Name: 利用荧光融合蛋白报告器可视化并定量分析基因毒素诱导的细胞内PARP1/PARP2活化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T13:48:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 了解利用荧光融合蛋白报告器可视化并定量分析基因毒素诱导的细胞内PARP1/PARP2活化的方法。该技术结合慢病毒转导、共聚焦显微镜和半自动化图像分析，实现哺乳动物细胞中DNA修复动态的实时监测。

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特别感谢南阿拉巴马大学的Marie Migaud多年来在NRH供应方面的持续支持以及她提供的专业建议。Sobol实验室在DNA修复、DNA损伤分析以及基因毒性暴露影响方面的研究 &amp;#38; 复制应激研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）[ES029518、ES028949、CA238061、CA236911、AG069740 和 ES032522] 及美国国家科学基金会（NSF）[NSF-1841811] 的资助。R.W.S. 还获得了 Legoretta 癌症中心捐赠基金的支持。

1. 慢病毒生产
注意：本实验方案采用第三代慢病毒包装系统42,43，以生成表达基因编码的 PAR 报告分子的细胞。慢病毒颗粒在 293FT 细胞中通过四质粒系统产生，该系统包含包膜、调控和包装组分，以及编码 EGFP 标记的 RNF146 WWE 结构域的 pLV-EF1A-LivePAR-Hygro 载体，该结构域能够结合多聚（ADP-核糖）链。所获得的病毒可用于建立稳定细胞系，以实现对 PAR 积累的可视化与定量分析。
<ol>
	<li>在37 ˚C、5% CO₂的湿润环境中，使用含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养低传代293FT细胞2确保293FT细胞的培养时间不超过3周。 
	注意：我们常规使用传代次数在3到10代之间的293FT细胞。293FT细胞通过SV40大T抗原转化并获得永生化特性。这些细胞具有较高的转染效率，对于重组蛋白表达和基因表达研究至关重要。它们对脂质体转染和病毒转导均具有良好的响应性。&#160;方法</li>
	<li>接种 1.7 × 105 第1天将293FT细胞接种至60 mm组织培养皿中，培养基终体积为5.5 mL。将细胞放回培养箱中培养24小时。</li>
	<li>第2天（转染当天），向一个1.5 mL无菌微量离心管中加入375 µL不含FBS和青霉素/链霉素的DMEM培养基。然后依次加入10 µL脂质体转染试剂、4 µg pLV-EF1A-LivePAR-Hygro质粒、2 µg pMD2.g(VSVG)质粒、2 µg pRSV-REV质粒和2 µg pMDLg/pRRE质粒。轻轻弹击微量离心管以混匀培养基、转染试剂和质粒DNA（避免涡旋振荡）。室温孵育15–30分钟，使DNA与转染试剂形成复合物。</li>
	<li>将质粒/转染试剂混合物逐滴加入含有待转染293FT细胞的60 mm培养皿中，无需更换培养基。将细胞放回培养箱中孵育48 h。 
	注意：此阶段用于慢病毒颗粒在生长培养基中的产生与释放。</li>
	<li>第4天，收集转染后的293FT细胞的培养基以分离慢病毒颗粒。使用无菌的0.45 µm滤器过滤，以去除细胞碎片并分离慢病毒颗粒。</li>
	<li>使用现有试剂测定慢病毒滴度（可选）。 
	注意：该方法通常可获得 105 至 106 每毫升感染单位（IFU/mL），按下方转导步骤所述使用时，相当于约5的感染复数（MOI）。</li>
	<li>将含有慢病毒颗粒的培养基分装至四个无菌冻存管中（每管1.0 mL），于 -80 ˚C 保存。</li>
</ol>
2. 转导
注意：本部分概述了用于将外源基因导入细胞系的慢病毒转导实验方案（图1B）。该方法在本实验室中始终表现出良好的转导效果1,3,33,37,44,45。
<ol>
	<li>在37 ˚C、5% CO2的加湿环境中，使用适当的培养基培养所选细胞系（低代次）。 
	注意：应从所需细胞类型的早期代次开始。用于转导的细胞需先解冻一管新细胞，并至少传代一次后再进行接种。</li>
	<li>第1天，在6孔板的每孔中加入2 mL生长培养基，接种1 × 105–1.5 × 105个细胞。将细胞放回培养箱中培养24小时。</li>
	<li>第2天（转导当天），确保细胞融合度在20%至40%之间。取1 mL病毒液、1 mL生长培养基和2 µL聚凝胺（Polybrene，2 mg/mL储存液）加入15 mL锥形管中，轻轻颠倒混匀（避免涡旋）。 
	注意：在慢病毒转导过程中使用聚凝胺可防止病毒颗粒与细胞膜之间的静电排斥。由于聚凝胺带正电荷，可与带负电荷的病毒糖蛋白相互作用，中和其电荷。此外，聚凝胺还能结合培养基中的糖胺聚糖，阻止其与病毒相互作用。因此，聚凝胺可显著提高转导效率。</li>
	<li>吸除6孔板中的生长培养基，将病毒/培养基/聚凝胺混合液加入各孔中。将含有转导混合液的细胞置于32 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育16–18小时。 
	注意：在慢病毒转导期间将细胞于32 °C过夜孵育是一种常见但非必需的操作，可显著提高病毒感染效率。降低温度会减缓细胞代谢，从而削弱细胞防御机制，增加对病毒感染的敏感性。</li>
	<li>第3天，将转导后细胞的培养基更换为新鲜培养基，并转移至37 °C培养箱中继续培养48小时。 
	注意：此2天的培养足以使细胞表达RNF146(100–182)-EGFP转基因，并获得潮霉素抗性。</li>
