בידוד של פידליטי גרסאות של וירוסים RNA ו אפיון תדירות המוטציה וירוס

נגיפי RNA משתמשים ב-RNA פולימראז מקודד ויראלית כדי לשכפל את הגנום שלהם. לפולימראזים אלה יש שיעור שגיאה גבוה יותר באופן מהותי, מה שמאפשר לנגיף להסתגל ולהתפתח במהירות. סרטון זה מציג שיטה אופטימלית לסינון וזיהוי נגיפים עם מוטציות ב-RNA פולימראז שלהם המשפיעות על שיעור השגיאות או הנאמנות במהלך השכפול.

מוטגנים ראשונים מיושמים על תאי מארח נגיפיים כדי לקבוע את הרמה המקסימלית של מוטגן שניתן להשתמש בה מבלי להרוג את התאים או לעכב את הנגיף. לאחר שנקבעו התנאים האופטימליים, הנגיף מועבר תחת לחץ סלקטיבי של RNA mutagens. לאחר מכן מרוצפת האוכלוסייה העמידה למוטגנים כדי לזהות את המוטציה האחראית.

לאחר מכן, המוטציה העמידה למוטגן מבודדת. קינטיקה של השכפול מנוטרת והתוצאות מראות עליות או ירידות בנאמנות הפולימראז. במקביל לעמידות רחבה למוטגנים של RNA ושינויים בשכיחות המוטציות באוכלוסיית הנגיף.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו חומצות נאמנות ביוכימיות המשתמשות בפולימראזים מטוהרים הוא שהטכניקות המעורבות תקפות לכל נגיף RNA שניתן לגדל בתרבית רקמות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הווירולוגיה, כגון תפקידו של פולימראז אט בהסתגלות ואבולוציה של נגיף. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהלחצים הסלקטיביים שהם משתמשים בהם חזקים מדי או חלשים מדי, ומדגם הרצף מנתח את גודל רצף האזור ומספר השיבוטים לא מותאם לעוצמה סטטיסטית.

התחל ניסוי זה על ידי קביעת טווח ריכוזי המוטגנים שניתן להשתמש בהם בניסויים הבאים מבלי לגרום למוות של תאים. שאפו את המדיום משש לוחות באר המכילים שכבות חד-שכבתיות תת-משותפות של תאים הילריים. לאחר מכן מוסיפים כאן שני מיליליטר של מדיום משלים מוטגן, משתמשים במוטגנים ריבובירין חמישה פלו אורציל חמישה אזציטידין מגנזיום כלוריד ומנגן כלוריד.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, כל 24 שעות במשך היומיים עד שבעה הימים הבאים, השתמש בצלחת תאים אחת כדי לבדוק את הכדאיות על ידי אי הכללת טריאם כחול. באמצעות ציטומטר המו, חשב את אחוז התאים ברי קיימא עבור כל ריכוז של מוטגן, כולל תנאי הבקרה הלא מטופלים המביאים לפחות מ-50% מוות תאים עד נקודת הקצה של ההדבקה.

כאשר מגיעים לטיטר המקסימלי הוא אידיאלי, השלב הבא של ההליך הוא לקבוע את ריכוז המוטגן שיפעיל לחץ סלקטיבי אופטימלי ללא מוטגן יתר על האוכלוסייה בריכוזים המתאימים. כל גנום עובר מוטציה במיקום אחד או שניים לפחות. המוטגן ייצור אפוא את מוטציית ההתנגדות, אשר לאחר מכן תיבחר במהלך המעבר.

אם יוכנסו יותר מדי מוטציות, המוטציות הנושאות את מוטציית העמידות יהיו קטלניות בעצמן. מוטגן מעכב את בידודם בשש צלחות באר שנזרעו איתו. התאים שלנו בשני מיליליטר של מדיום עם תוסף מוטגן משתמשים באותו טווח ריכוזים כמו קודם, למעט ריכוזים שגרמו ליותר מ-50% מוות תאי.

דגירה במשך שעתיים כדי לאפשר קליטת מוטגנים לאחר הדגירה. שאפו את המדיום והדביקו בנגיף בריבוי נמוך של זיהום ב-200 מיקרוליטר דגרו במשך 15 עד 60 דקות כדי לאפשר לנגיף להדביק את התאים, תוך נענוע הצלחת במרווחי זמן קבועים כדי להבטיח שהחיסון מכסה את התא. חד-שכבתי שואבים את הנגיף המחוסן ושוטפים פעמיים עם שני מיליליטר PBS כדי להסיר כמה שיותר מהחיסון.

