Name: 定量分析和HO -核酸内切酶的形成，刺激单链退火染色体易位酿酒酵母 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 了解HO核酸内切酶诱导双链断裂后通过单链退火形成染色体易位的遗传调控机制。该方法以酿酒酵母为模型，通过半乳糖诱导HO表达，结合菌落计数和Southern印迹分析易位频率，为研究辐射诱导的基因组不稳定性及癌症治疗中的DNA损伤修复提供重要实验基础。

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本工作得到了美国国立卫生研究院和希望之城贝克曼研究所基金的支持。我们感谢审稿人提出的建设性意见，这些意见使稿件更加清晰明了。

1. HO诱导的转位频率
<ol>
	<li>用所需基因型的单菌落接种10-20个独立的1 ml YPGly/Lac培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，3%甘油和3%乳酸）培养液。在30°C下以旋转摇床或轻度振荡培养过夜，或培养足够长时间，使细胞密度达到约5×107-1×108 个细胞/ml。</li>
	<li>向培养物中加入半乳糖，使其终浓度为2%，以诱导HO内切核酸酶在his3-Δ3'（染色体III）和his3-Δ5'（染色体XV）易位底物处产生双链断裂（DSB）。</li>
	<li>在30°C下继续以旋转摇床或轻度振荡培养4小时。</li>
	<li>培养4小时后，将培养物进行适当稀释，涂布于YPD培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）上，使每平板获得约100至200个菌落；同时将足够数量的细胞涂布于不含组氨酸的培养基上，以获得可观察数量的His+重组子菌落。将平板在30°C下培养2至3天。</li>
</ol>
注意： 步骤1.4描述了通过将培养物涂布于缺乏组氨酸的培养基上，在选择性条件下测定易位频率的方法。该检测也可在非选择性条件下进行，即将培养物涂布于YPD培养基上，待菌落生长后，在两到三天后将其复制接种至–His平板上。这两种方法产生的易位频率相似（图2C）。
<ol start="5">
	<li>通过将组氨酸原养型菌落数除以涂布的有活力细胞总数（通过在YPD培养基上涂布稀释液确定），计算易位频率。确定易位频率的中位数及95%置信区间15。</li>
</ol>
2. 铺板效率
<ol>
	<li>从每种过夜培养物中取出一份细胞等分试样，通过血细胞计数板计数（Baxter Healthcare Corporation，目录号：B3178-1）确定细胞数量。</li>
	<li>使用适当稀释度将约100至200个细胞铺板于YPD培养基上。在30°C下孵育两至三天 30°C (例如 对于细胞密度为 1x10⁶ 个/mL 的培养物8 细胞/毫升，应接种 100-200 μl 每块平板接种10-5稀释度的样品。</li>
	<li>向培养物中加入20%半乳糖，使其终浓度为2%。</li>
	<li>4小时后，从每种培养物中取出一份细胞等分试样，用血细胞计数板计数确定细胞数量，并根据适当稀释度将约100至200个细胞涂布于YPD培养基上。在 30°C.</li>
	<li>通过将YPD平板上出现的菌落数除以铺板的细胞数，再将所得商乘以100，计算铺板效率。计算中位百分比及其95%置信区间。 </li>
</ol>
3. 基因组Southern印迹分析
<ol>
	<li>从每次独立实验中选择一个 His+ 重组克隆，并制备基因组 DNA16。</li>
	<li>用 BamHI 限制性内切酶消化约 4 μg 的 DNA。</li>
	<li>在 0.7% 琼脂糖凝胶上分离经 BamHI 消化的片段，并转移至带正电荷的尼龙膜（Hybond N+，GE Healthcare，产品编号：RPN303B）17。</li>
	<li>使用随机引物法标记的 32P 探针进行杂交（Amersham Biosciences，产品编号：RPN1604），该探针来源于包含 HIS3 基因的 1.8 kb BamHI/BamHI 基因组克隆。</li>