	<li>为建立稳定表达RNF146(100–182)-EGFP转基因的多克隆稳定细胞系，可在孵育2天后按步骤2.5所述开始潮霉素筛选。
	<ol>
		<li>或者，在无潮霉素条件下扩增这批转导细胞，并在接下来的10–14天内用于PAR分析（瞬时转导），具体方法如前所述1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当细胞在潮霉素存在下生长后，转移至100 mm培养皿中，并根据需要进行扩增。</li>
	<li>为后续使用制备转导细胞的冷冻保存样本。</li>
	<li>按照第3节所述，通过共聚焦显微镜验证RNF146(100–182)-EGFP转基因的表达。RNF146(100–182)-EGFP转基因将在整个细胞中表达。</li>
	<li>通过免疫印迹法验证RNF146(100–182)-EGFP转基因的表达，具体方法见其他文献1,37。</li>
</ol>
3. 共聚焦显微镜观察与分析
注意：本实验方案部分详细描述了盖玻片的制备、表达LivePAR的细胞接种、处理因素（tBuOOH、MNNG、PARGi、PARPi 和/或 NRH）的暴露，以及在显微镜载玻片上制备固定细胞以进行共聚焦成像和PAR焦点分析（图1C）。同时介绍了使用ImageJ软件及自定义宏对PAR焦点进行半自动定量分析的方法。该方案可用于研究多种因素（例如小分子化合物、BER通路蛋白基因敲除）对DNA损伤依赖性PAR化修饰的影响，已在本实验室成功应用34,37。
<ol>
	<li>盖玻片准备
	<ol>
		<li>在通风橱中，将 20 × 20 mm 的盖玻片置于玻璃容器内，用二乙醚浸泡 20 分钟。 
		注意：由于二乙醚具有可燃性及潜在危害，操作时必须使用通风橱。</li>
		<li>移除二乙醚，并用浓度递减的乙醇溶液清洗盖玻片 [100%、70%、50%，然后 0% (ddH2O)]。</li>
		<li>移除水溶液，并将盖玻片置于 1 N HCl 中，在轻微振荡条件下浸泡 20 分钟。</li>
		<li>移除 HCl，并用 ddH2O 洗涤盖玻片 3 次。</li>
		<li>将盖玻片保存在 70% 乙醇中，4 °C 条件下保存至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞接种
	<ol>
		<li>在 60 mm 细胞培养皿中并排放置两张 20 × 20 mm 的无菌盖玻片。根据实验需要准备相应数量的培养皿。在向含盖玻片的培养皿中加入细胞前，确保所有乙醇已完全挥发。可通过向培养皿中加入无菌 PBS 清洗 10–15 分钟以去除残留乙醇；接种细胞前移除 PBS。</li>
		<li>每张细胞培养皿接种 200,000 个表达 LivePAR 的细胞。让细胞在盖玻片上贴壁 24–36 小时，使培养基条件化并开始复制（生长）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导 PAR 焦点形成
	<ol>
		<li>将表达 LivePAR 的细胞暴露于 100 µM NRH、10 µM PARGi 和 10 µM MNNG 或 40 µM tBuOOH 中。此外，为检测 PARP1/PARP2 依赖性的 PAR 形成，可通过加入 10 µM PARPi 抑制 PARP1/PARP2。将化合物直接加入含有盖玻片上细胞的培养基中，并轻轻晃动培养皿以均匀分布化合物。将 60 mm 培养皿在 37 ˚C 条件下孵育 60–90 分钟。 
		注意：NRH 用于确保细胞内有足够的 NAD+ 水平，以实现 PARP1/PARP2 介导的 PAR 链修饰的最佳效果33,46,47。PARGi 用于防止 PARG 降解由 PARP1/PARP2 合成的 PAR 链。MNNG 或 tBuOOH 用于诱导 DNA 碱基修饰，从而启动碱基切除修复（BER），进而激活 PARP1/PARP2。PARPi 用于确认信号（焦点）来源于 PARP1/PARP2 的激活。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞固定及盖玻片封片
	<ol>
		<li>移除培养基，并用 PBS 洗涤。 
		注意：用 PBS 洗涤一次或两次非常重要，因为细胞培养所用的培养基含有高浓度的血清蛋白。PBS 洗涤还可去除培养基中残留的 MNNG 或 tBuOOH。</li>
		<li>在室温下用含 4% 甲醛的 PBS 预固定 15 分钟。用 PBS 洗涤细胞 3 次。</li>
		<li>向细胞中加入 3 mL 冷的（-20 °C）甲醇:丙酮（7:3）进行固定。将培养皿置于 -20 °C 条件下 9 分钟。</li>
		<li>移除甲醇:丙酮混合液。用 PBS 洗涤 3 次。</li>
		<li>在载玻片上滴加 15 µL 含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂。将盖玻片细胞面向内轻轻封于封片剂液滴上，尽量减少气泡产生。</li>
		<li>通过在盖玻片边缘涂少量透明指甲油，将盖玻片居中、固定并密封边缘。将载玻片置于暗处，使指甲油干燥（约 10 分钟）。将载玻片避光保存于 4 ˚C，待成像时使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞成像
	<ol>
		<li>使用共聚焦显微镜，以 63× 放大倍数对所有载玻片至少进行 10 次成像。使用 488 nm 激光检测 PAR 焦点，使用 405 nm 激光检测细胞核染色（DAPI）（例如，参见 图 2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共聚焦图像分析
	<ol>
		<li>创建一个包含以下文本的文本文件，并将其命名为“LivePAR_Macro”。该宏可实现对表达 LivePAR 的细胞核中 PAR 焦点的“自动”定量： 
