接触模式原子力显微镜作为形态观察和细菌细胞损伤分析的快速技术
2023年6月30日
在这里，我们介绍了原子力显微镜（AFM）作为一种简单快速的细菌表征方法的应用，并分析了诸如细菌大小和形状，细菌培养生物膜以及纳米颗粒作为杀菌剂的活性等细节。
该协议显示了使用接触模式原子力显微镜来观察由于特定疾病或治疗引起的细胞形态变化。强烈建议在此过程中使用密封容器以避免污染，并尽快分析固定样品以避免老化。首先将样品固定在载玻片上，将载玻片轻轻地放在火焰上几次，直到样品干燥。
将固定的样品放入培养皿中，并将它们运送到原子力显微镜设备中进行观察。接下来，打开计算机和原子力显微镜。然后在软件中选择接触模式、ContAI-G 探头和自动斜率选项。
通过将设定点设置为 20 纳米、P 增益设置为 10， 000、I 增益设置为 1， 000、D 增益设置为零以及尖端电压设置为 0 毫伏来设置 Z 控制器的默认值。使用 70 微米扫描范围头，将样品置于 AFM 接触模式。通过使用安装在集成在扫描头中的两个镜头上的相机，快速查看探头下方区域的表面。
现在，通过在XY平面中手动置换所需区域来选择所需区域。允许探头以电子方式接近样品表面，直到达到接触。通过减小XY斜率方向，以电子方式调整扫描仪和样品表面的XY测量平面。
将软件的标准参数设置为每秒一行，每行256点。然后执行 70 x 70 微米区域的完整扫描范围。使用缩放工具选择较小的区域。
通过电子缩回悬臂并沿XY平面移动样品，从样品中选择一个新区域。然后执行新的扫描，如前所述。接下来，使用过滤器选择中图像的工具菜单中的逐行调平来执行数据处理。
优化颜色条中的最大和最小高度，以获得最佳图像分辨率。最后，使用分析菜单执行图像分析。使用所需工具选择初始点和终点以确定长度和距离。
对细菌培养物的原子力显微镜分析表明，金黄色葡萄球菌培养物按球菌聚集区分布。尺度的增加表明，种群分布和球菌形态的了解程度更高。AFM接触模式图像允许确定cocci的大小，其平均宽度为1.25微米。
湖南假单胞菌在整个玻璃支撑表面上表现出均匀的分布，形成粘附的单层。培养物呈杆状，长度为1.9微米，宽度为0.9微米。由于严重的细胞结构恶化，金黄色葡萄球菌氧化镁纳米颗粒的微稀释暴露导致光滑表面和均匀轮廓的损失。
在浓度高于MIC的培养物中观察到囊泡形成和胞质物质释放。在大肠杆菌培养物中也获得了类似的结果，对照显示光滑的表面，突出了其均匀的棒状形状。该结构在1， 000 PPM纳米颗粒暴露时完全消失，只有可区分的轮廓。
正确执行样品固定非常重要，因为它对于进一步分析至关重要。图像过滤器有助于提供良好的图像分辨率和样本细节。使用固定方法，可以应用AFM非接触模式，这有助于研究机械性能。
这种方法对于专注于细菌细胞损伤分析的医学和微生物学研究来说可能是一种廉价且有用的工具。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究利用原子力显微镜（AFM）对细菌进行详细表征，重点关注细菌大小、形状、培养生物膜以及纳米粒子的杀菌效果。该协议强调仔细的样品制备和特定的成像技术，以观察细菌细胞的形态变化。
关键研究组成部分
研究领域
- 微生物学
- 细菌表征
- 纳米粒子研究
背景
- 原子力显微镜是观察细菌形态的重要工具。
- 了解细菌生物膜的形成及其对杀菌剂的反应有助于医学研究。
- 样品制备对于准确的成像和分析至关重要。
使用的方法
- 接触模式下的原子力显微镜
- 金黄色葡萄球菌和湖南假单胞菌培养
- 纳米粒子暴露试验
主要结果
- AFM分析揭示了细菌细胞的大小和分布，金黄色葡萄球菌的平均宽度为1.25微米。
- 氧化镁纳米粒子浓度的增加导致细菌细胞的显著形态变化。
- 该研究证明了AFM在分析细菌结构完整性方面的有效性。
结论
- 这种方法突出了AFM在微生物学中的实用性，特别是在评估细菌损伤方面。
- 研究结果有助于更广泛地理解细菌对治疗的反应。
常见问题
Executive Industry Relevance
Contact mode atomic force microscopy (AFM) enables rapid, high-resolution morphological assessment of bacterial cells, supporting early-stage evaluation of antimicrobial interventions. This technique provides actionable 3D topography and cell damage data without the complexity or cost of electron microscopy, facilitating efficient screening of nanoparticle effects on bacterial integrity. AFM's operational simplicity and quantitative outputs position it as a valuable tool for mechanistic de-risking and target validation in anti-infective discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of bacterial cell morphology and structural changes following compound exposure.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cell damage and morphological disruption at the nanoscale.
- Facilitates rapid hypothesis testing regarding antimicrobial mechanisms of action.
Screening & Assay Development
- Provides reproducible, quantitative topographical data for assay standardization and validation.
- Accelerates screening of nanoparticle or compound libraries for bactericidal effects.
- Delivers high-content imaging outputs suitable for downstream comparative analytics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological readouts with translational biomarkers of bacterial cell integrity.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical validation of antimicrobial candidates.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust evidence of cellular impact.
Pipeline & Workflow Integration
AFM contact mode integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early, quantitative assessment of bacterial cell damage and morphology in response to candidate interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of antimicrobial mechanisms and cellular targets.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging data for compound triage and prioritization.
- Analytics: Provides quantitative measurements of cell size, surface integrity, and morphological disruption.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with preclinical models by aligning morphological endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective platform for repeated use across diverse bacterial strains and compound classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antimicrobial efficacy and mechanism-of-action studies.
- Operational Value: Reduces time and cost compared to electron microscopy while maintaining high-resolution outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, quantitative evidence of cellular impact.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antimicrobial candidates based on direct morphological evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and sample preparation to ensure data quality.
- Needs access to AFM instrumentation with contact mode capability and appropriate probes.
- Demands standardized protocols for sample fixing and imaging to ensure reproducibility across teams.
- Adaptable to various bacterial strains and nanoparticle types with protocol optimization.
- Sample aging and contamination must be minimized to preserve morphological integrity for analysis.
