Name: 重组DNA和蛋白质复合物，用原子力显微镜的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学习使用轻敲模式原子力显微镜在生理缓冲液中可视化质粒DNA与蛋白质复合物的方法。该技术可实时观察生物分子结构，助力分子伴侣相互作用研究。

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本工作由美国国立卫生研究院资助项目 GM086822 支持。作者谨此感谢华盛顿大学纳米技术用户设施（NTUF）的 Alec Pakhomov 博士和 Paul Wallace 博士，以及布鲁克AXS公司的 Andrea Slade 在专业技术方面的协助。DNA 原子力显微镜（AFM）成像在华盛顿大学 NTUF 完成，该设施是国家纳米技术基础设施网络（NNIN）的成员。2xGal4-2xGRE-luciferase 质粒由加州大学旧金山分校 Keith Yamamoto 博士实验室惠赠。

1. 准备无污染物的 DNA 和蛋白质样品用于成像
<ol>
	<li>分离待成像的生物分子，并将其置于合适的水性缓冲液中。待成像蛋白质可通过液相色谱法6、免疫吸附后去除抗体和沉淀物1,2，或使用Profinity eXact纯化系统并切除标签7（图2A）进行纯化。通过质粒小量提取纯化法分离待成像的DNA分子（图2B）。</li>
	<li>使用SDS-PAGE和蛋白质印迹法确认待成像蛋白样品的组成和纯度。对于DNA，通过限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳确认其序列和纯度。</li>
	<li>将样品在原子力显微镜吸附缓冲液中孵育，以促进样品在云母表面的吸附。对于蛋白样品，可使用10 mM HEPES缓冲液；也可根据需要添加其他低离子强度盐类或其他辅因子。对于DNA样品，需加入二价阳离子（例如Mg2+或Ni2+），以促进其在云母基底上的吸附。一种适用于含Mg2+的DNA缓冲液为10 mM Tris（pH 7.5）、10 mM NaCl、2 mM MgCl23；另一种可选的含Ni2+缓冲液为10 mM HEPES（pH 6.8）、10 mM NiCl2。</li>
	<li>用吸附缓冲液将样品稀释至5 μg/ml的浓度，轻轻混匀。在准备显微镜期间，将样品置于冰上保存。</li>
</ol>
2. 安装原子力显微镜探针
<ol>
	<li>将液体池探针支架放置到相应的悬臂安装对接站上。</li>
	<li>找到将用于成像的锐利氮化硅探针（SNL探针）上较长且较粗的悬臂（称为“B”悬臂）。小心地将其转移至液体池探针支架中，确保探针尖端保持向上。技术提示：在转移探针过程中必须格外小心，因为从任何高度跌落都可能损坏或破坏悬臂或探针尖端。可选用微悬臂SNL（MSNL）探针作为SNL探针的替代品。</li>
	<li>从对接站上取下探针支架，并在光学显微镜下检查悬臂，以确认其完整且已正确安装在液体池探针支架中。</li>
	<li>通过拧紧滚花头夹紧螺钉，小心地将原子力显微镜（AFM）探头从仪器的燕尾槽组件上取下。技术提示：操作AFM探头时必须极度谨慎，因为即使从很短的距离跌落（例如未正确安装在燕尾槽组件中）也可能造成严重损坏。</li>
	<li>将AFM探头翻转，将液体池探针支架牢固地推入AFM探头底部的四个插针上。然后小心地将AFM探头重新放回仪器的燕尾槽组件中。松开滚花头夹紧螺钉，以固定AFM探头在仪器中的位置。</li>
</ol>
3. 定位悬臂针尖、对准激光和调节光电探测器
<ol>
	<li>使用原子力显微镜（AFM）仪器软件，通过调节机载光学显微镜的旋钮来定位悬臂探针尖端。如有必要，调节显微镜照明以改善探针尖端的识别效果。将悬臂探针尖端移至仪器软件显示的十字线附近。</li>
	<li>通过调节软件中光学控制器的上下箭头，使悬臂探针尖端聚焦。调节光学系统时使用慢速（S）或中速（M）档位。</li>
	<li>使用激光调节旋钮将激光对准悬臂探针尖端。调节旋钮直至红色激光点位于白色照明光斑内部。采用之字形路径沿悬臂梁移动，直至激光点准确对准悬臂探针尖端。当对准正确时，AFM探头前窗口将出现一个明亮的反射光斑。</li>
