重组DNA和蛋白质复合物，用原子力显微镜的可视化
2011年7月18日
是描述一个轻敲模式原子力显微镜（AFM）的可视化的质粒DNA，细胞质的蛋白质和DNA -蛋白质复合物的方法。该方法包括准备样品的原子力显微镜成像，生化操纵的替代方法。在近生理缓冲条件下观察DNA含有特定的蛋白相互作用的区域。
该程序的总体目标是使用原子力显微镜对水性缓冲液中的生物分子（如 DNA 和蛋白质）进行实时成像。这是通过首先准备要成像的生物分子来实现的。接下来，设置原子力显微镜并定位 FM 悬臂探针。
然后对样品表面和感兴趣的生物分子进行成像和分析。最终，可以通过原子力显微镜获得显示 DNA 和蛋白质的一般大小、数量和组织以及缓冲条件下异质生物分子复合物的结果。这种方法可以帮助回答分子伴侣领域的关键问题，例如伴侣和 cos 伴侣的 STO 几何形状对客户来说是什么。
这种方法的蛋白质视觉演示是有益的，因为 A FM 和 Kent 杠杆探针制备步骤可能难以从印刷说明中学习，主要是因为它们的物理作相关的复杂性。演示该程序的是我实验室的两名学生 Morgan Shannon 和 John Gertz 首先分离要成像的蛋白质或 DNA 分子并将它们悬浮在水性缓冲液中。确认样品纯度后，将其在冰上的 FM 吸收缓冲液中孵育，以促进样品与云母的粘附。
对于蛋白质样品，使用 10 毫摩尔 heaps 缓冲液。而对于由 10 毫摩尔 tris、pH 7.5 10 毫摩尔氯化钠组成的 DNAA 含镁缓冲液，2 毫摩尔氯化镁适合安装A FM探针。将液体池探针支架放在相应的悬臂式安装扩展坞上。
找到用于成像的尖锐氮化物杆探针的长而粗的悬臂。小心地将其转移到液池探针支架上，确保尖端保持直立。接下来，在光学显微镜下检查悬臂，以确保其完好无损并正确安装在液体池探针支架中。
然后通过拧紧神经头夹螺钉，小心地从仪器燕尾榫组件上取下 a FM 头。倒置 a FM 头，用力将液体池探针支架推到 a FM 头底部的四个引脚上。最后，小心地将 a FM 头返回到尾部组件的仪器中。
为了在对样品进行成像之前进一步准备 FM，请移动机载光学显微镜的旋钮以找到悬臂尖端，调整软件上光学控制器的上下箭头以聚焦悬臂尖端。使用激光调节旋钮将激光对准悬臂尖端。这是协议中技术上最具挑战性的步骤之一：定位是手动完成的，需要精确的旋钮调整。
仔细监测反射点和照明点中的激光会增加成功对准的可能性。接下来，调整 FM 头上的光电探测器旋钮，使光电探测器居中。将一张新切割的 MICA 片贴在金属 FM 样品盘上，放在 A FM 支架板上的磁化样品架上。
旋转 FM 支架板，使标本盘位于初始成像的位置。使用仪器软件的聚焦表面控制将 a FM 头向下移动到 MICA 样品盘的表面。直到 MICA 表面或尖端反射上的明显特征聚焦，从仪器软件中选择调谐图标并调整悬臂。
推荐的 MSNL 或 SNL 探头的谐振频率为 20 至 60 kHz。选择 5% 峰偏移以对 MICA 样品进行成像。首先，将探头接合到 MICA 表面上，将初始扫描尺寸设置为 10 微米，将扫描速率设置为 1 赫兹。
捕获 10 微米区域的完整扫描图像。然后将扫描尺寸减小到 5 微米 1 微米和 0.5 微米，并捕获每个视野的完整图像。单击仪器软件上的脱离图标，松开探头。
为了对感兴趣的生物分子进行成像，将 5 微升制备的样品与 45 微升新鲜吸收缓冲液混合。小心地将 50 微升每毫升含 0.5 微克的生物分子溶液直接添加到 MICU 表面。暂停 5 分钟，让样品中的生物分子粘附在 Micah 表面。
然后将额外的 50 至 100 微升吸收缓冲液移液到液体池探针支架中。小心不要用移液器吸头接触探头、FM 头或 MICA，重新调整光电检测器并根据需要将激光器重新对准悬臂。然后使用仪器软件重新接合探头。
增加扫描大小以识别感兴趣的区域。成像完成后，多次选择仪器软件上的撤回图标以松开探头。最后，使用蒸馏水彻底冲洗液体池探针支架和样品盘。
然后用压缩空气尝试一下。此处显示了 A FM 图像的示例。云母底物提供了一个分子平坦的表面，DNA 和蛋白质可以吸收到该表面。
在生物分子样品之前对 MICA 进行成像可提供阴性对照和成像噪声评估。它还提供了一定程度的保证，即悬臂已正确调整，并且随后的样品成像将成功。推测为超螺旋的双链血浆 DNA 很容易通过其不对称的外观和均匀沉积在以前不起眼的 Micah 底物上来识别。
离散粒径的蛋白质复合物也与 Micah 底物具有独特的区别。粒径差异表明样品异质性，可用于近似蛋白质、复杂的斯多葛几何结构或生化活性。观察到的蛋白质颗粒的一般对角线形状和一致方向。
这是一个成像伪影，因为蛋白质预计会以随机方式在 Micah 底物上定向。观察到的伪影或物理尖端异常或 FM 成像的可能原因以扫描速率的两倍快速进行，而尖端卷积阻止了 x 轴和 Y 轴上的绝对长度测量计算，高度测量或 Z 轴以及相对 X 和 Y 测量对于估计成像生物分子的生物物理特性可能很有用。在尝试此程序时，重要的是要记住准确调整悬臂并对齐光电探测器 遵循此基本 FM 程序。
可以添加其他步骤，包括使用缓冲液交换液池，以回答其他问题，例如分子伴侣影响类固醇受体从其 DNA 反应元件中释放的能力。观看此视频后，您应该更好地了解如何在缓冲条件下使用原子力显微镜对 DNA 蛋白质和生物分子复合物进行成像。
概述
本文描述了一种用于在接近生理缓冲条件下可视化质粒DNA和蛋白质等生物分子的敲击模式原子力显微镜（AFM）方法。该方法包括提高成像质量和准确性的样品制备技术。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 生物化学
背景
- 原子力显微镜（AFM）是成像生物分子的强大工具。
- 了解DNA和蛋白质之间的相互作用对分子生物学至关重要。
- 样品制备对于成功的AFM成像至关重要。
- 在缓冲条件下进行实时成像可以提供对生物分子结构的洞察。
研究目的
- 开发一种使用AFM在水性缓冲液中成像DNA和蛋白质的方法。
- 可视化DNA-蛋白质复合物及其组织。
- 促进对分子伴侣相互作用的理解。
所用方法
- 在适当缓冲液中准备生物分子。
- 设置和校准AFM仪器。
- 在云母基底上成像样品。
- 分析生物分子的大小、数量和组织。
主要结果
- 成功成像双链质粒DNA和蛋白质复合物。
- 通过粒子大小差异识别样品异质性。
- 可视化云母表面的DNA和蛋白质组织。
- 展示该方法在实时成像中的有效性。
结论
- AFM方法为生物分子相互作用提供了宝贵的洞察。
- 样品制备对于高质量成像结果至关重要。
