闭两侧。将滑套放在黑暗中，让指甲釉质干燥。下载并安装图片J后，打开图片J，点击插件，选择宏，安装宏文本文件LivePAR_Macro，选择安装。
打开图像J中的所有共軛焦文件，并将文件保存为TIFF文件以保留原始文件。然后打开一个电子表格文档，保存为Date_CellLineFociAnalysis。一次分析一个TIFF文件。
按1查找原子核。当ROI管理器窗口打开时，选择所有条目并按添加，将原子核区域覆盖在原始图像上。删除错误识别的核，排除不完全在框架内的核。
然后，使用自由手选工具绘制原子核，按2来量化PAR焦点。在ROI管理器中选择每个核，并计算每个核的焦点数。在给文件中所有核点评分后，将量化数据复制粘贴到打开的电子表格文档中。
同样，对所有多伦多国际电影节文件重复分析。完成后，在所选软件中绘制每个原子核的PAR焦点图。载体对照细胞显示全细胞EGFP染色。
基因毒素处理的细胞显示细胞核灶在细胞核内聚集，代表定位。PARP1和PARP2抑制剂甲肝苯的预处理导致PAR焦点丧失。对每个核PAR焦点数量随时间和处理条件的函数进行定量分析显示了类似结果。
该方案使我们能够量化PARP1和PARP2信号轴在基因改变和基因改变后对PARP1和PARP2信号轴的激活。我们采用了传统免疫荧光技术，验证了与多ADP-核糖蛋白的共定位。展望未来，我们将利用该检测方法进行基因毒性检测，用于高通量分析PARP1、PARP2或PARP抑制剂，并识别参与PARP1和PARP2信号传导的新颖因素。
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Overview
This article presents a quantitative, cell-based assay for visualizing and measuring poly(ADP-ribose) (PAR) accumulation in response to DNA damage. By using a PAR-binding domain (PBD) from RNF146 fused to enhanced green fluorescent protein (EGFP), the protocol enables real-time analysis of PARP1 and PARP2 activation and PAR foci formation in mammalian cells without cell lysis. The method combines lentiviral transduction, confocal microscopy, and semi-automated image analysis to assess DNA repair dynamics.
Key Study Components
Area of Science
- DNA repair
- Cellular imaging
- Molecular biology
Background
- PAR is a post-translational modification synthesized mainly by PARP1 and PARP2 in response to DNA breaks.
- PAR levels are regulated by both synthesis (PARP1/PARP2) and degradation (PARG).
- PAR chains recruit DNA repair and DNA damage response (DDR) factors via specific PAR-binding domains (PBDs).
- Quantitative, live-cell analysis of PAR dynamics is challenging but essential for understanding DNA repair processes.
Purpose of Study
- To develop a live-cell assay for quantifying PAR accumulation and PARP1/PARP2 activation.
- To enable subcellular localization studies of PAR foci in response to DNA damage.
- To facilitate high-throughput genotoxicity testing and identification of novel PARP pathway factors.
Methods Used
- Production of lentiviral particles encoding RNF146 (PBD/WWE domain)-EGFP fusion protein.
- Transduction of mammalian cells and validation of LivePAR-EGFP expression.
- Treatment of cells with genotoxins and PARP inhibitors to induce or inhibit PAR formation.
- Fixation, confocal fluorescence microscopy, and semi-automated quantification of PAR foci using ImageJ macros.
Main Results
- Vehicle control cells displayed diffuse EGFP staining, while genotoxin-treated cells showed nuclear PAR foci.
- Pretreatment with PARP1/PARP2 inhibitor veliparib abolished PAR foci formation.
- Quantification revealed dynamic changes in PAR foci per nucleus depending on treatment and time.
- The assay was validated by colocalization with traditional immunofluorescence techniques.
Conclusions
- The protocol enables quantitative, live-cell analysis of PARP1/PARP2 activation and PAR accumulation.
- It is suitable for high-throughput genotoxicity testing and screening of PARP inhibitors.
- The method can identify novel factors involved in PARP signaling and DNA repair pathways.