	<li>通过调节AFM探头上的光电探测器旋钮，使光电探测器居中。此操作可使激光点对准仪器软件中光电探测器显示的十字线。此时观测到的信号总和应约为4–6。</li>
</ol>
4. 定位原子力显微镜探头并调节悬臂梁
<ol>
<li>将附着在金属AFM样品台上的新鲜解理云母片放置在AFM支架板顶部的磁性样品 holder 上。该设置将用于在成像第1步中制备的DNA或蛋白质样品之前定位AFM探头。
<ol><li>技术说明：磁性样品 holder 和液体池探头 holder 比其他样品固定装置和探头 holder 更厚。如果当前云母-样品 holder 组件与AFM探头之间的间隙不足，请在仪器软件中多次选择“收回”图标，将AFM探头向上移动。</li></ol></li>
<li>旋转AFM支架板，使样品台处于初始成像位置。确保云母基底位于AFM探头正下方中心位置。</li>
<li>使用仪器软件的“聚焦表面”控制，将AFM探头向下移动至云母-样品台表面。选择Z轴电机的中等（M）速度，继续向表面移动，直到AFM探头距离云母表面约2 mm。此时，切换至Z轴电机的慢速（S）模式，以避免探头与表面发生突然接触（即探针“撞针”）。</li>
<li>继续将探头靠近云母基底表面，直到云母表面的明显特征或探头反射像清晰对焦。使用仪器软件中的“聚焦于：”图标，在表面和探头反射像的焦平面之间切换。</li>
<li>在仪器软件中选择“调谐”图标并调谐悬臂。推荐使用的SNL和MSNL悬臂探头的共振频率为20–60 kHz。选择5%的峰偏移。技术说明：充分的悬臂调谐对于获得良好的样品成像至关重要。</li>
</ol>
5. 云母样品表面成像
<ol>
	<li>将探针接触云母表面。初始扫描尺寸设为 10 μm，扫描速率为 1 Hz。积分增益和比例增益可分别初始设为 0.2 和 0.4。根据需要调整增益，使正向扫描和反向扫描曲线大致重叠。降低振幅设定值可增强探针与云母之间的相互作用，确保探针稳定接触表面。</li>
	<li>获取 10 μm 视场的完整扫描图像。将扫描尺寸依次减小至 5、1 和 0.5 μm，并分别获取各视场的完整图像。根据需要调整增益和扫描速率。对云母表面成像可为后续含有 DNA 和蛋白质的样品提供对比基线。</li>
	<li>在仪器软件上单击“脱离”图标，使探针脱离表面。</li>
</ol>
6. 成像目标生物分子
<ol>
	<li>轻轻混匀在步骤1中制备的DNA或蛋白质样品，并准备将其加载到成像用的云母表面。取5 μl已制备的样品与45 μl新鲜吸附缓冲液混合（最终样品浓度 = 0.5 μg/ml）。</li>
	<li>小心地将50 μl含0.5 μg/ml生物分子的溶液直接加到云母表面。操作时不得移动探针或原子力显微镜（AFM）探头，并确保样品溶液（而非移液枪头）与探针接触。</li>
	<li>静置5分钟，使样品中的生物分子吸附到云母表面。</li>
	<li>5分钟后，用移液枪向液体池探头 holder 中再加入50–100 μl吸附缓冲液，注意不要触碰探针、AFM探头或云母表面。这将形成弯月面，从而实现液体环境下的AFM轻敲模式成像。图3展示了液体池、悬臂梁、样品、样品台和弯月面的最终布局。</li>
	<li>根据需要重新调节光电探测器，并重新对准激光至悬臂梁。技术提示：由于向探头 holder 中加入样品缓冲液后产生的衍射图案，观察探针尖端和激光对准情况会变得复杂。如有必要，可手动重新调节悬臂梁共振频率。</li>
	<li>使用仪器软件重新接入探针。根据需要调整垂直偏转、积分增益和比例增益。这将开始重新成像在加样前刚刚扫描过的云母区域，并采集图像。</li>
	<li>增大扫描尺寸（500 nm–10 μm）以识别感兴趣的区域。放大目标区域并降低扫描速率为0.5 Hz，以提高图像分辨率。</li>
	<li>成像完成后，通过在仪器软件中多次点击“收回”图标使探针退出。在拆卸液体池或样品盘之前，务必确保AFM探头与样品盘之间有足够的间隙。</li>
	<li>用去离子水彻底冲洗液体池探头 holder 和样品盘，以防止残留的吸附缓冲液蒸发后形成盐结晶。用压缩空气吹干。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