לאחר מכן הוסף מדיום עם מוטגן לכל באר ודגר תאים למשך שלושה עד שישה מחזורי שכפול, בדרך כלל יומיים עד שבעה ימים. קצור וירוס מכל באר ובצע בדיקת פלאק סטנדרטית או דילול מגביל כדי לקבוע את ההשפעה האנטי-ויראלית על טיטר הנגיף מהטיטרים המחושבים. זהה את ריכוז המוטגן המפחית את טיטר הנגיף בהשוואה לזיהום הביקורת הלא מטופל ב-0.5 עד שני בולי עץ שגם אינו רעיל במיוחד לתאים.

באופן אידיאלי רעילות של פחות מ-50% לבידוד וריאנטים עמידים למוטגן מתחילה במעבר של הנגיף בתאי מרפא עם הריכוז האופטימלי של כל מוטגן, ייתכן שיהיה צורך להעביר את הנגיף עד 30 פעמים בכל מעבר, להגביר את הנגיף ולחזור על ההדבקה והדגירה עם מוטגן כפי שמוצג כאן. טיטר הנגיף של דגימות שטופלו במוטגן אמור לרדת במהלך המעברים הראשונים בהשוואה לטיטר הנגיף המקורי ולטיטר נגיף הביקורת הלא מטופל. ברגע שהטיטרים של הנגיף עבור סדרה נתונה מגיעים לאותו גודל כמו טיטר הביקורת הלא מטופל, מה שמרמז על עמידות.

חלץ את ה-RNA הנגיפי לריצוף באמצעות פריימרים המגדילים את הפולימראז או משכפלים גנים של הנגיף המעניין. צור CDNA של הגנום הנגיפי על ידי R-T-P-C-R, ולאחר מכן רצף את ה-DNA. לאחר קבלת מידע הרצף.

השתמש בתוכנת יישור כדי ליישר את הרצפים המתקבלים עם קונצנזוס הייחוס ולזהות את המוטציות הנקודתיות החדשות. בנוסף, בדוק את הכרומטוגרמות עבור פסגות מיעוט שאולי הוחמצו על ידי יישור תוכנה מוטציה המייצגת 20 עד 30% מכלל האוכלוסייה עדיין תופיע כשיא, אך קטנה מכדי להיות מזוהה כנוקלאוטיד מעורב על ידי ניתוח רצף סטנדרטי כדי לזהות את המוטציה המעניינת, חפש פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים המופיעים אך ורק באוכלוסייה שטופלה במוטגן בהשוואה לבקרה לא מטופלת מאותו מעבר כפי שמוצג הנה. לאחר זיהוי מוטציה, יש לחדש את הווריאנט העמיד מ-CD NA זיהומי או לבודד אותו בתרבית רקמה ולאשר את פנוטיפ העמידות.

כאן אנו מבודדים על ידי בדיקת פלאק כדי לבודד את המוטציות שזוהו. הכן דילול סדרתי של הדגימה העמידה בחנקן והוסף אותם לחד-שכבות תאים על שש לוחות באר לבדיקת פלאק לאחר דגירה של שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה פחמן דו חמצני מסונכרנים. הוסף שכבת אגרוז יומיים עד חמישה ימים לאחר ההדבקה.

הלוח צריך להיות גלוי בבירור. באופן אידיאלי, אחת הלוחות תייצר בין 10 ל -50 לוחות מופרדים היטב. סמן את מיקום הלוחות על הצלחת עם נקודה, בעזרת סמן, תוך כדי לא לעקור ולשנות את מיקום השכבות, צלול בעדינות קצה פילטר P 200 דרך שכבת האגרוס.

כדי להגיע ללוחית הרם בזהירות את הקצה מהכיסוי והעביר את פקק הארוס לצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל 250 מיקרוליטר מדיום. כמות מספקת של וירוס תועבר ללא קשר לשאלה אם פקק ה-aros משוחרר ממערבולת הקצה שהצינור אוסף עד TenX לכל טיפול. שמור חלק מהדגימה כדי להגביר את הנגיף החי מאוחר יותר.

לאחר מכן חלץ את ה-RNA משארית הדגימה ובצע R-T-P-C-R כדי לזהות את דגימת הפלאק המכילה את המוטציה הרצויה. רצף את ה-CDNA. ודא שאין מוטציות נוספות.

לאחר מכן הכינו מלאי גדול יותר של הנגיף הזה עבור כל המחקרים במורד הזרם. הבא כדי לאשר את העמידות שמעניקה המוטציה שזוהתה. חזור על בדיקת המוטגן באמצעות מספר תנאים מוטגניים.

אם הווריאנט עמיד בפני מוטגנים מרובים, סביר להניח שיש לו נאמנות מוגברת. מכיוון שמוטציות משנות נאמנות ממופות לפולימראז, חשוב לאשר שקינטיקת השכפול אינה משתנה באופן משמעותי. לפני קביעת תדירות המוטציות, בדוק את השכפול בשתי גישות משלימות לפחות.