	<li>通过自显影或磷屏成像技术显影 DNA 片段。</li>
</ol>
4. 使用脉冲电场凝胶电泳（CHEF）分离染色体进行染色体印迹分析：
<ol>
	<li>从选定的His+重组子中制备染色体（置于琼脂糖小块中）18：
		<ul>
			<li>将含有His+候选tXV::III染色体的重组子接种于5 ml YPD液体培养基中，培养至细胞密度约为1-2 × 108 个细胞/ml。</li>
			<li>离心收集细胞，并用50 mM EDTA洗涤两次。</li>
			<li>将细胞重悬于约200 μl的50 mM EDTA中，置于50°C预热。</li>
			<li>加入等体积已熔化的2%（w/v）低熔点琼脂糖（预热至50°C），充分混匀。</li>
			<li>将约80 μl混合液分装至胶塞模具中，于4°C冷却30分钟。</li>
			<li>将凝固的胶塞从模具中推出，放入12孔板中，每孔最多可放置5个胶塞。</li>
			<li>向每孔中加入3 ml新配制的原生质体制备液（14 mM 2-β-巯基乙醇，20 mM EDTA，0.5 mg/ml Zymolyase 20T，10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 M山梨醇），37°C轻柔振荡孵育4小时。</li>
			<li>移除原生质体制备液，每孔加入3 ml LDS溶液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，100 mM EDTA，1%（w/v）十二烷基硫酸锂，调节pH至8.0），37°C轻柔振荡孵育15分钟。</li>
			<li>移除LDS溶液，更换为另一份3 ml LDS溶液，37°C轻柔振荡过夜孵育。</li>
			<li>移除LDS溶液，每孔加入3 ml 0.2 X NDS溶液（0.6 g Tris碱，93 g二水合乙二胺四乙酸二钠，5 g N-月桂酰肌氨酸，用dH2O定容至500 ml，调节pH至8.0），室温轻柔振荡洗涤30分钟，移除NDS溶液后重复洗涤两次。</li>
			<li>移除NDS溶液，每孔加入3 ml TE缓冲液，室温轻柔振荡洗涤30分钟，共重复4次。</li>
			<li>将胶塞置于2 ml TE缓冲液中，4°C保存；胶塞可保存长达一年。</li>
		</ul>
	</li>
	<li>使用Bio-Rad CHEF-DRII电泳系统（目录号：170-3612），在14°C条件下，通过1%琼脂糖凝胶分离染色体。</li>
</ol>
参数： 1st 阻断：70秒转换时间，6 V/cm 条件下持续15小时。 
2nd 阻断：120秒切换时间，11小时，6 V/cm
<ol start="3">
	<li>用 1μg/ml 溴化乙锭染色 30 分钟，在 UV Stratalinker（Stratagene）中以 60 mJ 紫外光照射，然后在 dH2O 中脱色 30 分钟，以观察染色体。对经溴化乙锭染色的染色体进行紫外照射可使 DNA 产生切口，从而促进其向膜的高效转移。</li>
	<li>在变性条件（0.4N NaOH，1.5M NaCl）下，通过毛细作用将染色体转移至带正电荷的膜（Hybond N+，GE Healthcare，产品编号：RPN303B）。</li>
	<li>使用随机引物法标记的 32P 探针进行杂交（Amersham Biosciences，产品编号：RPN1604），该探针为包含 HIS3 基因的 1.8 kb BamHI/BamHI 基因组克隆17。</li>
	<li>通过放射自显影或磷屏成像观察染色体。</li>
</ol>
5. 典型结果：
转座实验的染色体水平图示如图1所示。图2A展示了实验流程的示意图。诱导前和诱导后的涂板效率均通过将培养物中可形成菌落的活细胞总数除以血细胞计数板测定的细胞总数来确定（图4B）。野生型细胞在诱导前后的涂板效率之间无显著差异（p值= 0.1400）（表1）。
