原子力显微镜成像的细菌固定化
2011年8月10日
现场革兰氏阴性和革兰氏阳性菌，可固定在明胶包覆云母和利用原子力显微镜（AFM）在液体中成像。
原子力显微镜或 FM 使用表面的机械探测来生成高分辨率图像，而无需对样品进行化学处理。在本视频中，细菌被固定在明胶包被的云母上，并通过 FM 在液体环境中成像。首先切割 MICA 方块以适合 A FM 显微镜平台。去除 MICA 的顶层，并在云母方块上涂上明胶。
接下来，将一滴细菌悬浮液放在涂有明胶的云母上并扩散。使用移液器吸头，将样品孵育 10 分钟。然后从表面清洗未结合的细菌。
将样品置于 A FM 湿池中并成像以获得活细菌的高分辨率图像。与现有方法（如 ISO 多孔过滤器动员）相比，该技术的主要优点是棒状细菌和球形细菌都可以可靠地固定。此外，A FM 探头可以接触到更大比例的细胞表面。
与其他显微镜相比，原子力显微镜的一个关键优势是可以进行单细胞研究，可以研究细胞形态、隔膜形成和胞质分裂。刚接触这种方法的人会很挣扎，因为他们倾向于使用未被证明可以固定细菌的明胶或在复杂介质中生长的用过的细菌，其中成分会与细菌对明胶表面的粘附竞争。我们最初从 1970 年代的实验中产生了这种方法的想法，当时细菌被固定。
用于光学显微镜和自动射线照相实验的明胶涂层载玻片。在这个演示中，活的革兰氏阴性菌被固定用于 FM 成像，但该方法也适用于革兰氏阳性菌。要制备 MICA，首先用剪刀剪断它以适应 A FM 显微镜载物台并容纳 A FM 湿池。
接下来，将透明胶带放在 MICA 表面并将其取下，以从切割件上剥离 MICA 的外层。继续从两侧去除外层，直到只剩下平滑的未断开的层。要制备明胶溶液，请将 100 毫升蒸馏水加入实验室瓶中，然后在微波炉中加热。
当水开始沸腾时，将其从微波炉中取出，加入 0.5 克明胶，然后轻轻膨胀瓶子，直到明胶溶解。请注意，牛明胶不适用于此程序。建议使用猪明胶。
将瓶子放在工作台上，让它冷却到 60 到 70 摄氏度。然后将足量的明胶溶液倒入一个小烧杯中，以确保可以使用镊子将 MICA 完全浸没。将 MICA 方块浸入温热的明胶溶液中，然后迅速将其取出。马上。
将 MICA 的边缘放在靠在微型离心架上的纸巾上，在环境空气中晾干过夜。明胶包被的 MICA 可以使用至少两周。如果涂有明胶的 MICA 几周内不会使用。
将其放在有盖培养皿中的滤纸上，并在室温下储存。过量的明胶溶液可以冷藏并使用大约一个月，只需将储备溶液重新加热到 60 到 70 度之间即可。必须注意摄氏温度，以确保明胶在重新加热过程中不会煮沸。
在将细菌安装在明胶包被的 MICA 上之前，请确保细菌浓度足够。使用分光光度计获得 600 纳米细菌样品的光密度读数。OD 为 0.5 比 1 是最佳值。
接下来，将 1 毫升培养物转移到微量离心管中，并在离心后离心以沉淀。使用移液管去除上清液，然后在 1 毫升过滤的去离子水或缓冲液中洗涤沉淀。轻轻上下移液以进行复苏。
悬浮沉淀，离心获得物，并立即重悬沉淀。在 500 微升纳米纯去离子水中，细菌悬浮液应明显呈粪便状，以便具有足够的细胞浓度。用于 FM 成像。
如果担心渗透压休克，可以在成像溶液中加入 0.25 摩尔蔗糖。我已经将这种细菌重新悬浮在水中，但不要害怕尝试其他液体。例如，我们已经用 0.25% 蔗糖完成了这项工作，因此请尝试其他液体，看看是否也有效。
为每个样品准备两张载玻片。使用微量移液器，向明胶涂层表面添加 10 至 20 微升细胞悬液。然后，为了给 FM 成像提供足够的覆盖区域，使用微量移液器吸头将液滴沿 X 和 Y 方向扩散。
注意不要用移液器吸头物理接触明胶表面，将样品在室温下孵育 10 分钟。接下来，将样品边缘接触纸巾或滤纸，用水流冲洗样品上多余的液体。使用氮气射流快速干燥其中一张载玻片。
然后目视检查载玻片。不透明的斑点表示细菌在洗涤步骤中没有去除。另一张现在将用于成像的载玻片不应干燥。
将其置于 A FM 湿载物台中，并使用夹子固定，使用微量移液器在湿载物台中加水。在液体中成像之前准备原子力显微镜是个好主意。确保用于液体成像的悬臂放置在 A FM 中并与激光器对齐。
使用微型加原子力显微镜进行原子力显微镜成像，该显微镜配备 100 微米扫描头和 vico 氮化硅探针，标称弹簧常数范围为每纳米 0.01 至 0.1 纳牛顿。准备好显微镜后，将 FM 扫描仪和载物台插入显微镜。通常，我们从每秒 0.5 行开始，直到每秒 1 行，因为我们的成像速度和分辨率设置为从每行 1 28 个数据点到 512 个数据点。
将仪器设置为使用每行 128 到 512 像素来收集图像。以每秒 0.5 到 1 行的扫描速度进行扫描。然后，如果需要，调整 A FM 上的设定点和增益以获得最佳图像。
最后，收集图像。如本视频所述，将大肠杆菌安装在明胶包被的 MICA 上，然后在 0.005 摩尔 PVS 中成像。使用此方法。
权杖在收集的图像中清晰可见，细胞表面光滑，没有脱水迹象。相比之下，如图所示，在空气中拍摄的相同大肠杆菌的图像通常显示出液体中看不到的结构。在这种情况下，细胞由于脱水而呈现环状外观，并且可以看到 FIA 等细菌附属物。
观看本视频后，您应该对如何在液体环境中制备用于 FM 成像的细菌样品有很好的了解。一旦掌握，如果明胶涂层的微表面事先已经准备好，则可以在大约一小时内完成这项技术。尝试此程序时，重要的是要选择正确的明胶并按照此程序进行适当浓度的细菌。
可以完成其他测量，例如使用 FN 悬臂作为力传感工具，以保持对细菌表面的力测量。此外，可以将特定的探针分子拴在 A FM 尖端上，以与细菌表面的特定靶标相互作用，以识别和测量相互作用力。通常不要忘记，如果您正在处理病原菌，则在使用此方法时必须始终采取预防措施。
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概述
本研究展示了使用原子力显微镜（AFM）在液体环境中固定和成像活的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的方法。该方法包括在云母上涂覆明胶，以促进细菌的附着和成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 成像技术
- 原子力显微镜
背景
- 原子力显微镜允许对表面进行高分辨率成像。
- 活细菌由于其运动而难以研究。
- 明胶涂覆的表面可以增强细菌的固定。
- 在液体环境中进行成像可以保持细菌的自然状态。
研究目的
- 展示一种在表面上固定细菌的方法。
- 使用AFM在未经化学处理的情况下对细菌进行成像。
- 为对细菌成像感兴趣的研究人员提供一种协议。
使用的方法
- 切割云母方块并用明胶涂覆。
- 在明胶表面上滴加细菌悬液的液滴。
- 孵育样品以允许细菌附着。
- 在成像之前洗掉未附着的细菌。
主要结果
- 活细菌成功地固定在了明胶涂覆的云母上。
- 使用AFM获得了细菌的高分辨率图像。
- 该方法允许在液体环境中进行成像。
- 革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都被成功地成像了。
结论
- 该方法提供了一种研究活细菌的可靠方法。
- AFM可以有效地用于生物样品的成像。