原子力显微镜（AFM）图像的示例如图4所示。云母基底（A）提供了一个分子级平坦的表面，可用于吸附DNA和蛋白质。在生物分子样品成像前对云母进行成像，可作为阴性对照，用于评估成像噪声，并确保悬臂梁已正确调谐，从而保证后续样品成像的成功。双链质粒DNA（B，D）——推测为超螺旋构象——因其不对称的外形以及在原本无特征的云母基底上的均匀沉积而易于识别。具有明确粒径的蛋白质复合物（C，E）也可与云母基底清晰区分。颗粒尺寸的差异反映了样品的异质性，有助于估算蛋白质复合物的化学计量比或生化活性。图C中观察到的蛋白质颗粒普遍呈对角线状且取向一致，属于成像伪影，因为蛋白质在云母基底上的取向应是随机的。该伪影的可能原因包括探针尖端的物理异常，或AFM扫描速率过快。尽管探针尖端卷积效应（如图1B所示）会阻碍在x轴和y轴方向上进行绝对长度测量，但z轴方向的高度测量以及相对的x、y轴测量仍可用于估算被成像生物分子的生物物理特性。
<img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig1.jpg" alt="原子力显微镜示意图，显示用于表面成像分析的激光、悬臂、扫描器。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1：轻敲模式原子力显微镜（AFM）的示意图。A，显微镜结构。悬臂末端带有一个尖锐探针，在扫描吸附于云母基底上的生物分子复合物表面时上下振荡。当扫描器在x和y方向移动时，激光束从悬臂背面反射至位置敏感的光电二极管探测器，从而记录探针在经过云母表面固定的生物分子复合物时在垂直（z）方向上的移动距离，实现形貌映射。B. 由于探针卷积效应导致x和y方向上的图像畸变。传统氮化硅探针的标称半径大于待成像颗粒，探针边缘在扫描过程中与样品接触，导致成像颗粒在x和y方向上显得更大，而在z方向上不受影响。通过使用标称半径更小的探针可减小该效应。
<img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig2.jpg" alt="免疫吸附过程示意图，显示蛋白复合物的释放及用于成像的DNA吸附。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2： 免疫吸附蛋白与DNA样品制备示意图。A，从单克隆抗体（mAb）-蛋白A-Sepharose（PAS）沉淀中释放免疫吸附的GR•hsp70蛋白复合物。将免疫沉淀物与含有mAb表位的肽段孵育，可促进GR•hsp70蛋白复合物从沉淀中释放，从而使该复合物从上清液中收集，并通过原子力显微镜（AFM）进行观察。B，用于AFM成像的DNA制备需使用二价阳离子吸附缓冲液。二价阳离子可增强DNA与云母基底之间的结合亲和力。
<img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig3.jpg" alt="原子力显微镜装置；AFM探头、液体池、样品盘用于样品检测。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3： AFM探头、液体池探针夹持器、样品、样品台及缓冲液弯月面的最终布置。A，在将样品和额外缓冲液滴加到云母基底上时，必须小心避免移液枪头与AFM探头、液体池以及云母基底发生物理接触。B，A的放大图。缓冲液弯月面从样品盘延伸至液体池探针夹持器。
<img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig4.jpg" alt="原子力显微镜；AFM图像；分子结构；纳米结构分析；表面形貌。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4：云母基底（A）、2xGal4-2xGRE-荧光素酶质粒DNA8（B, D）以及GR•hsp70蛋白复合物（C, E）在缓冲溶液中的原子力显微图像。云母作为对照图像，用于与DNA和蛋白质的可视化结果进行比较。GR•hsp70蛋白复合物通过免疫吸附预先与hsp70结合的GR，随后使用竞争性单克隆抗体（mAb）从抗体-磁珠沉淀中释放而制备（如图2A所示）。DNA通过常规质粒小量提取方法制备。图A、B和C具有相同的放大倍数（比例尺 = 200 nm），图D和E亦具有相同的放大倍数（比例尺 = 40 nm）。