<img src="/files/ftp_upload/3150/3150table1.jpg" alt="细胞培养存活率数据表，包含诱导前/后细胞数量、活细胞数及铺板效率等指标" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 1"> 
表 1. 野生型细胞诱导前与诱导后的铺板效率。
a 每毫升中的细胞体数量通过血细胞计数板计数确定。 
b 每毫升中的活细胞数量通过将适当稀释的样品涂布于非选择性培养基上，形成约100–200个菌落来确定。 
c 诱导前和诱导后的涂布效率通过将培养物中活的、能形成菌落的细胞总数除以血细胞计数板测定的细胞体总数来确定。
这表明任一易位染色体的存在或缺失均不影响细胞在双链断裂（DSB）形成后存活的能力。染色体易位的频率可通过将组氨酸原养型菌落数除以在YPD培养基上涂布测定的活细胞总数来计算。图2B）。该实验可使用不同基因型的菌株进行，以确定蛋白功能的缺失如何影响SSA（即 rad51Δ-/-）。随后可将不同菌株中确定的重组频率绘制成图，以比较这些菌株通过单链退火（SSA）修复HO内切酶诱导的双链断裂（DSBs）能力的差异。图 2C). 野生型二倍体菌株在选择性条件下获得的易位频率（2.2×10⁻⁶）-2）和非选择性（2.17×10-2) 条件之间无统计学差异（p值=0.9131），而选择性获得的易位频率（6.0x10-2）以及非选择性（11.9×10-2）与 rad51Δ-/- 纯合子相似但具有统计学差异（p值=0.0089）。通过选择性（p值=0.0001）和非选择性（p值=0.0002）获得的频率 rad51°-/- 纯合子在相应条件下所得结果与野生型菌株相比具有统计学差异。 
可通过基因组 Southern 印迹和染色体印迹分析进一步检测推测含有易位的克隆（图 3）。进行 Southern 分析时，基因组 DNA 先用 BamHI 限制性内切酶消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳、转膜，并与 32P 标记的 1.8 kb HIS3 探针杂交，以检测特征性的 0.8 kb his3Δ200、1.7 kb his3-Δ3'、4 kb tIII::XV、5 kb tXV::III 和 8 kb his3-Δ5' 片段（图 3B.1）。完整染色体可通过 CHEF 方法分离（图 3B.2），转至尼龙膜后，用 32P 标记的 1.8 kb HIS3 探针杂交，以检测 1.1 Mb 的完整染色体 XV、0.8 Mb 的 tXV:III 易位染色体、0.6 Mb 的 tIII:XV 易位染色体以及 0.3 Mb 的完整染色体 III（图 3B.3）。图中还展示了经 BamHI 内切酶消化后预期的基因组 DNA 片段、亲本染色体及重组染色体的示意图（图 3A）。
<img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig1.jpg" alt="显示HIS3整合与缺失过程的基因编辑示意图，包含箭头和符号。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 通过单链退火（SSA）形成易位染色体。 1) 在培养物中加入半乳糖后，HO内切酶在his3-Δ3'和his3-Δ5'底物（分别为第XV号和第III号染色体）处产生双链断裂（DSB）。2) DSB被加工处理，在断裂染色体末端生成3'单链。3) SSA机制使两个重组底物上形成的互补的311或60个核苷酸长的HIS3单链序列退火。退火后形成的非同源尾部通过内切酶消化被切除。HO内切酶消化后剩余染色体片段上形成的互补四碱基突出端也可能发生退火。4) 连接反应最终完成完整的HIS3基因以及tXV::III易位染色体的形成。携带该染色体的细胞可通过其在缺乏组氨酸的培养基上生长的能力进行筛选。连接过程还可能通过类似NHEJ的机制生成相应的tIII::XV易位染色体。