		&#8203;macro &#34;DAPI positive staining [1]&#34; { 
		tit=getTitle(); 
		run(&#34;Duplicate...&#34;, &#34;title=DAPI duplicate&#34;); 
		selectWindow(&#34;DAPI&#34;) 
		run(&#34;8-bit&#34;); 
		run(&#34;Split Channels&#34;) 
		selectWindow(&#34;C2-&#34;+&#34;DAPI&#34;); 
		close(); 
		selectWindow(&#34;C1-&#34;+&#34;DAPI&#34;); 
		run(&#34;Gaussian Blur...&#34;, &#34;Sigma=3&#34;); 
		setAutoThreshold(&#34;Default&#34;); 
		run(&#34;Make Binary&#34;); 
		run(&#34;Invert&#34;) 
		run(&#34;Fill Holes&#34;) 
		run(&#34;Watershed&#34;) 
		run(&#34;Analyze Particles...&#34;, &#34;size=50.00-Infinity circularity=0.00-1.00 show=Outlines add exclude include in_situ&#34;); 
		rename(&#34;DAPI_&#34;+tit); 
		selectWindow(&#34;DAPI_&#34;+tit); 
		close(); 
		} 
		macro &#34;PAR [2]&#34; { 
		setBatchMode(true); 
		run(&#34;8-bit&#34;); 
		t=getTitle(); 
		run(&#34;Duplicate...&#34;, &#34;title=GB1 duplicate&#34;); 
		run(&#34;Duplicate...&#34;, &#34;title=GB20 duplicate&#34;); 
		selectWindow(&#34;GB20&#34;) 
		run(&#34;Gaussian Blur...&#34;, &#34;radius=20 stack&#34;); 
		selectWindow(&#34;GB1&#34;); 
		run(&#34;Gaussian Blur...&#34;, &#34;radius=1 stack&#34;); 
		imageCalculator(&#34;Subtract create stack&#34;, &#34;GB1&#34;,&#34;GB20&#34;); 
		selectWindow(&#34;GB1&#34;); 
		close(); 
		selectWindow(&#34;GB20&#34;); 
		close(); 
		selectWindow(&#34;Result of GB1&#34;); 
		rename(&#34;Blank_GB1-GB20_&#34;+t); 
		title = getTitle(); 
		run(&#34;Split Channels&#34;) 
		selectWindow(&#34;C1-&#34;+title); 
		close(); 
		selectWindow(&#34;C2-&#34;+title); 
		setThreshold(90,255) //90 的值可根据实验变异性进行调整 
		run(&#34;Analyze Particles...&#34;, &#34;size=0.00-200 circularity=0.00-1.00 show=Masks summarize&#34;); 
		close (&#34;C2-&#34;+title); 
		selectWindow(&#34;Mask of C2-&#34;+title); 
		close (); 
		setBatchMode(false); 
		}</li>
		<li>在计算机上下载并安装 ImageJ（https://imagej.net/ij/download.html）。</li>
		<li>打开 ImageJ，点击 Plugins | Macros | Install 安装宏（文本文件：LivePAR_Macro）。</li>
		<li>在 ImageJ 中打开所有共聚焦文件，并将其另存为 *.tif 文件，以保留原始文件。</li>
		<li>打开一个电子表格文档，并将其保存为 [日期]_[细胞系]_焦点分析。</li>
		<li>一次分析一个 *.tif 文件。按下 1 键以识别细胞核；当标题为 ROI Manager 的窗口打开时，选中窗口中的所有条目，然后按下 add 键，将细胞核区域叠加到原始图像上。删除识别错误的细胞核。使用 freehand selection 工具手动绘制细胞核，然后按下 2 键以定量 PAR 焦点。 
		注意：不要包含未完全处于视野内的细胞核。</li>
		<li>在 ROI manager 中逐个选择每个细胞核，并按下 2 键。将显示一个计数，表示所选细胞核内的焦点数量。当文件中所有细胞核的焦点均计数完毕后，将信息复制并粘贴到打开的电子表格文档中。</li>
		<li>对所有 *.tif 文件重复步骤 3.6.6 和 3.6.7。</li>
		<li>在所选软件中绘制 每个细胞核的 PAR 焦点数（例如，参见 图 3）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