<ol><li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%C2%95hsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptorhsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J Biol Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li>
<li>Harrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+glucocorticoid+receptor+transport+on+microtubules+by+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence for glucocorticoid receptor transport on microtubules by dynein.</a> J Biol Chem. 279, 54647-54654 (2004).</li>
<li>Pastre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+DNA+to+mica+mediated+by+divalent+counterions%3A+a+theoretical+and+experimental+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Adsorption of DNA to mica mediated by divalent counterions: a theoretical and experimental study.</a> Biophys J. 85, 2507-2518 (2003).</li>
<li>Guthold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+one-dimensional+diffusion+and+transcription+by+Escherichia+coli+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Direct observation of one-dimensional diffusion and transcription by Escherichia coli RNA polymerase.</a> Biophys J. 77, 2284-2294 (1999).</li>
<li>Petrucco, S., Volpi, G., Bolchi, A., Rivetti, C., Ottonello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nick-sensing+DNA+3%27-repair+enzyme+from+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A nick-sensing DNA 3'-repair enzyme from Arabidopsis.</a> J Biol Chem. 277, 23675-23683 (2002).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation%2Fdeacetylation+of+the+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J Biol Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li>
<li>Ruan, B., Fisher, K. E., Alexander, P. A., Doroshko, V., Bryan, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+subtilisin+into+a+fluoride-triggered+processing+protease+useful+for+one-step+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Engineering subtilisin into a fluoride-triggered processing protease useful for one-step protein purification.</a> Biochemistry. 43, 14539-14546 (2004).</li>
<li>Meijsing, S. H., Elbi, C., Luecke, H. F., Hager, G. L., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ligand+binding+domain+controls+glucocorticoid+receptor+dynamics+independent+of+ligand+release%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The ligand binding domain controls glucocorticoid receptor dynamics independent of ligand release.</a> Mol Cell Biol. 27, 2442-2451 (2007).</li>
<li>Shen, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+effective+sample+preparation+method+for+atomic+force+microscopy+visualization+of+individual+DNA+molecules+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">A simple and effective sample preparation method for atomic force microscopy visualization of individual DNA molecules in situ.</a> Mol Biol Rep. 38, 965-969 (2010).</li>
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<li>Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+effects+of+matrix+stiffness+on+cellular+function+using+acrylamide-based+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Brunger, A. T., Weninger, K., Bowen, M., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+the+neuronal+SNARE+fusion+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of the neuronal SNARE fusion machinery.</a> Annu Rev Biochem. 78, 903-928 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