<img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig2.jpg" alt="酵母重组频率方法：包含方程和条形图的示意图，展示实验设置与结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 通过 SSA 测定易位频率的实验方法。 A) 将特定基因型的单菌落接种至 1 ml YPGly/Lac 培养基中，培养至适当密度，约为 5×107–1×108 个细胞/ml。加入半乳糖至终浓度为 2%，以在 III 号和 XV 号染色体上的重组底物处诱导产生双链断裂（DSB）。为在选择性条件下进行检测，需进行适当稀释，使约 100 至 200 个细胞被涂布于 YPD 培养基上，同时将足够数量的细胞涂布于缺乏组氨酸的培养基上，以获得可观察数量的 His+ 重组子菌落。若在非选择性条件下进行检测，则将约 100 至 200 个细胞涂布于 YPD 培养基上，培养两至三天至形成单菌落，随后通过影印法转移至缺乏组氨酸的培养基上。B) 易位频率可通过将 –His 平板上生长的菌落数除以 YPD 平板上生长的菌落比例来计算。C) 可将不同基因型菌株（i.e. 野生型和 rad51Δ-/-）的易位频率绘制成图，以比较这些菌株通过 SSA 修复 DSB 的能力差异。
<img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig3.jpg" alt="酵母培养物稀释过程；血细胞计数板计数；涂板效率公式；示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 确定涂板效率。 （A）在诱导DNA双链断裂（DSB）前和诱导后，从过夜培养物中取细胞等分试样，进行适当稀释，随后通过血细胞计数板计数，以确定每毫升培养物中的总细胞数量。将适当稀释的样品涂布于非选择性培养基上，通过计数YPD平板上出现的菌落，确定每毫升培养物中的活细胞总数。（B）涂板效率通过将活细胞总数除以总细胞数量，再将所得商乘以100来计算。
<img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig4.jpg" alt="染色体重排示意图、凝胶电泳结果；遗传重组分析，HIS3 位点。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 通过基因组 Southern 印迹和染色体印迹分析检测染色体易位事件。 
A) 易位形成前（左）和形成后（右）相关染色体的图示。 
亲本和重组染色体的大小以兆碱基对（Mb）列出。由 BamHI 消化亲本和重组菌株基因组 DNA 后产生的、含有相关序列的限制性片段大小，通过与 1.8 kb BamHI HIS3 基因组克隆探针杂交在印迹上显示，以千碱基对（kb）列出。染色体未按比例绘制。 
B) 潜在携带易位克隆的物理分析。 
(1) 基因组 Southern 印迹分析——收集基因组 DNA，用 BamHI 限制性内切酶消化，通过凝胶电泳分离，转至尼龙膜，并与 32P 标记的 1.8 kb HIS3 探针杂交，以检测以下片段：0.8 kb his3Δ200、1.7 kb his3-Δ3'、4 kb tIII::XV、5 kb tXV::III 和 8 kb his3-Δ5'。泳道：a) 亲本二倍体，b) His+ 非相互易位重组子，c) His+ 相互易位重组子。 
(2) CHEF 凝胶——将完整染色体制备于琼脂糖小块中，通过 CHEF 分离，用溴化乙锭染色并在紫外光下观察。泳道：同上。 
(3) 染色体印迹——分离的染色体被转至尼龙膜，并与 32P 标记的 1.8 kb HIS3 探针杂交，以检测以下染色体：1.1 Mb 完整的染色体 XV、0.8 Mb tXV:III 易位染色体、0.6 Mb tIII:XV 易位染色体和 0.3 Mb 完整的染色体 III。泳道：同上。