R.W.S. 是 Canal House Biosciences, LLC 的联合创始人，担任科学顾问委员会成员并持有该公司股权，但该公司未参与本研究，相关咨询工作也与本研究无关。作者声明不存在利益冲突。

LivePAR 检测法旨在检测细胞核基因组 DNA 损伤位点，这些位点处 PARP1/PARP2 正在活跃合成 PAR 链。为实现这一目标，将编码 RNF146 WWE 结构域（氨基酸 100–182）的片段与 EGFP 融合1,2,3,37。我们此前描述的其他 PAR 探针包括：EGFP 与 DTX4 的氨基酸残基 1–166、PARP11 的氨基酸残基 22–112 以及 DTX2 的氨基酸残基 1–178 的融合蛋白，这些均编码一个扩展的 WWE 结构域37，可识别 PAR 中的异-ADP-核糖基团。此外，我们近期还报道了一种类似的 PAR 探针，其中 EGFP 与来自 Af1521 的工程化大结构域（macrodomain）融合37，后者最初由 Nowak 等人开发，作为与 IgG...

本方案描述了LivePAR检测法，该方法可用于在哺乳动物细胞中可视化并定量分析基因组损伤位点处的多聚（ADP-核糖）（PAR），这些位点主要与碱基切除修复（BER）或单链断裂修复（SSBR）相关1,2,3。BER是一种关键的DNA修复通路，负责清除DNA中受损或被修饰的碱基（有关BER和PAR化修饰的综述，参见4,5,6,7）。BER起始于DNA糖基化酶，这类酶识别并切除被修饰的碱基4，留下一个无嘌呤/无嘧啶（AP）位点，例如甲基嘌呤糖基化酶（MPG）可切除甲基化碱基8,9，或8-氧代鸟嘌呤糖基化酶（OGG1）可切除8-氧代鸟嘌呤（8-oxoG）9,10。随后，AP位点被AP内切酶1（APE1）切割11,12,13，从而在DNA骨架上产生一个切口。接着，由DNA聚合酶β（Polβ）作为主要聚合酶，以未受损链为模板对缺口进行加工和填补14,15，最后由DNA连接酶封闭修复后的链16,17，例如DNA连接酶I或DNA连接酶III。
在碱基切除修复（BER）和单链断裂修复（SSBR）中起关键作用的是聚ADP-核糖聚合酶1和2（PARP1/PARP2）18,19,20，这些酶能够快速识别BER或SSBR过程中的DNA链断裂。当检测到这些断裂后，PARP1/PARP2通过水解NAD+催化自身及其他蛋白质上添加ADP-核糖多聚物——这一过程称为PAR化修饰（PARylation）（综述见6）。这会形成一种动态的蛋白质支架（PAR），招募其他DNA修复因子至损伤位点，从而提高DNA修复的保真度。为了调控这种动态的PAR支架，多种蛋白质参与了PAR链的水解与清除，包括ADP-核糖受体水解酶3（ARH3）、末端ADP-核糖糖苷水解酶1（TARG1）、单ADP-核糖基水解酶1/2（MacroD1/2）以及聚ADP-核糖糖水解酶（PARG）6,21,22,23,24,25,26。然而，PARG是该过程的主要执行者21,27，在DNA损伤应答（DDR）中发挥关键作用28,29。
因此，PARG 与 PARP1 和 PARP2 的功能密切相关。PARP1 和 PARP2 负责合成 PAR 多聚物，而 PARG 则作为一种&#34;清理&#34;酶，通过水解这些多聚物，有效逆转 PAR 修饰30,31。该过程对于完成碱基切除修复（BER）和单链断裂修复（SSBR）至关重要，同时也使 PARP1/PARP2 能够被循环利用，以响应新的 DNA 损伤。因此，PARP1、PARP2、PAR 修饰和 PARG 协同作用，通过 BER 和 SSBR 实现高效且可逆的 DNA 修复4,6。
PAR修饰的程度可受多种因素影响，并在整体DNA损伤应答中发挥关键作用32。这些因素包括暴露于可在DNA碱基上添加加合物的基因毒素，例如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）、甲基磺酸甲酯（MMS）、过氧化氢（H2O2）或叔丁基过氧化氢（tBuOOH）。此外，PAR修饰的程度还可受到调控PAR修饰过程的分子影响，例如二氢烟酰胺核糖（NRH）——一种NAD+的前体物质，可通过提高NAD+水平来增强PARP的活化；或FK866——一种NAMPT抑制剂，可降低NAD+水平并负向调控PARP的活化3。最后，PARP的活化也可能因基因突变或小分子抑制剂作用于PARP1/PARP2、PARG或其他DNA修复蛋白（例如碱基切除修复或同源重组因子如BRCA1/BRCA2存在缺陷）而发生改变33,34,35,36。
LivePAR 检测利用了环指蛋白 146（RNF146）的一个片段，该片段编码一个WWE结构域（氨基酸100–182），并与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）相连3。WWE结构域是一种球状结构域，以其结合位点中保守的色氨酸（W）和谷氨酸（E）残基命名37。WWE结构域可结合iso-ADP-核糖，即PAR链中最小的内部结构单元38,39。RNF146是一种E3泛素连接酶，能够识别iso-ADP-核糖38,40，并被报道可靶向参与碱基切除修复（BER）的蛋白（如XRCC1、DNA连接酶III和PARP1）使其发生蛋白酶体降解41。将该WWE结构域与EGFP连接，可实现对哺乳动物细胞中基因毒素诱导的PAR化位点的可视化和检测。在本实验方案中，我们描述了稳定表达LivePAR报告分子的细胞系的构建（图1A）、通过诱导DNA损伤以激活PARP1/PARP2、PAR的生成，以及共聚焦荧光显微镜图像的采集与分析流程（图1）。
pMD2.g(VSVG) 质粒提供病毒包膜糖蛋白（VSVG），与慢病毒天然包膜蛋白相比，VSVG 可扩大病毒能够感染的细胞范围。pRSV-REV 质粒提供调控元件（REV）蛋白，该蛋白是一种关键的转录激活因子，可结合病毒 RNA 并激活病毒基因的转录，对高效病毒复制至关重要。pMDLg/pRRE 质粒提供多个关键的内部包装组分，包括 gag 基因，其编码基质（MA）、衣壳（CA）和核衣壳（NC）蛋白；pol 基因，其编码病毒复制及整合入宿主细胞基因组所需的酶；以及 RNA 调控元件（RRE），该元件是一种 RNA 结构，可增强病毒 RNA 翻译效率和基因组 RNA 的包装效率。pLV-EF1A-LivePAR-Hygro 质粒（图 1A）包含编码增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的 cDNA，该蛋白与 RNF146 蛋白 WWE 结构域（氨基酸 100–182）的 C 末端融合，WWE 结构域可结合聚（ADP-核糖）链，该载体还编码一个潮霉素抗性表达盒。病毒从细胞培养上清中收集，可于 -80 ˚C 保存或直接用于转导实验（图 1B）。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂、化学品和多肽&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m Durapore 无菌滤器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SE1M003M00</td><td></td></tr><tr><td>20 x 20 mm 显微镜盖玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 22-170-371</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A18-1</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿，100 mm</td><td>VWR</td><td>Cat# 25382-166</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿，60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 430166</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板，6 孔</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-161</td><td></td></tr><tr><td>冻存管，2 