原子力显微镜（AFM）提供了一种独特的显微技术，能够在水相及接近生理条件的缓冲溶液中实时成像未经包埋处理的单个生物大分子。该技术可用于观察单个蛋白质和DNA分子，以及多蛋白复合物和蛋白质-DNA复合物。利用AFM对大分子颗粒进行成像，有助于评估样品的均一性，并揭示所观察颗粒中各组分的空间构型。这种对单个大分子颗粒的观测方法可作为传统生物化学技术的有力补充，例如免疫共沉淀实验、聚丙烯酰胺凝胶电泳和尺寸排阻柱层析，后者提供的数据通常是样品中大量（103-1011）目标生物大分子复合物的综合结果。
利用原子力显微镜（AFM）可研究多蛋白复合物的化学计量比、生物分子相互作用以及辅因子需求。本文所述方法可根据特定的生物物理问题进行调整。例如，使用可更换缓冲液的液体池探针架，即可检测蛋白复合物形成所需的辅因子。DNA-蛋白质组装体可在接近实时的条件下形成或解离，甚至可在成像过程中进行。可制备含有特定目标序列（如假定的响应元件或新型蛋白质结合序列）的DNA，与假设的结合蛋白混合后进行成像，从而为分子间相互作用提供直接证据。
与在水溶液中成像相比，采用轻敲模式原子力显微镜（AFM）对干燥样品进行成像要简单得多，线性DNA分子和闭合环状DNA质粒均已被成功以这种方式成像3,9。本文所采用的方法是在缓冲溶液中对样品进行成像，以提供更接近生理条件的成像环境。此外，还应考虑其他重要的蛋白质成像方法，例如近场红外显微技术10。将免疫吸附与AFM联用，可借助成熟的生物化学技术制备多种蛋白质复合物，随后在这些复合物从免疫吸附抗体-磁珠沉淀中释放后进行可视化观察。例如，通过该方法已对免疫吸附的糖皮质激素受体（GR）与分子伴侣蛋白hsp701以及动力蛋白dynein2的相互作用进行了检测，以评估复合物的大小和化学计量比。颗粒的尺寸及生物物理特性（如刚性）在确定AFM成像样品中所观察到的生物分子身份方面具有重要价值11,12。此外，还可通过添加能与目标生物分子特异性结合的相互作用分子（如配体或单克隆抗体），在目标分子存在时引起颗粒尺寸增大，从而进一步确认生物分子的身份。

