Name: 原子力显微镜成像的细菌固定化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学习使用原子力显微镜对活细菌进行固定和成像的技术。该方法利用明胶包被的云母片在液体环境中固定革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，无需化学处理即可获得高分辨率图像，为微生物学研究提供可靠的活体成像方案。

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本研究由美国能源部生物与环境研究办公室以及弗吉尼亚州联邦健康研究委员会的资助项目资助。橡树岭国家实验室由UT-Battelle有限责任公司根据合同号DE-AC05-00OR22725为美国能源部管理。

1. 云母片制备：
<ol>
	<li>用剪刀将云母（Electron Microscopy Sciences）裁剪至适合原子力显微镜（AFM）的尺寸（约 22 × 30 mm）。</li>
	<li>通常使用胶带剥离云母两侧的外层，直至仅剩光滑且完整的层。</li>
</ol>
2. 明胶溶液的制备：
<ol>
	<li>向一个实验瓶中加入 100 ml 蒸馏水。</li>
	<li>将瓶子放入微波炉中加热，直至水开始沸腾。（若无微波炉，也可将水置于烧杯中，用加热板加热。）</li>
	<li>称取 0.5 克明胶（Sigma G-6144、G-2625 或 G-2500），加入到热的蒸馏水中。</li>
	<li>轻轻旋转瓶子，直至明胶完全溶解。</li>
	<li>将明胶溶液冷却至 60–70 °C。</li>
	<li>将约 15 mL 溶液倒入一个小烧杯（20 mL）中，用于浸入切割好的云母片。</li>
</ol>
3. 云母涂层：
<ol>
	<li>将云母片浸入预热的明胶溶液中，然后迅速取出，使云母表面被明胶覆盖（图1a）。</li>
	<li>涂覆后，立即将云母片边缘朝下竖直放置在纸巾上，于室温空气中干燥（图1b）。涂有明胶的云母片至少可在两周内使用。剩余的明胶溶液可冷藏保存，通过将储备液重新加热至60–70 °C，可在约一个月内重复使用。重新加热时需注意避免明胶沸腾。</li>
</ol>
4. 在明胶包被的云母上固定细菌：
<ol>
	<li>在800至4,500 rcf条件下离心1 mL细菌培养物（600 nm处OD值为0.5–1.0），离心时间约5分钟。根据细菌种类，选用能够使细胞形成沉淀的最低rcf。</li>
	<li>用相同体积的过滤去离子水或缓冲液洗涤沉淀。 </li>
	<li>再次通过离心收集细胞。 </li>
	<li>立即将沉淀重悬于 500 μL 纳米纯去离子水或缓冲液。（细菌悬液应明显浑浊，以确保原子力显微镜成像时细胞浓度足够。）</li>
	<li>加入细胞悬液（10-20 μL) 加到明胶包被的云母表面，用移液枪头将菌液在表面铺展开（图1c）。在加样或铺展细菌溶液时，应注意避免枪头直接接触明胶表面。 </li>
	<li>让表面静置10分钟，然后用流水或缓冲液冲洗（图1 c-d）。在整个操作过程中，务必确保样品始终保持湿润，避免干燥。</li>
</ol>
5. 典型结果：
图2显示了固定在明胶包被云母片上的细菌细胞经原子力显微镜（AFM）成像的示例图像。在我们的实验室中，通常使用配备100 μm扫描头的PicoPlus原子力显微镜（Agilent Technologies，亚利桑那州坦佩）对样品进行成像。该仪器以每行扫描128-512像素、扫描速度为0.5-1.0行/秒的条件运行。通常使用的悬臂为Veeco氮化硅探针（MLCT-AUHW，Veeco，加利福尼亚州圣塔芭芭拉），其标称弹性常数范围为0.01至0.1 nN/nm。
<img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig1.jpg" alt="使用移液器和镊子在载玻片上制备和点样进行色谱分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 图1. 将60–70 °C的明胶置于20 mL烧杯中。用镊子夹取新解理的云母片，完全浸入明胶中（a），然后取出并垂直放置在纸巾上，斜靠于微量离心管架上（b）。将一滴细菌样品滴加到云母表面，并用移液器吸头在X和Y方向上均匀涂布（c）。让样品在云母表面孵育至少10分钟，随后用蒸馏水冲洗样品。若固定成功，则可在云母上观察到一个不透明的斑点，如（d）右图所示；若固定失败，则云母片保持透明，如左图所示。云母上的不透明斑点大小与滴加到经明胶处理的云母上的细菌浓度成正比。
<img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig2.jpg" alt="原子力显微镜（AFM）图像显示表面的细菌细胞；纳米尺度分析，生物学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 大肠杆菌（E. coli）的原子力显微镜（AFM）图像。在图（a）中，细胞固定于明胶包被的云母片上，并在0.005 M PBS溶液中成像。作为对比，图（b）展示了同样固定于明胶包被云母片上但在空气中成像的细菌细胞图像。尽管在液体中采集的图像可清晰观察到隔膜结构，但空气中的成像分辨率更高，如图（b）插图所示，可观察到菌毛的存在。