mL</td><td>VWR</td><td>Cat# 89499-722</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 60-29-7</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# BP231-1</td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌滤器，0.45 &amp;micro;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SE1M003M00</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>Cat# 15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，200 证明</td><td>Decon Labs</td><td>Cat# 2701</td><td></td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Atlanta Biologics</td><td>Cat# S11150</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A144-212</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10687010</td><td></td></tr><tr><td>大号 Kim Wipes 擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Cat# 34256</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X GoStix Plus 试剂盒</td><td>Takara</td><td>Cat# 631280</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>MNNG</td><td>Molport</td><td>Cat# N493990</td><td></td></tr><tr><td>NRH（1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]-4H-吡啶-3-甲酰胺）</td><td>Marie Migaud 或&amp;nbsp; NuChem Sciences Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PARG 抑制剂（PDD00017273）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SML1781</td><td></td></tr><tr><td>PARPi 抑制剂（Veliparib, ABT-888）</td><td>MedChemExpress&amp;nbsp;</td><td>Cat# HY-10129</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>tBuOOH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 180345000</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-x2（转染试剂）</td><td>Mirus</td><td>Cat# MIR-6006</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>VWR</td><td>Cat# 0694</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield（H-1000）抗荧光淬灭封片剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# NC1695563</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞系&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>293-FT&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R70007</td><td></td></tr><tr><td>（源自经 SV40 大 T 抗原转化的人胚胎肾细胞）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R70007</td><td></td></tr><tr><td>LN428&amp;nbsp;</td><td>由</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>（人胶质母细胞瘤肿瘤细胞系）</td><td>Dr. Ian Pollack（匹兹堡大学）惠赠</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RPE-1&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Cat# CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>（人端粒酶逆转录酶永生化视网膜色素上皮细胞）</td><td>ATCC</td><td>Cat# CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>U2OS&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Cat# HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>（人骨肉瘤细胞系）</td><td>ATCC</td><td>Cat# HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>重组 DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>实验室库存编号 253</td><td>Addgene, Cat# 12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>实验室库存编号 254</td><td>Addgene, Cat# 12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>实验室库存编号 252</td><td>Addgene, Cat# 12259</td><td></td></tr><tr><td>pLV-EF1A-LivePAR-Hygro&lt;br/&gt;（LivePAR 为 RNF146 的 WWE 结构域，氨基酸残基 100-182，与 EGFP 融合；含有潮霉素抗性盒）</td><td>实验室库存编号 1727</td><td>Addgene, Cat# 176063&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件与算法&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator（用于图表制作）</td><td>Adobe Systems</td><td>版本 2024</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>版本 10.5.0&amp;nbsp;(Mac OS X)</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/ij/download.html</td><td></td></tr></tbody></table>

