重组DNA和蛋白质复合物，用原子力显微镜的可视化

该程序的总体目标是使用原子力显微镜对水性缓冲液中的生物分子（如 DNA 和蛋白质）进行实时成像。这是通过首先准备要成像的生物分子来实现的。接下来，设置原子力显微镜并定位 FM 悬臂探针。

然后对样品表面和感兴趣的生物分子进行成像和分析。最终，可以通过原子力显微镜获得显示 DNA 和蛋白质的一般大小、数量和组织以及缓冲条件下异质生物分子复合物的结果。这种方法可以帮助回答分子伴侣领域的关键问题，例如伴侣和 cos 伴侣的 STO 几何形状对客户来说是什么。

这种方法的蛋白质视觉演示是有益的，因为 A FM 和 Kent 杠杆探针制备步骤可能难以从印刷说明中学习，主要是因为它们的物理作相关的复杂性。演示该程序的是我实验室的两名学生 Morgan Shannon 和 John Gertz 首先分离要成像的蛋白质或 DNA 分子并将它们悬浮在水性缓冲液中。确认样品纯度后，将其在冰上的 FM 吸收缓冲液中孵育，以促进样品与云母的粘附。

对于蛋白质样品，使用 10 毫摩尔 heaps 缓冲液。而对于由 10 毫摩尔 tris、pH 7.5 10 毫摩尔氯化钠组成的 DNAA 含镁缓冲液，2 毫摩尔氯化镁适合安装A FM探针。将液体池探针支架放在相应的悬臂式安装扩展坞上。

找到用于成像的尖锐氮化物杆探针的长而粗的悬臂。小心地将其转移到液池探针支架上，确保尖端保持直立。接下来，在光学显微镜下检查悬臂，以确保其完好无损并正确安装在液体池探针支架中。

然后通过拧紧神经头夹螺钉，小心地从仪器燕尾榫组件上取下 a FM 头。倒置 a FM 头，用力将液体池探针支架推到 a FM 头底部的四个引脚上。最后，小心地将 a FM 头返回到尾部组件的仪器中。

为了在对样品进行成像之前进一步准备 FM，请移动机载光学显微镜的旋钮以找到悬臂尖端，调整软件上光学控制器的上下箭头以聚焦悬臂尖端。使用激光调节旋钮将激光对准悬臂尖端。这是协议中技术上最具挑战性的步骤之一：定位是手动完成的，需要精确的旋钮调整。

仔细监测反射点和照明点中的激光会增加成功对准的可能性。接下来，调整 FM 头上的光电探测器旋钮，使光电探测器居中。将一张新切割的 MICA 片贴在金属 FM 样品盘上，放在 A FM 支架板上的磁化样品架上。

旋转 FM 支架板，使标本盘位于初始成像的位置。使用仪器软件的聚焦表面控制将 a FM 头向下移动到 MICA 样品盘的表面。直到 MICA 表面或尖端反射上的明显特征聚焦，从仪器软件中选择调谐图标并调整悬臂。

推荐的 MSNL 或 SNL 探头的谐振频率为 20 至 60 kHz。选择 5% 峰偏移以对 MICA 样品进行成像。首先，将探头接合到 MICA 表面上，将初始扫描尺寸设置为 10 微米，将扫描速率设置为 1 赫兹。

捕获 10 微米区域的完整扫描图像。然后将扫描尺寸减小到 5 微米 1 微米和 0.5 微米，并捕获每个视野的完整图像。单击仪器软件上的脱离图标，松开探头。

为了对感兴趣的生物分子进行成像，将 5 微升制备的样品与 45 微升新鲜吸收缓冲液混合。小心地将 50 微升每毫升含 0.5 微克的生物分子溶液直接添加到 MICU 表面。暂停 5 分钟，让样品中的生物分子粘附在 Micah 表面。

然后将额外的 50 至 100 微升吸收缓冲液移液到液体池探针支架中。小心不要用移液器吸头接触探头、FM 头或 MICA，重新调整光电检测器并根据需要将激光器重新对准悬臂。然后使用仪器软件重新接合探头。

增加扫描大小以识别感兴趣的区域。成像完成后，多次选择仪器软件上的撤回图标以松开探头。最后，使用蒸馏水彻底冲洗液体池探针支架和样品盘。

然后用压缩空气尝试一下。此处显示了 A FM 图像的示例。云母底物提供了一个分子平坦的表面，DNA 和蛋白质可以吸收到该表面。

在生物分子样品之前对 MICA 进行成像可提供阴性对照和成像噪声评估。它还提供了一定程度的保证，即悬臂已正确调整，并且随后的样品成像将成功。推测为超螺旋的双链血浆 DNA 很容易通过其不对称的外观和均匀沉积在以前不起眼的 Micah 底物上来识别。

离散粒径的蛋白质复合物也与 Micah 底物具有独特的区别。粒径差异表明样品异质性，可用于近似蛋白质、复杂的斯多葛几何结构或生化活性。观察到的蛋白质颗粒的一般对角线形状和一致方向。

这是一个成像伪影，因为蛋白质预计会以随机方式在 Micah 底物上定向。观察到的伪影或物理尖端异常或 FM 成像的可能原因以扫描速率的两倍快速进行，而尖端卷积阻止了 x 轴和 Y 轴上的绝对长度测量计算，高度测量或 Z 轴以及相对 X 和 Y 测量对于估计成像生物分子的生物物理特性可能很有用。在尝试此程序时，重要的是要记住准确调整悬臂并对齐光电探测器 遵循此基本 FM 程序。

可以添加其他步骤，包括使用缓冲液交换液池，以回答其他问题，例如分子伴侣影响类固醇受体从其 DNA 反应元件中释放的能力。观看此视频后，您应该更好地了解如何在缓冲条件下使用原子力显微镜对 DNA 蛋白质和生物分子复合物进行成像。