<ol><li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

多种因素会影响微生物细胞在原子力显微镜（AFM）中的固定与成像。用于云母表面包被的明胶至关重要。市售明胶通常从多种脊椎动物中提取，包括鱼类、牛和猪。明胶的来源及其加工方法决定了其是否适用于细菌的固定。已有研究评估了多种来源和类型的明胶在固定细菌方面的有效性[1]。其中效果最好的两种明胶为 Sigma G-6144 和 G-2625，它们均来源于猪（猪源性），分别属于低勃氏强度（low Bloom）和中等勃氏强度（medium Bloom）明胶。在使用前，必须测试经明胶处理的基底与待研究细菌菌株之间的相容性。值得注意的是，来源于牛（牛源性）的明胶在固定所有测试菌株方面均无效。一种简单的细胞固定性检测方法是在用水或缓冲液冲洗后（步骤4.6之后），让样品在云母上自然干燥。若细菌被成功固定，可观察到浑浊区域（图1d）。若表面无浑浊，则说明冲洗水流已将细菌冲走。进行该测试时，操作者需注意添加剂（如盐类）可能也会导致浑浊现象，从而造成误判。
明胶包被云母固定技术已成功应用于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌（1）、细菌球状体（2）、病毒颗粒（3）以及硅藻外壳（4）。使用明胶固定的优势在于可使细胞在基底...

<table><tbody><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6144, G2625 或 G2500</td><td></td></tr><tr><td>PicoPlus 原子力显微镜</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>原子力显微镜悬臂梁</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr></tbody></table>

用于原子力显微镜成像的细菌固定方法

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

原子力显微镜（AFM）是一种高分辨率（纳米级）成像工具，通过机械探针扫描样品表面。它能够在液体环境中对细胞和生物大分子进行成像，而无需对样品进行化学处理。为了实现这一目标，样品必须充分附着在支撑表面上，以防止被扫描过程中AFM悬臂针尖施加的力所移除。在许多情况下，成功的成像依赖于样品在支撑表面的有效固定。理想情况下，固定过程应对样品的侵入性尽可能小，以确保其代谢过程和功能特性不受影响。通过在新解理的云母表面涂覆猪源明胶，可使带负电荷的细菌固定在表面，并在液体环境中利用AFM进行成像。细菌细胞在明胶涂层云母上的固定很可能是由于带负电荷的细菌与带正电荷的明胶之间发生静电相互作用所致。多种因素可能干扰细菌的固定效果，包括细菌悬浮液中的化学成分、细菌在明胶涂层云母上的孵育时间、菌株的表面特性以及成像时所用的培养基环境。总体而言，明胶涂层云母已被证明普遍适用于微生物细胞的成像研究。

可将活的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌固定在明胶包被的云母表面，并在液体环境中利用原子力显微镜（AFM）进行成像。