利用基于荧光融合蛋白的报告系统对细胞中基因毒素诱导的parp1/parp2激活进行可视化与定量分析

Visualization and Quantitative Analysis of Genotoxin-Induced PARP1/PARP2 Activation in Cells Using a Fluorescent Fusion Protein-Based Reporter

聚ADP-核糖（PAR）是由ADP-核糖聚合酶家族中的四种成员——PARP1、PARP2、PARP5a和PARP5b——合成的ADP-核糖聚合物。然而，只有PARP1和PARP2能够在DNA断裂时合成PAR。PAR被定义为一种蛋白质翻译后修饰，但也被证实可作为DNA或RNA的修饰形式存在。PAR的水平进一步受到PARG（PAR糖水解酶）的调控，PARG与PARP1和PARP2共同调节由DNA损伤诱导的细胞内PAR水平。PAR的动态合成与降解对其在DNA修复和DNA损伤应答中的调控作用至关重要，进而影响染色质重组、复制、转录以及细胞死亡过程。PARP1/PARP2的激活及PAR的积累可被视为正在进行碱基切除修复（BER）或DNA单链断裂修复（SSBR）的位点；然而，许多PARP1/PARP2激活因素也与复制应激及其他DNA代谢过程相关。一旦形成，PAR链可通过DNA修复因子和DNA损伤应答（DDR）因子所含有的PAR结合结构域（PBDs）将其募集至DNA损伤或基因组损伤位点。目前已发现十种不同的PBDs可识别PAR分子的不同区域，包括PAR结合基序、PAR结合型锌指结构、WWE结构域以及macrodomain等其他PBDs。为了便于对细胞内PAR动态进行分析，我们采用与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合的PBDs，优化了基于细胞的PAR焦点定量方法。本文描述了一种检测方法，该方法利用编码PBD/WWE结构域的RNF146片段与EGFP连接，以可视化并定量基因组损伤位点以及正在进行的BER或SSBR过程中PAR的积累情况。我们详细阐述了实验步骤，包括慢病毒颗粒的制备、靶细胞系的转导、诱导哺乳动物细胞基因组DNA损伤的处理、共聚焦荧光显微图像的采集，以及数据的半自动化定量分析。

可通过生成编码RNF146(100-182)-EGFP融合蛋白的慢病毒来获得表达LivePAR探针的细胞（图1A）。转导后，可在短期内进行瞬时表达分析，持续观察长达两周，或经潮霉素筛选后建立稳定细胞系进行检测（图1B）1。经基因毒性药物处理后，可在细胞核内观察到DNA损伤诱导产生的PAR焦点，固定后可通过共聚焦荧光显微镜成像（图1C）。图像显示，对照溶剂处理的细胞呈现全细胞范围的EGFP染色（图2，上图）；而经基因毒性药物处理的细胞则显示出核内焦点的聚集，代表RNF146(100-182)-EGFP与PAR结合的定位（图2，下图）。通过在处理前使用PARP1/PARP2抑制剂维利帕尼（Veliparib）预处理，可观察到PAR焦...