<table><tbody><tr><td>Dimension 3100</td><td>Bruker Corporation</td><td>Dimension 3100</td><td></td></tr><tr><td>Dimension 流体池</td><td>Bruker Corporation</td><td>DTFML-DD-HE</td><td></td></tr><tr><td>锐利氮化硅悬臂（SNL）原子力显微镜探针</td><td>Bruker Corporation</td><td>SNL-10</td><td></td></tr><tr><td>微型锐利氮化硅悬臂（MSNL）原子力显微镜探针</td><td>Bruker Corporation</td><td>MSNL-10</td><td></td></tr><tr><td>NanoScope 原子力显微镜仪器软件</td><td>Bruker Corporation</td><td>004-132-000</td><td></td></tr><tr><td>金属原子力显微镜样品圆盘</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16208</td><td></td></tr><tr><td>V1级云母圆盘，12 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>50-12</td><td></td></tr></tbody></table>

利用原子力显微镜观察重组dna与蛋白质复合物

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

原子力显微镜（AFM）可用于观察单个蛋白质、DNA分子、蛋白质-蛋白质复合物以及DNA-蛋白质复合物。显微镜悬臂末端带有一个纳米级探针，可在从纳米到微米尺度的范围内扫描成像区域，测量样品基底表面上大分子在任意位置的高度。静电作用力使蛋白质、脂质和核酸以随机方向松散地吸附在基底上，从而实现成像。所获得的数据类似于地形图，其中大分子表现为具有明确尺寸的三维颗粒（图1）1,2。轻敲模式AFM通过悬臂的周期性振荡实现成像，适用于相对柔软的生物材料（如DNA和蛋白质）的观察。相较于其他纳米级显微技术，AFM的一个显著优势在于其能够在水性缓冲液中实时成像单个蛋白质和大分子复合物，包括接近生理条件的缓冲环境，且无需对样品进行染色或镀膜处理。
本文所述方法描述了在缓冲溶液中对DNA及免疫吸附的转录因子（即糖皮质激素受体，GR）进行成像（图2）。免疫吸附的蛋白质及其复合物可通过与抗体表位竞争，从抗体-磁珠沉淀中分离，随后进行成像（图2A）。该步骤可在成像前对目标生物分子进行生化操作。纯化后，可将DNA与蛋白质混合，并对形成的相互作用复合物进行成像。DNA与云母的结合需要二价阳离子3，例如Ni2+或Mg2+，这些离子可添加至样品缓冲液中，同时保持蛋白质活性。采用类似方法，原子力显微镜（AFM）已被用于可视化单个酶分子，包括RNA聚合酶4和一种修复酶5，以及它们与单条DNA链的结合状态。这些实验为分子水平上的蛋白质-蛋白质及DNA-蛋白质之间的生物物理相互作用提供了重要见解。利用AFM对单个大分子颗粒进行成像，有助于判断颗粒的均一性，并揭示成像颗粒中各组分的物理空间排布。尽管本方法最初是为可视化GR-分子伴侣蛋白复合物1,2以及GR可结合的DNA链而开发，但其亦可广泛应用于来自多种来源的DNA和蛋白质样品的成像。

本文描述了一种采用轻敲模式原子力显微镜（AFM）对质粒DNA、细胞质蛋白以及DNA-蛋白复合物进行成像的可视化方法。该方法包括在生化处理后，用于制备AFM成像样品的多种可选方案。在接近生理状态的缓冲条件下，可观测到含有特定蛋白结合区域的DNA结构。