原子力显微镜（AFM）是一种高分辨率（纳米级）成像工具，通过机械探针扫描样品表面。它能够在液体环境中对细胞和生物大分子进行成像……

原子力显微镜（AFM）利用对表面的机械探针扫描，可在无需对样品进行化学处理的情况下生成高分辨率图像。在本视频中，细菌被固定在明胶包被的云母表面，并在液体环境中通过原子力显微镜进行成像。首先，将云母片切割成适合原子力显微镜平台的小方块，去除云母的顶层后，将云母片用明胶包被。接下来，将一滴细菌悬液置于明胶包被的云母表面并铺开。使用移液枪头，将样品孵育10分钟。然后用洗涤液去除未结合的细菌。将样品置于原子力显微镜（AFM）液体池中成像，以获得活细菌的高分辨率图像。与现有的ISO多孔滤膜固定等方法相比，该技术的主要优势在于能够可靠地固定杆状和球形细菌。此外，细胞表面更大比例的区域可被AFM探针接触。与其它显微技术相比，原子力显微镜的一个关键优势在于能够开展单细胞研究，可对细胞形态、隔膜形成以及胞质分裂进行探究。初学者在使用该方法时往往会遇到困难，原因在于他们倾向于使用未经验证能否有效固定细菌的明胶，或使用在复杂培养基中培养的细菌，而培养基中的成分会干扰细菌在明胶表面的黏附。我们最初构思该方法源于20世纪70年代的实验，当时已实现了细菌的固定。用于光学显微镜和放射自显影实验的明胶包被玻片。本示例中，活的革兰氏阴性细菌被固定用于荧光显微成像，但该方法同样适用于革兰氏阳性细菌。制备MICA时，首先用剪刀将其裁剪至适合原子力显微镜（AFM）载物台，并适配AFM湿室的尺寸。接下来，将透明胶带贴在云母表面并撕下，以剥离切割后云母片的外层。持续从两侧去除外层，直至仅剩光滑且完整的云母层。制备明胶溶液时，向一个实验室瓶中加入100毫升蒸馏水，并放入微波炉中加热。当水开始沸腾时，将其从微波炉中取出，加入 0.5 克明胶，并轻轻摇晃容器，直至明胶完全溶解。注意：牛源明胶不适用于此操作步骤，推荐使用猪源明胶。将瓶子放在实验台上，使其冷却至60至70摄氏度。然后倒入足量的明胶溶液至一个小烧杯中，确保能够用镊子将MICA完全浸入。将一块MICA方片浸入温热的明胶溶液中，并迅速取出，立即进行下一步操作。将涂有明胶的云母片边缘朝下放置在纸巾上，并倚靠在微型离心管架上，于室温空气中晾干过夜。涂有明胶的云母片至少可在两周内使用。如果涂有明胶的云母片在数周内不使用。将其置于覆盖的培养皿中的滤纸上，室温保存。多余的明胶溶液可冷藏保存，通过将储备液重新加热至60至70摄氏度，大约可使用一个月。重新加热时必须注意避免明胶沸腾。在将细菌接种到明胶包被的云母片上之前，需确保细菌浓度适宜。使用分光光度计测定细菌样品在600纳米处的光密度值。OD值在0.5至1之间为最佳。接下来，取一毫升培养物转移至微量离心管中，离心后收集沉淀。使用移液器吸除上清液，然后用一毫升过滤的去离子水或缓冲液洗涤沉淀。轻轻吹打重悬沉淀。将离心获得的沉淀物重新悬浮，并立即用500微升纳米纯去离子水重悬沉淀物。细菌悬液应明显浑浊，以确保细胞浓度足够，用于荧光显微成像。如果存在渗透休克的担忧，可在成像溶液中添加 0.25 摩尔的蔗糖。我已将这种细菌重悬于水中，但不必担心尝试其他液体。例如，我们曾使用 0.25% 蔗糖进行过实验，因此可尝试其他液体，观察是否同样有效。每个样品准备两张载玻片。使用微量移液器，将10至20微升细胞悬液加入经明胶包被的表面。然后，为获得适合荧光显微成像的足够覆盖面积，用微量移液器吸头在X和Y方向上将液滴均匀铺开。使用移液枪时注意不要让枪头接触明胶表面，将样品在室温下孵育10分钟。接着，用流水冲洗样品，并通过将样品边缘接触纸巾或滤纸以吸去多余的液体。随后，用氮气气流快速吹干其中一张载玻片。然后目视检查载玻片。若出现不透明斑点，表明细菌在洗涤步骤中未被完全去除。另一张将用于成像的载玻片不得使其干燥。将其放入原子力显微镜的液体样品台中，并使用夹具固定；用微量移液器向样品台内加入水。在进行液体成像前预先准备好原子力显微镜是一个很好的做法。确保用于液体成像的微悬臂已安装在原子力显微镜中，并与激光对准。使用配备100微米扫描头和Vico氮化硅探针（标称弹性常数范围为0.01至0.1纳牛顿/纳米）的Pico Plus原子力显微镜，进行原子力显微成像。显微镜准备就绪后，将a FM扫描器和样品台插入显微镜中。通常，我们以每秒0.5行至每秒1行为成像速度，分辨率设置为每行128至512个数据点。将仪器设置为每行采集 128 至 512 像素的图像。扫描速度设为每秒 0.5 至 1 行。然后根据需要调整原子力显微镜（A FM）的设定点和增益，以获得最佳图像。最后，采集图像。大肠杆菌细菌按照本视频所述方法固定在明胶包被的云母上，然后在 0.005 摩尔的 PVS 中进行成像。采用此方法。在采集的图像中，Scepter 清晰可见，细胞表面光滑，无脱水迹象。相比之下，此处所示的相同大肠杆菌在空气中的图像通常会显示出在液体中看不到的结构。在此情况下，细胞因脱水而呈现环状外观，并可观察到菌毛等细菌附属结构，如 FIA。观看本视频后，您应能充分理解如何在液体环境中为荧光显微成像（FM成像）制备细菌样品。一旦掌握该技术，若事先已完成明胶包被微表面的制备，则整个操作可在约一小时内完成。在实施该实验流程时，选择合适的明胶类型并确保细菌具有适当的浓度至关重要。还可以进行其他测量，例如利用FN悬臂作为力传感工具，对细菌表面进行力的测量。此外，可将特定的探针分子连接到原子力显微镜（AFM）针尖，以与细菌表面的特定靶标相互作用，从而识别并测量相互作用力。通常情况下，请务必注意，当使用该方法处理致病性细菌时，必须始终采取适当的预防措施。