本文介绍一种用于固定哺乳动物细胞中聚（ADP-核糖）（PAR）富集灶的细胞水平可视化、亚细胞定位及定量分析的方法。该检测方法可对暴露于基因毒素的细胞核内由DNA损伤诱导的PARP激活位点进行定量分析，包括与碱基切除修复或单链断裂修复相关的激活位点。

利用基于荧光融合蛋白的报告系统对细胞中基因毒素诱导的PARP1/PARP2激活进行可视化与定量分析

聚(ADP-核糖)（PAR）是一种由ADP-核糖构成的聚合物，由ADP-核糖聚合酶家族中的四种酶——PARP1、PARP2、PARP5a……合成。

本实验室研究正常细胞和转化细胞中PARP1和PARP2依赖的DNA修复及DNA损伤应答通路。该领域的一个挑战是在避免细胞裂解的情况下，对细胞内PARP1和PARP2的活化进行定量分析。这使得能够开展亚细胞定位研究。首先，向一个1.5毫升的无菌微量离心管中加入375微升胎牛血清和不含青霉素-链霉素的DMEM培养基。然后，向该管中加入10微升脂质体转染试剂以及所有所需的质粒。轻轻敲击微量离心管，以混匀培养基、转染试剂和质粒DNA。室温孵育15至30分钟，以使DNA与转染试剂形成复合物。接着，将质粒与转染试剂的混合物逐滴加入含有培养的293FT细胞的60毫米培养皿中，无需更换培养基，然后将细胞放回培养箱中继续培养48小时。随后，收集转染后的293FT细胞的培养上清。为了分离慢病毒颗粒，将收集的培养基通过无菌的0.45微米滤膜过滤，以去除细胞碎片并分离出慢病毒颗粒。进行转导时，取培养24小时后处于对数生长期的靶细胞，并确认细胞融合度在20%至40%之间。接着，在一个15毫升的锥形管中加入1毫升病毒液、1毫升生长培养基和2微升Polybrene，轻轻颠倒混匀。然后，吸去六孔板中的生长培养基。将病毒、培养基和Polybrene混合物加入每个孔中。将含有转导混合物的细胞置于含加湿 atmosphere 的培养箱中，在32摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育16至18小时。为验证RNF146氨基酸的表达，100至182 EGFP，每张含盖玻片的培养皿接种200,000个表达LivePAR的活细胞。让细胞在盖玻片上贴壁、培养基预处理并开始复制，时间为24至36小时。然后将表达LivePAR的细胞暴露于指定试剂中。将化合物直接加入含有盖玻片细胞的培养基中，并轻轻晃动细胞培养皿中的培养基以分散化合物。将60毫米培养皿在37摄氏度下孵育60至90分钟。固定细胞时，移除培养基并用PBS洗涤细胞。在室温下用含4%甲醛的PBS溶液预固定细胞15分钟。去除甲醛后，用 PBS 洗涤细胞三次。然后，按 7:3 的比例向细胞中加入 3 毫升冷甲醇和丙酮以固定细胞。将培养皿置于 -20 °C 环境下 9 分钟。然后，去除甲醇-丙酮溶液。用 PBS 洗涤细胞三次后，用移液器吸取 15 µL 含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂滴加到载玻片上。将盖玻片细胞面朝内轻轻覆于封片剂上，尽量避免产生气泡。将盖玻片居中并固定在载玻片上，通过在边缘涂抹少量透明护甲油指甲油来封边。将载玻片置于避光处，使指甲油充分干燥。下载并安装 Image J 后，打开 Image J，通过点击 Plugins（插件），选择 Macros（宏），然后选择 Install（安装），来安装宏文本文件 LivePAR_Macro。在 Image J 中打开所有共聚焦图像文件，并将文件另存为 TIFF 格式以保留原始文件。然后，打开一个电子表格文档，并将其保存为“日期_细胞系焦点分析”。一次分析一个 TIFF 文件。按 1 键以识别细胞核。当 ROI 管理器窗口打开后，选择所有条目并按“添加”按钮，将细胞核区域叠加到原始图像上。删除错误识别的细胞核，并排除未完全位于视野范围内的细胞核。然后，使用自由选择工具圈选出细胞核，并按 2 以定量 PAR 焦点。在 ROI 管理器中依次选择每个细胞核，统计每个细胞核中的焦点数量。在完成文件中所有细胞核的计分后，将定量数据复制并粘贴到打开的电子表格文档中。类似地，对所有TIFF文件重复上述分析。完成后，使用选定的软件绘制每个细胞核中PAR焦点的数量。对照组细胞显示出全细胞的EGFP染色。经基因毒素处理的细胞显示出核内焦点的聚集，代表其在细胞核内的定位。使用PARP1和PARP2抑制剂维利帕尼进行预处理后，导致PAR焦点消失。对不同时间和处理条件下每细胞核中PAR焦点数量的定量分析显示了类似的结果。本方案使我们能够定量分析在基因毒素作用下以及遗传改变后PARP1和PARP2信号通路的激活情况。在本检测中，我们采用了传统的免疫荧光技术，以验证蛋白质与聚ADP-核糖的共定位。未来，我们将利用该检测方法进行基因毒性测试，用于高通量分析PARP1、PARP2或PARP抑制剂，并鉴定参与PARP1和PARP2信号通路的新因子。