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<li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+radiation-induced+chromosomal+aberrations+in+tumor+patients+after+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiation+Oncology+Biol.+Phys%22%5BJournal%5D)">Time-course of radiation-induced chromosomal aberrations in tumor patients after radiotherapy.</a> Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 63, 1214-1220 (2005).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

高剂量的电离辐射会因产生大量DNA双链断裂（DSBs）而固有地导致基因组不稳定性19。真核生物基因组中含有丰富的重复序列，这些序列极易作为底物引发易位及其他类型的基因组重排20,21。当在重复序列之间引入DNA双链断裂时，常可通过同源重组（HR）机制观察到染色体易位的发生12,21,22。大量证据表明，白血病和淋巴瘤相关的大部分基因组不稳定性可归因于染色体易位，这凸显了阐明该机制在真核生物中发生过程的重要性22,23。我们已在芽殖酵母中建立了一个系统，用于研究由不同染色体上短同源区域之间的DSB诱导同源重组所导致的易位染色体形成，这些同源区域的长度与广泛分布于酵母和人类基因组中的重复元件相似。
在该检测中，his3-Δ3' 转座底物位于一条XV号染色体上。另一个 his3 等位基因（his3-Δ200）在其 HIS3 启动子和编码序列区域存在约1 kb的缺失，从而阻止该序列被用作修复的模板24。 his3-Δ5' 底物位于一条III号染色体的 LEU2 位点，而另一条III号染色体则含有一个未改变的 LEU2 等位基因（图1）。一个带有 KAN-MX 标记的半乳糖诱导型HO内切酶表达盒被插入到IV号染色体的 TRP1 位点（trp1::GAL-HO-KAN-MX）。每个转座底物的两侧均含有HO内切酶识别序列，通过向培养基中添加半乳糖以诱导 HO 基因的表达，可靶向切割这些序列。当HO内切酶在 his3-Δ3' 和 his3-Δ5' 底物处诱导产生双链断裂后，细胞可高效利用两者之间共享的短片段 HIS3 同源序列（311 bp 或 60 bp）通过同源重组（HR）修复断裂的染色体，从而生成一条带有完整 HIS3 等位基因的易位染色体12-14,25。
由于亲本细胞缺乏完整的HIS3基因拷贝，因此无法在缺乏组氨酸（–His）的培养基上生长。只有发生染色体易位事件的细胞才能在不含组氨酸的培养基上被筛选出来。因此，染色体易位的频率可通过将组氨酸原养型菌落数量除以铺板的总活细胞数（通过YPD培养基计数确定）来计算。随后可从代表性His+菌落中提取基因组DNA和完整染色体，并通过基因组Southern印迹和染色体印迹分析验证易位染色体的存在。
细致的分析使我们获得了有关该检测方法的更多重要信息12。基因组Southern印迹分析表明，在HO内切酶诱导30分钟后，染色体XV和III几乎被完全切割，因此在细胞群体中不存在显著的未切割染色体底物背景（G. Manthey &amp; A. Bailis，未发表结果）。对His-存活细胞的基因组Southern印迹和染色体印迹分析显示，细胞经常丢失一条、另一条或两条被切割的染色体，但仍保持存活能力（L. Liddell &amp; A. Bailis，未发表结果）。重要的是，在HO内切酶表达诱导前后，细胞在非选择性培养基上的铺板效率几乎相当，这表明无法修复断裂染色体或无法保留易位染色体均不影响细胞在双链断裂形成后的存活能力。与此一致的是，tXV:III易位染色体在无选择压力的有丝分裂细胞中已被证明是不稳定的。这一现象通过以下实验得以证实：将含有tXV::III的His+重组子在非选择性条件下过夜培养，将单菌落接种至非选择性平板，再通过影印接种法转移至缺乏组氨酸的选择性培养基上。在这些平板上生长的菌落中，有10%至70%已丢失tXV::III易位染色体（N. Pannunzio &amp; A. Bailis，未发表结果）。