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科研

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生物工程

原子力显微镜成像的细菌固定化

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利用多步链置换光刻技术实现基因的功能性表面固定

我们提出了一种用于免疫学研究的原子力显微镜（AFM）悬臂梁功能化方案，可在其上固定单个T细胞和微粒。本文展示了利用AFM探测单对T细胞-树突状细胞结合的步骤，以及结合荧光成像技术，利用AFM实时监测巨噬细胞对单个固体微粒的细胞反应的方法。...

原子力显微镜悬臂的功能化：负载单个T细胞或单颗粒用于免疫学单细胞力谱分析

本方案旨在对数百个微生物细胞实现原子力显微镜（AFM）测量的自动化。首先，将微生物固定在PDMS印章微结构中，随后对数百个固定的细胞自动进行力谱测量。...

对数百个C. albicans细胞进行生物原子力显微镜测量的自动化

原子力显微镜-红外光谱法（AFM-IR）为细菌研究提供了强大的平台，能够实现纳米级分辨率。该技术可在单细胞水平上对细菌进行亚细胞结构变化的成像（例如细胞分裂过程中）以及化学成分的比较研究（例如由药物耐药性引起的差异）。...

原子力显微镜结合红外光谱作为探测单个细菌化学特性的工具

本文介绍了一种利用光镊进行直接力测量，在三维受限条件下研究分离的斑马鱼胚胎细胞内机械特性的实验方案。...

使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量

本研究提出了一种新方案，通过将磁性微珠递送至细胞质，直接对细胞核施加机械力，同时进行活细胞荧光成像。...

结合三维磁力驱动装置与多功能荧光成像技术研究细胞核力学生物学

本文介绍了原子力显微镜（AFM）在细菌表征中的应用，作为一种简便快速的方法，可用于分析细菌的大小和形态、细菌培养形成的生物膜，以及纳米颗粒作为杀菌剂的活性等细节。...

接触模式原子力显微镜作为一种快速进行形态观察与细菌细胞损伤分析的技术

我们介绍一种简单且易于实现的方法，用于在XY平面上观察丝状蓝细菌。该方法采用低熔点琼脂糖基质，可实现对参与分裂过程的蛋白质进行垂直方向的成像。因此，该技术可适用于任何丝状生物体以及多种不同类型的蛋白质。...

丝状蓝细菌延时显微镜分析的垂直固定方法

学习使用原子力显微镜对活细菌进行固定和成像的技术。该方法利用明胶包被的云母片在液体环境中固定革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，无需化学处理即可获得高分辨率图像，为微生物学研究提供可靠的活体成像方案。

用于原子力显微镜成像的细菌固定方法

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