解剖宿主 - 病毒相互作用模型疱疹病毒裂解性复制

以下实验的总体目标是使用各种病毒学和生化方法来剖析宿主信号通路在模型疱疹病毒裂解复制中的作用。这里作为一个例子，我们研究了线粒体抗病毒信号蛋白 Mavs 在疱疹病毒 γ HV 68 感染过程中的作用。首先检查 Mavs 在急性感染中的作用，野生型和 Mavs 敲除小鼠在急性病毒感染后感染 γ HV 68。

收集小鼠肺并通过噬菌斑测定法测定病毒载量，其中将样品连续稀释并铺板。然后在单层上计算斑块的数量。敲除小鼠中病毒载量的增加表明目标基因起抗病毒作用。

相比之下，敲除小鼠中病毒载量的降低表明该基因是病毒感染所必需的 验证这些发现。在小鼠胚胎成纤维细胞、野生型和 mavs 敲除的小鼠胚胎成纤维细胞中检查体外病毒多步生长动力学，用 γ HV 68 感染并孵育不同时间。然后收集细胞并进行噬菌斑测定以比较野生型细胞和 mavs 缺陷细胞之间的多步生长动力学。

为了进一步验证这些发现，野生型和 mavs 敲除小鼠胚胎成纤维细胞用 γ HV 68 感染。然后从感染细胞中分别提取 DNA 和 RNA，并通过实时 PCR 分析病毒基因组转录本。当我们研究病毒免疫通路在病毒感染期间的作用时，我们首先有了这个方案的想法。

该方案可用于研究其他病原体感染期间宿主信号通路的规则。通过让 6 到 8 周龄的性别匹配的垫料小鼠在发货后 4 天内适应来开始此程序。以下实验将在生物危害设施中进行。

准备时，穿上个人防护设备，包括实验室外套、手套、口罩和在生物安全柜中工作的靴子。第二级。为每只将被感染的小鼠准备含有 40 至 10， 000 PFU 的 γ HV 68 和 30 微升无菌 PBS 的病毒悬液。

腹膜内注射氯胺酮甲苯噻嗪后，将病毒悬浮液保持在冰上。通过执行脚趾捏确保小鼠已镇静。然后用移液管将 30 微升病毒悬浮液滴入左鼻孔或右鼻孔。

将鼠标侧卧 5 到 10 分钟，以促进病毒通过气道输送到肺部。然后将老鼠放回笼子里并监测它们，直到它们从镇静中完全恢复。接下来，从注射的小鼠中收集肺组织，以制备细胞裂解物，用于评估感染后不同天的病毒滴度。

将从处死小鼠收获的肺放入无菌 1.5 毫升螺旋盖管中，该管含有 500 微升 1.0 毫米氧化锆二氧化硅珠，置于冰上。如果没有，请在同一天进行下一步。将样品储存在零下 80 摄氏度。

否则，添加 1 毫升不含冷血清的 DMEM。将试管放入珠子打浆器中，然后按开始以使肺部匀浆 30 秒。避免样品过热，这可能会使病毒失活。

均质化 30 秒后，将试管在冰上冷却至少 1 分钟。然后重复此过程。接下来，将匀浆的组织在 16， 000 RCF 和 4 摄氏度下离心 1 分钟。

旋转后，细胞碎片将位于试管底部，脂质将位于表面。立即如图所示取 snat，以使用 NIH 3、T、3 或 BHK 21 单层进行噬菌斑测定。接下来，进行噬菌斑测定 为了测定样品中存在的病毒滴度，通过连续稀释病毒上清液开始噬菌斑测定。

首先，使用多通道移液器向 96 孔板中加入 270 微升培养基。将第一行留空。然后将 200 微升上清液添加到 96 孔板的第一行中，每个样品一式三份。

接下来，将 30 微升样品从第一行转移到下一行并混合。然后将 30 微升混合物转移到下一行并混合。重复此步骤多次，进行 10 倍连续稀释。

接下来，将稀释的病毒上清液添加到细胞单层上。在 24 孔板中。将板放入培养箱中，在孵育后的 2 小时孵育期间每 30 分钟摇动一次板，以去除细胞碎片，从板中吸出上清液。