- 这种技术可以推进分子伴侣研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Atomic force microscopy (AFM) enables direct visualization of recombinant DNA, proteins, and their complexes in near-physiologic buffer conditions, supporting early-stage mechanistic de-risking and target validation. This capability provides biopharma R&D teams with high-resolution, label-free structural insights critical for understanding biomolecular interactions and complex assembly. Integrating AFM imaging into discovery workflows enhances predictive confidence and informs portfolio triage decisions at key inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Direct visualization of DNA-protein and protein-protein complexes clarifies molecular assembly and interaction specificity.
- AFM imaging supports functional target validation by revealing complex stoichiometry and heterogeneity.
- Structural mapping of biomolecular complexes reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Label-free imaging in buffered conditions preserves native conformations for accurate hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- AFM provides quantitative topographical data to assess sample homogeneity and complex formation.
- Imaging outputs enable standardization of biomolecule preparations for downstream assays.
- Real-time visualization supports reproducibility and assay readiness for screening campaigns.
- Platform adaptability allows reuse across diverse protein and nucleic acid targets.
Translational & Preclinical Research
- AFM imaging informs preclinical model selection by characterizing disease-relevant biomolecular assemblies.
- Structural insights support translational biomarker alignment when complex formation is linked to functional outcomes.
- Quantitative measurements guide risk-adjusted advancement decisions in preclinical pipelines.
- Mechanistic de-risking is enabled by direct observation of molecular interactions under physiologic conditions.
Pipeline & Workflow Integration
AFM imaging fits within the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, providing a reusable analytical capability for structural interrogation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven mapping of protein-DNA and protein-protein interactions at the single-molecule level.
- Screening: Supplies quantitative, reproducible imaging outputs to benchmark assay performance and sample quality.
- Analytics: Delivers topographical and dimensional data for comparative analysis of biomolecular complexes.
- Translational Research: Supports continuity by linking structural features to functional and disease-relevant endpoints.
- Enterprise Reuse: Adaptable to a wide range of biomolecules, supporting multiple programs and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by clarifying complex assembly.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, cantilever tuning, and sample preparation.
- Demands access to high-resolution AFM instrumentation and analytical software.
- Cross-team standardization is essential for reproducible imaging and data interpretation.
- Buffer composition and substrate selection must be optimized for each biomolecule type.
- Tip convolution and scan rate limitations may affect absolute dimensional measurements.