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Cancer Research

癌症研究

利用荧光融合蛋白报告器可视化并定量分析基因毒素诱导的细胞内PARP1/PARP2活化

本文介绍了一种在活细胞中监测泛素-蛋白酶体活性的方法。通过慢病毒表达载体，将一个含有降解决定子的不稳定型绿色荧光蛋白融合蛋白（GFP-dgn）和一种稳定的GFP-dgnFS融合蛋白导入细胞。该技术可用于建立稳定表达GFP-dgn/GFP-dgnFS的细胞系，在该细胞系中，可通过落射荧光显微镜或流式细胞术方便地评估泛素-蛋白酶体系统的活性。...

利用基于降解决定子（dgn）不稳定的绿色荧光蛋白（GFP）报告蛋白在活细胞中监测泛素-蛋白酶体活性

本实验方案描述了一种用于可视化DNA损伤应答中被激活的DNA双链断裂信号蛋白及其在有丝分裂过程中定位的方法。...

活细胞中DNA损伤应答蛋白的二维与三维实时成像

通过活细胞共聚焦成像，实时记录了菲啶类化合物PJ-34在有丝分裂过程中对癌细胞的细胞毒性作用。PJ-34可清除含有额外中心体的有丝分裂期人乳腺癌MDA-MB-231细胞。与正常的双极有丝分裂不同，在PJ-34存在下，额外的中心体未能聚集到两个纺锤体极。...

活体癌细胞中通过共聚焦成像观察到的异常有丝分裂相关的细胞死亡

激光显微照射是研究活细胞中DNA修复的有用工具。本文展示了利用UVA激光诱导多种DNA损伤的方法学途径。我们优化了一种局部显微照射方法，能够维持正常的细胞周期；因此，经照射的细胞可正常进行有丝分裂。...

利用高级共聚焦显微镜技术研究DNA损伤位点的蛋白质-蛋白质相互作用及动力学

本实验方案的目的是描述如何利用激光显微照射诱导不同类型的DNA损伤，包括相对简单的链断裂和复杂损伤，以研究DNA损伤信号传导及修复因子在损伤位点的聚集。 在体.

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本方案描述了半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）技术；这是一种基于成像的方法，可用于可视化诱导起始半胱天冬酶的邻近效应，这是其激活的第一步。...

利用双分子荧光互补技术揭示半胱天冬酶激活通路

本文介绍一种基于荧光的高通量检测方法，通过活细胞的荧光定量和成像分析来测定质膜修复效率。该方法可用于筛选调控哺乳动物细胞质膜修复的药物或靶基因。...

哺乳动物细胞质膜修复效率的高通量测定

本文描述了评估荧光蛋白对错误折叠的多聚谷氨酰胺扩展的聚集性和毒性影响的实验方案，可用于在荧光报告系统背景下快速评价一种新发现但尚未表征的荧光蛋白。...

利用酵母中多聚谷氨酰胺毒性检测评估荧光蛋白对融合伴侣的影响

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。...

通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

本方案重点介绍了一种改进的方法，用于检测和定量由拓扑异构酶抑制剂和甲醛诱导的DNA-蛋白质交联（DPC）及其翻译后修饰（PTM），包括泛素化、SUMO化和ADP-核糖基化，从而能够研究DPC及其翻译后修饰的形成与修复过程。...

DNA-蛋白质交联及其翻译后修饰的定量检测

本研究中，我们介绍了一种用于鉴定致畸化学物的体外细胞检测方法。通过在人诱导性多能干细胞（iPS）报告细胞中检测成纤维细胞生长因子（FGF）/血清反应因子（SRF）信号通路的动态变化，并定量分析化学物对该信号通路的干扰程度，从而评估其致畸风险。<br...

基于实时监测人诱导多能干细胞中成纤维细胞生长因子信号干扰的发育毒性检测方法

了解利用荧光融合蛋白报告器可视化并定量分析基因毒素诱导的细胞内PARP1/PARP2活化的方法。该技术结合慢病毒转导、共聚焦显微镜和半自动化图像分析，实现哺乳动物细胞中DNA修复动态的实时监测。

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