然后用新鲜培养基洗涤细胞一次。洗涤后，向细胞中加入含有甲基纤维素的培养基。将细胞孵育 4 至 6 天。

四到六天后。使用显微镜读取每个样品的噬菌斑编号。记录每次稀释的空斑数量。

然后计算平均值和标准差。含有过多或过少噬菌斑的孔不能用于准确计算滴度。因此，对于每个样品，使用有 7 到 70 个噬菌斑的稀释液。

该样品稀释 1000 倍后，每孔平均有 23 个噬菌斑。要计算未稀释溶液中的病毒滴度，请将稀释因子乘以噬菌斑数再乘以一毫升中的微升数。然后将其除以每孔添加的稀释上清液的体积。

所以在这个例子中，1000 乘以 23 个斑块乘以 1000 微升每毫升除以 100 微升等于 2.3 乘以 10 到每毫升的第五个形成单位。接下来，使用具有已知滴度的病毒原液来确定小鼠胚胎成纤维细胞中 γ HV 68 的生长动力学 ORM 首先将野生型神话和宿主基因中缺乏的神话以每孔 10， 000 个细胞的速度分裂到 24 孔板中。第二天，用 0.5 毫升低 MOI γ HV 68 悬浮液替换每个孔中的培养基。

将板放入 37 摄氏度的培养箱中，并在整个孵育过程中让孵育进行两个小时。孵育后每 30 分钟摇动一次板。使用移液器去除病毒悬液，并向病毒感染的细胞中加入 0.5 毫升含有 8% 胎牛血清的新鲜完全 DM EM

在感染后的不同日期将细胞放回培养箱中。通过上下多次吹打来收获培养基终细胞。将它们转移到无菌的 1.5 毫升离心管中，立即在零下 80 摄氏度下冷冻试管，以从 Mets 中释放 γ HV 68。

执行三个冻结和解冻循环。将细胞置于 37 摄氏度处解冻细胞。然后涡旋并将它们放回零下 80 摄氏度的冰箱中。

如前所述，使用 NIH 3、T、3 或 BHK 21 单层通过噬菌斑测定确定病毒滴度，以检查 DNA 或 RNA 复制是否受到宿主基因或病毒基因缺陷的影响。在感染后的不同天从感染的 mes 开始，弃去上清液，用冷 PBS 和胰蛋白酶冰细胞冲洗细胞。然后在离心后，通过在室温下在 1000 RCF 下离心 1 分钟来沉淀细胞，弃去上清液并将细胞储存在零下 80 摄氏度。

提取宿主和病毒来源的总 DNA 和 RNA。然后离心离心柱。使用总 DNA 和病毒裂解转录物特异性引物进行实时 PCR。

确定细胞内 γ HV 68 基因组相对于宿主管家基因（如 β 肌动蛋白）的相对数量。用总 RNA 和寡核苷酸 DT 引物制备 CDNA。如上所述，使用 CD NA 和引物进行实时 PCR，以确定病毒转录物的相对数量。

相对于宿主看家基因，Mavs 是线粒体抗病毒信号传导的缩写，如下所示。Mavs 接头分子传递来自胞质钻机眼样受体的信号传导，以激活 NF κB 和干扰素调节因子 IRF，进而上调促炎细胞因子和干扰素的基因表达。此处显示了 γ HV 感染的野生型小鼠和缺乏 Mavs 的窝交小鼠肺部的病毒载量。

Mavs 的缺乏显着降低了感染后 10 天肺部的病毒载量，表明 Mavs 是体内有效病毒感染所必需的。该图显示了野生型小鼠胚胎成纤维细胞和 Mavs 中缺乏 Mavs 缺乏症的病毒多步生长曲线。小鼠胚胎成纤维细胞上的病毒生长显着延迟，表明 Mavs 是体外有效病毒复制所必需的 γ HV 68 感染的小鼠胚胎成纤维细胞中病毒裂解基因的 mRNA 水平通过实时 PCR 缺陷分析 Mavs 中病毒裂解基因的水平，显着降低三个必需裂解基因的 mRNA 水平。

所有这些结果共同支持以下结论：Mavs 是 γ、HV、68 转录激活和裂解复制所必需的。观看此视频后，您应该对如何在 VO 和 Vevo 中在多个层面询问宿主病原体相互作用有很好的了解。不要忘记，与病原体打交道可能会非常犹豫。

演出进行时应采取预防措施，例如佩戴个人防护装备。