- 在微生物学和成像技术方面有可能进一步应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy enables high-resolution imaging of live bacteria in liquid environments without chemical fixation, preserving native morphology and physiological state. This capability supports early-stage target validation by allowing direct observation of bacterial surface structures, division events, and membrane dynamics under near-native conditions. The gelatin-coated mica immobilization method provides a reproducible, minimally invasive platform for microbiological imaging that reduces sample preparation artifacts and enhances data reliability in discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of bacterial morphology, septum formation, and cytokinesis to interrogate therapeutic hypotheses about cell division targets.
- Operational Value: Provides label-free, liquid-phase imaging that avoids fixation artifacts and preserves functional bacterial attributes for mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Gelatin-coated mica creates a standardized, reusable surface for consistent bacterial immobilization across screening campaigns.
- Operational Value: Supports preparation of validated biological systems with high surface accessibility for AFM probe interaction, enabling reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by imaging live bacteria in liquid, maintaining disease-relevant system integrity.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions through quantitative, reproducible morphological and topological readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a standardized preparation step for live bacterial imaging, supporting hypothesis testing and biological de-risking before lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct imaging of cell surface dynamics and division events in liquid.
- Screening: Enables assay readiness via reproducible bacterial immobilization on gelatin-coated mica, ensuring consistent sample presentation for AFM analysis.
- Analytics: Generates high-resolution topographical and force measurements that allow comparison of bacterial conditions, treatments, or genetic modifications.
- Translational Research: Maintains continuity with preclinical work by preserving native bacterial state in liquid, avoiding artifacts from fixation or dehydration.
- Enterprise Reuse: Gelatin-coated mica substrates can be prepared in advance and stored for up to two weeks, enabling platform reuse across multiple projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, label-free observation of bacterial ultrastructure.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined immobilization protocols, gelatin source specifications (porcine), and concentration controls (OD 0.5–1.0).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering quantitative morphological data that reduces late-stage biological risk in antimicrobial or antibacterial programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through standardized, scalable imaging outputs that enable cross-functional comparison of antibacterial candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, liquid-cell imaging, and bacterial handling under aseptic conditions.
- Depends on access to AFM systems with liquid cells, silicon nitride probes, and environmental control for scan speed and resolution.
- Necessitates standardization of gelatin preparation (porcine, 0.5% in distilled water), mica preparation, and bacterial concentration (OD 0.5–1.0 at 600 nm) across teams.
- Involves adaptation considerations for different bacterial strains, media components, and imaging buffers (e.g., sucrose addition for osmotic sensitivity).
- Limited by the need to avoid gelatin boiling during preparation and potential interference from complex media components that compete with bacterial adhesion to gelatin.