לדוגמה, ניתן לבצע גישה הבוחנת ייצור וירוסים כגון בדיקת פלאק או TCID 50 בנוסף לגישה הבוחנת סינתזת RNA כגון R-T-P-C-R כמותי או כתם צפוני. לאחר מכן, כדי לאשר ששינוי הפולימראז שזוהה המעניק עמידות למוטגן משנה שכפול עבור תדירות מוטציות נאמנות. זה יכול להתבצע על אוכלוסיית וירוס בת קיימא או כוללת.

כדי לקבוע את תדירות המוטציות של אוכלוסיית הנגיף הכוללת, הכוללת וריאנטים ברי קיימא ולא ברי קיימא, חלץ את ה-RNA ו-R-T-P-C-R מגבירים אזור של 800 עד 1,200 נוקלאוטידים מרצף קידוד שידוע שיש לו וריאנטים גנטיים כמו זה המקודד לחלבון מבני. לאחר מכן, topo TA משכפל את המוצר המטוהר עבור כל אוכלוסיית וירוסים שיש ללמוד. בחר 96 מושבות שזוהו כבעלות תוספת חיובית על ידי הקרנה כחולה לבנה על לוחות מצופים xga.

בצע PCR של מושבה אחת כדי לאשר את תקפות הבדיקה הכחולה הלבנה. שימוש בגודל השבר ובתנאים מעל כ-90% מהמושבה צריך להיות חיובי. עבור כל מושבה לבנה חיובית, השתמש בקיסם כדי להעביר כל מושבה למיליליטר אחד של מדיום LB ב-96.

ובכן, צלחות תרבית חיידקים דוגרות בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול מתמיד. למחרת. בודד את ה-DNA על ידי הכנת מיני הכנות ברצף בפורמט 96 באר כל צלחת עם מספיק פריימרים כדי להשיג כיסוי מקסימלי של הקטע המשובט.

שני פריימרים של כיסוי בסיס 600 אמורים להספיק. בצע ניתוח רצף באמצעות רצף ייחוס או קונצנזוס עבור כל אוכלוסייה ויישור מתאים תוכנה שיכולה לזהות בקלות פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים כאן. חפש תוכנת אדם מלייזר כוכב DNA.

משתמשים בגן תחילה כדי להשליך רצפים באיכות ירודה כגון אלה עם בסיס גרוע שקורא לקצוות רבים או כאלה שאורכם קצר מדי. יישר את הרצפים הנותרים. זהה את טווח הנוקלאוטידים המכוסה על ידי כל הרצפים בניתוח.

השליכו שיבוטים שאינם מכוסים במלואם ברחבי אזור זה. מטעמי השוואה, חיוני שאותו אזור יהיה מכוסה במלואו. זהה וספור את הפולימורפיזמים של הנוקלאוטידים הבודדים השונים מזן הייחוס.

חשב את תדירות המוטציות על ידי חלוקת המספר הכולל של פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים במספר הכולל של נוקלאוטידים ברצף. הצג מספר זה כמספר הממוצע של מוטציות לכל 10,000 נוקלאוטידים ברצף. אם אותו פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד מופיע על מספר רב של שיבוטים, הצג שני ערכים הכוללים או אינם כוללים את המוטציות החוזרות הללו.

קבע את התפלגות המוטציות. ערכו רשימה מדורגת של מספר השיבוטים בכל אוכלוסייה שמציגה 0, 1, 2, 3 וכן הלאה. מוטציות באזור מרוצפות כאופציה.

השתמש ברצפים הערוכים כדי לחשב את כל ההשוואות הזוגיות האפשריות בתוך מדגם כדי לקבל ערכים ממוצעים של מגוון האוכלוסייה. מספר תוכניות יישור זמינות כאן. תוכנית ניתוח גנטיקה אבולוציונית מולקולרית הנקראת גם מגה, משמשת לקביעת התנאים האופטימליים לבחירה לריפוי עמידות למוטגן RNA.

התאים שלנו טופלו בריכוזים הולכים וגדלים של ריבובירין ונדבקו בנגיף קוקס AKI B מסוג פרא כריבוי הדבקה של 0.0 1 48 שעות לאחר ההדבקה. נגיף הצאצאים נקצר וטיטוס נקבעו על ידי TC ID 50. נתון זה מציין את אחוז התאים ששרדו את הטיפול מתחת לציר ה-x שנקבע על ידי צביעה כחולה של 48 שעות לאחר ההדבקה.