利用原子力显微镜观察重组DNA与蛋白质复合物

原子力显微镜（AFM）可用于观察单个蛋白质、DNA分子、蛋白质-蛋白质复合物以及DNA-蛋白质复合物。在……

本实验的总体目标是利用原子力显微镜在水相缓冲液中实时成像生物分子（如 DNA 和蛋白质）。首先需制备待成像的生物分子，随后设置原子力显微镜并定位 FM 悬臂探针。随后对样品表面及感兴趣的生物分子进行成像和分析。最终可通过原子力显微镜在缓冲条件下获得DNA和蛋白质以及异质性生物分子复合物的总体尺寸、数量和组织结构信息。该方法有助于解答分子伴侣领域中的关键科学问题，例如分子伴侣与共伴侣复合物结合客户蛋白时的空间构象（STO几何结构）是什么。蛋白质 该方法的可视化演示非常有益，因为原子力显微镜（AFM）和Kent杠杆探针的制备步骤较为复杂，主要由于其物理操作的精细性，仅通过印刷说明难以掌握。本实验操作将由本实验室的两名学生摩根·香农（Morgan Shannon）和约翰·格茨（John Gertz）进行演示。首先，分离待成像的蛋白质或DNA分子，并将其悬浮于水相缓冲液中。在确认样品纯度后，将其置于冰上孵育于AFM吸附缓冲液中，以促进样品在云母表面的吸附。对于蛋白质样品，使用 10 毫摩尔的 HEPES 缓冲液。对于 DNA 样品，含有镁离子的缓冲液由 10 毫摩尔 Tris（pH 7.5）、10 毫摩尔氯化钠和 2 毫摩尔氯化镁组成，适用于安装原子力显微镜探针。将液体池探针支架放置到相应的悬臂安装对接站上。找到用于成像的尖锐氮化硅探针上的长而厚的悬臂。小心地将其转移至液体池探针 holder 中，确保探针尖端保持朝上。接着，在光学显微镜下检查悬臂，以确认其完整且正确安装在液体池探针 holder 中。然后，通过拧紧神经头夹紧螺钉，小心地从仪器燕尾组件上取下原子力显微镜（AFM）探头。将原子力显微镜（AFM）探头倒置，并用力将液体池探头支架推入原子力显微镜（AFM）探头底部的四个插针上。最后，小心地将原子力显微镜（AFM）探头重新安装回仪器的燕尾组件中。为了在成像样品前进一步准备原子力显微镜（FM），移动内置光学显微镜的旋钮以定位悬臂尖端，然后使用软件中光学控制器的上下箭头调节，使悬臂尖端处于焦点位置。使用激光调节旋钮将激光对准悬臂尖端。这是本实验方案中技术难度最高的步骤之一，定位过程需手动完成，要求精确调节旋钮。仔细监测反射光斑和照明光斑中的激光，可提高成功准直的可能性。接下来，调节原子力显微镜（AFM）探头上的光电探测器旋钮，使光电探测器居中。将一片新解理并粘附在金属AFM样品圆盘上的云母片放置在位于AFM支架板顶部的磁化样品 holder 上。旋转 FM 持有板，使样品圆盘处于初始成像位置。使用仪器软件的聚焦面控制功能，将 FM 探头向下移动至 MICA 样品圆盘表面。当 MICA 表面的明显特征或探针反射清晰对焦时，从仪器软件中选择调谐图标，并对悬臂进行调谐。推荐的 MSNL 或 SNL 探针的共振频率为 20 至 60 千赫兹。选择 5% 的峰值偏移以对云母样品进行成像。首先，将探针与云母表面接触，设定初始扫描尺寸为 10 微米，扫描速率为 1 赫兹。捕获10微米区域的完整扫描图像。然后将扫描尺寸减小至5微米、1微米和0.5微米，并分别捕获每个区域的完整图像。通过在仪器软件上单击脱离图标一次，使探针脱离。为了成像目标生物分子，将5微升制备好的样品与45微升新鲜吸附缓冲液混合。小心地将50微升含有0.5微克/毫升生物分子的溶液直接加到MICUs表面。静置5分钟，使样品中的生物分子吸附到Micah表面。然后用移液器向液体池探头支架中再加入 50 至 100 微升吸收缓冲液。注意不要触碰探头、FM 头或云母片，使用移液器尖端必要时重新调整光电探测器，并重新对准激光至悬臂。然后使用仪器软件重新使探头接触样品。增大扫描范围以确定感兴趣区域。成像完成后，在仪器软件中多次点击退出图标，使探针脱离。最后，使用蒸馏水彻底冲洗液体池探针座和样品圆盘。然后用压缩空气尝试。此处展示了一幅原子力显微镜（AFM）图像的示例。云母基底可提供分子级平整的表面，便于DNA和蛋白质吸附。在生物分子样品成像之前对MICA进行成像，可提供阴性对照并评估成像噪声水平，同时也能确保探针已正确调谐，从而保证后续样品成像的成功。双链质粒DNA（推测为超螺旋构型）因其不对称的形态以及在原本无显著特征的MICA基底上均匀沉积的特性，可被清晰识别。具有不同粒径的蛋白质复合物也可从Micah底物中明确区分。颗粒大小的差异表明样品的异质性，可用于估算蛋白质、复合物的化学计量比、几何构型或生物化学活性。所观察到的蛋白质颗粒呈现普遍的对角线形状和一致的取向。此处为一种成像伪影，因为蛋白质在Micah基底上的取向通常是随机的。观察到的伪影可能由以下原因引起：探针物理性异常，或在过快的扫描速率下进行调频（FM）成像，同时由于探针卷积效应，导致无法在x和y轴方向进行绝对长度测量，也无法在z轴方向进行高度测量；但相对的x和y方向测量值仍可用于估算所成像生物分子的生物物理特性。在执行该操作时，必须牢记在遵循基本的调频（FM）成像流程后，准确调节悬臂梁并校准光电探测器。还可以增加其他步骤，例如使用缓冲液交换流体池，以回答更多问题，如分子伴侣是否能够影响类固醇受体从其DNA反应元件上的释放。观看本视频后，您应能更好地理解如何在缓冲条件下利用原子力显微镜对DNA蛋白及生物大分子复合物进行成像。

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