人类暴露于电离辐射（IR）后产生的易位染色体表现出类似的不稳定性26。这表明，易位的形成可能通过促进杂合性缺失，参与肿瘤发生早期事件。其次，大量遗传学和分子分析表明，单链退火（SSA）是一种高效且必然为非保守型的同源重组（HR）机制，是两条染色体上同时产生双链断裂（DSB）后，通过HR介导形成染色体易位的主要机制12,27,28。这一结论与以下发现一致：大剂量电离辐射可在酵母基因组中多个重复序列附近产生足够密度的DSB，从而导致通过HR途径高频形成染色体易位。综上所述，这些观察结果提示，电离辐射对人类的致癌效应在一定程度上可能源于通过一种高效的HR机制修复DSB，该过程产生的易位因其固有的不稳定性，进一步促进遗传改变，启动肿瘤发生。由于放射治疗常用于癌症治疗，由辐射诱导的DSB修复所导致的基因组重排可能有助于解释患者中频繁出现的继发性癌症。因此，该模型可能有助于我们更深入理解电离辐射治疗中重要临床反应的遗传与分子基础。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;img src=&quot;/files/ftp_upload/3150/3150materials.jpg&quot; alt=&quot;材料&quot;/&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

通过单链退火法在saccharomyces cerevisiae中定量与分析ho内切酶诱导的染色体易位的形成

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

基因变异通常由基因组重排介导，而基因组重排源于存在于所有真核生物基因组中的分散重复元件之间的相互作用。这一过程是产生生物个体间及个体内部多样性的关键机制1-3。人类基因组中约有40%的序列属于起源于逆转座子的重复序列，其中包括多种LINE和SINE元件4。这些重复元件之间的交换事件可导致基因组重排，包括易位，从而破坏基因剂量和表达，引发自身免疫性疾病和心血管疾病5，以及人类癌症6-9。
重复元件之间的交换以多种方式进行。具有完全（或近乎完全）同源性的序列之间的交换通过一种称为同源重组（HR）的过程发生。相比之下，非同源末端连接（NHEJ）在交换过程中使用很少甚至不使用序列同源性10,11。在有丝分裂细胞中，同源重组的主要功能是修复由异常DNA复制和氧化性损伤内源性产生的双链断裂（DSBs），或由电离辐射（IR）及其他外源性DNA损伤剂暴露所导致的双链断裂。
在本实验中，通过半乳糖诱导的HO内切酶（图1），在二倍体细胞的两个不同染色体位点上的重组底物侧翼同时产生双链断裂（DSBs）。断裂染色体的修复通过单链退火（SSA）机制引发染色体易位，该过程是在同源序列退火后，将位于染色体末端附近的同源序列共价连接起来。其中一个底物his3-Δ3'包含一个3'端截短的HIS3等位基因，位于一条XV号染色体上的天然HIS3位点。另一个底物his3-Δ5'位于一条III号染色体的LEU2位点，包含一个5'端截短的HIS3等位基因。两个底物的两侧均含有一段HO内切酶识别位点，可被HO内切酶靶向切割。在所有菌株中，位于两条III号染色体上MAT位点的天然HO内切酶识别位点已被删除，以防止重组底物与其他断裂的染色体末端发生相互作用而干扰实验结果。KAN-MX标记的半乳糖诱导型HO内切酶表达盒被插入到IV号染色体的TRP1位点。这两个底物共享一段311 bp或60 bp的HIS3编码序列，可被同源重组（HR）机制用于SSA修复。利用这些底物通过HR修复断裂染色体的细胞将形成完整的HIS3等位基因以及tXV::III染色体易位，这类细胞可通过其在缺乏组氨酸的培养基上生长的能力进行筛选（图2A）。HR介导的易位频率通过将选择性培养基上出现的组氨酸原养型菌落数量除以非选择性培养基上适当稀释后形成的总活细胞数来计算（图2B）。已有多种DNA修复突变体利用该系统研究SSA介导的染色体易位形成的遗传调控机制12-14。

HO诱导的转位检测法可监测二倍体Saccharomyces cerevisiae多个位点发生DNA双链断裂后发生的单链退火过程。该机制可用于模拟高等真核生物体细胞在暴露于高剂量电离辐射后发生的基因组重排。