התוצאות מראות כי ריכוזים של 100 ו-200 מיקרומולר מפחיתים את הנגיף טיטוס בלוג אחד עד שניים מבלי להשפיע על כדאיות התא. כדי לבחור עבור אוכלוסיות עמידות למוטגן, נגיף הגנגה CHI היה בתאים הילריים בנוכחות פסים אפורים או היעדר פסים שחורים של 50 ריבובירין מיקרו-מולרי בעקבות כל מעבר צאצאי נגיף כומתו על ידי בדיקת פלאק קלאסית על תאי BHK כפי שניתן לראות כאן. ההשפעה המוטגנית ניכרת במהלך המעברים הראשונים שבהם הנגיף המטופל טיטוס ירד בשני לוגים.

בהדרגה חזר טיטוס לרמות נורמליות שלא טופלו. לא נצפו הבדלים משמעותיים בחמש אוכלוסיות שטופלו במוטגן בהשוואה לאוכלוסיות שלא טופלו, מה שמרמז על כך שנבחרו וריאנטים עמידים. ואכן, ריצוף זיהה מוטציות ייחודיות באוכלוסיית הנגיף העוברת טיפול בריבובירין כדי לאשר עמידות רחבה למוטגנים של RNA בעלי מבנה שונה, גרסת הנאמנות הגבוהה A 3 72 V של נגיף COA B 3 שבודדה בתחילה במסך נבדקה לרגישות מופחתת לריכוזים שונים של מוטגנים RNA RIBOVIRIN חמישה פלואורו אורציל חמש אזציטידין.

הוא, התאים שלנו טופלו בריכוזים מצוינים של ריבובירין ונדבקו בנגיף קוקס AKI B שלוש בריבוי הדבקה של 0.0 1 48 שעות לאחר ההדבקה. נגיף הצאצאים נקצר וטיטוס נקבעו על ידי TC ID 50 המוצגים כאן הם הטיטרים מסוג הבר ווריאנט 3 72 כפונקציה של ריכוז המוטגן. 3 72 וולט גבוה באופן עקבי מהסוג הפראי.

בכל התנאים שנבדקו כדי לקבוע את קינטיקת הצמיחה החד-שלבית של ריפוי ייצור הנגיף, התאים שלנו נדבקו בריבוי של זיהום של 10 עם וריאנט נאמנות גבוהה מסוג פראי, A 3 72 V או וריאנט חסר שכפול CX 64 של Cox AKI virus B שלוש בנקודות הזמן הצביעו על כך שצאצאי הנגיף נקצרו מתאים וסופרנטנטים על ידי הפשרה בהקפאה וצוירו על ידי TC ID 50. עליית הנאמנות של 3 72 V אינה עולה בקנה אחד עם פגם שכפול ניכר בתרבית רקמות. השונות CX 64 מציגה עיכוב משמעותי בקינטיקה של השכפול ומגיעה למקסימום טיטוס נמוך פי 1000 מווירוס מסוג בר.

באמצעות הגישה המתוארת בסרטון זה, כל שיבוט שמרוצף מקורו בגנום ייחודי בתוך אוכלוסיית הנגיף הכוללת ולכן נושא מוטציות ייחודיות. איור זה מציג יישור טיפוסי לאחר ניקוי רצפים באיכות ירודה והדמיה של פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים. סך כל הפולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בתוך אוכלוסייה נלקח בחשבון ומספר הפולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים המופיעים על כל שיבוט וצוין.

לדוגמה, השיבוט המסומן בקו תחתון על ידי פס מכיל שתי מוטציות ייחודיות, בעוד שמונה שיבוטים אחרים מכילים מוטציה ייחודית אחת. נתונים אלה משמשים להרכבת טבלה כגון הטבלה המוצגת כאן. הטבלה מציגה את ההתפלגות המדורגת של שיבוטים מרוצפים לפי מספר המוטציות.

השוואה סטטיסטית של ערכים מדורגים יכולה לקבוע אם התפלגות אחת שונה באופן משמעותי מאחרת. לפרשנות קלה יותר, ניתן לייצג את הנתונים המספריים המתקבלים מניתוח רצף וסטטיסטי כתרשים או היסטוגרמה. כפי שמוצג כאן, נגיף A 3 72 V מייצר פחות מוטציות מהסוג הפראי ומציג תדירות מוטציות נמוכה משמעותית עם ערך P של פחות מ-0.01.

אותה אוכלוסיית נגיף גנגה עוף נותנת תדירות מוטציות דומה. בין אם מלאי הנגיף או דילול פי 10 עד פי חמישה משמש למיצוי RNA. אז בעקבות הליך זה, ייתכן שתרצה לבצע מאמרים ביוכימיים במבחנה או מחקרי התגבשות כדי להבין טוב יותר את הבסיס המכניסטי והמבני של נאמנות בגרסה פולימראז זו.

לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה לחקור את המתאם בין מגוון גנטי לכושר הנגיף in vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להגדיל את הסיכויים שלך לבודד גרסאות נאמנות של נגיף RNA וכיצד להשתמש בתדרי מוטציות כדי לזהות את הבדלי הנאמנות הללו.