通过单链退火法在Saccharomyces cerevisiae中定量与分析HO内切酶诱导的染色体易位的形成

遗传变异通常由基因组重排介导，这种重排源于每个基因组中广泛分布的重复元件之间的相互作用。

本实验的总体目标是通过单链跪曲（kneeling）在二倍体出芽酵母细胞中确定易位形成过程中的遗传调控机制。首先，用特定基因型的单个菌落接种培养物，并过夜培养。实验的第二步是通过向培养物中添加半乳糖，利用 HO 内切酶在两条染色体上同时诱导产生双链断裂。接下来将这些培养物进行系列稀释，并涂布于选择性与非选择性培养基上。最后一步是通过计数选择性与非选择性培养基上形成的菌落，确定易位频率。最终可获得结果，显示单链在不同基因型菌株中通过改变热激诱导的易位形成频率，对易位形成具有遗传调控作用。该技术的意义延伸至癌症患者接受治疗性辐射暴露后的后果，因为DNA双链断裂和易位形成是该治疗的主要后果。开始进行确定HO诱导的易位频率的操作时，用目标基因型的单菌落接种10至20个独立的1毫升YPD甘油乳酸培养基培养物，在30°C下于旋转摇床上过夜培养。当培养物达到所需细胞密度时，向培养物中加入20%半乳糖，使其终浓度为2%。半乳糖将诱导HO内切酶的表达，该酶会在3号染色体上的his3δ5′等位基因和15号染色体上的his3δ3′等位基因处引发双链断裂，在30°C下于旋转摇床上继续孵育4小时。下一步对于实验的成功至关重要。必须仔细进行培养物的稀释与涂布。若要获得足够可重复的移位频率，以便在不同基因型菌株之间进行具有统计学意义的比较，则在培养四小时后，应将适当稀释度的培养物分别涂布于不含组氨酸的培养基以及YPD培养基上，每皿约100至200个菌落，于30°C培养两至三天。当菌落形成后，可确定易位频率。通过比较内切酶 ho 表达诱导前后菌落的形成效率，可判断任一易位染色体的存在或缺失是否影响细胞在双链断裂（DSB）形成后的存活能力。为确定诱导前的菌落形成效率，需对 3 号染色体和 15 号染色体的各一个拷贝进行片段化处理。首先，从每种过夜培养物中取出一份等分试样，通过血细胞计数板计数确定细胞数量。接着，使用适当的稀释倍数，将约100至200个细胞涂布于YPD培养基上，在30°C下培养两至三天，直至菌落出现。向剩余的培养物中加入20%的半乳糖，使其终浓度为2%，并在30°C下继续孵育4小时，以测定诱导后的涂布效率。诱导四小时后，从每种培养物中取出一份细胞等分试样，使用血细胞计数板计数，通过适当稀释后在YPD平板上计数约100至200个细胞，于30°C培养两至三天，直至菌落出现。一旦平板上出现菌落，即可确定涂布效率。可通过Southern印迹分析携带假定易位的克隆。该实验流程采用从每次独立实验中获得的一个hiss阳性重组菌落中提取的基因组DNA，分别取约四微克每种DNA样本，用BAM H I限制性内切酶进行消化，将BAM H I消化后的片段在0.7%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，随后转移至带正电荷的尼龙膜上，使用通过随机引物法标记的P 32探针进行杂交，该探针来源于含有HIS3基因的1.8千碱基BAM H I基因组克隆。通过放射自显影或磷屏成像技术检测DNA片段。另一种分析潜在易位阳性克隆的方法是染色体印迹分析。首先从所选的hiss阳性重组子中制备染色体，将染色体在1% aros凝胶中通过脉冲场凝胶电泳（CHEF）于14摄氏度下进行分离。使用的电泳参数如下：第一阶段，14摄氏度，脉冲时间为72秒，6伏特/厘米，持续15小时；第二阶段，14摄氏度，脉冲时间为122秒，6伏特/厘米，持续11小时。电泳完成后，将凝胶用AUM溴化物染色30分钟，随后用紫外光照射，并用蒸馏水漂洗。通过毛细作用将染色体转移至带正电荷的膜上。在变性条件下，使用通过随机引物法标记的 P 32 探针进行杂交，该探针来源于包含 hiss 基因的 1.8 千碱基 bam H 一至 bam H 一片段的基因组克隆。通过自显影或磷屏成像技术观察染色体。染色体易位频率可通过将组胺光营养型菌落的数量除以在 YPD 培养基上涂布测定的活细胞总数来计算。在此示例中，计算得到的重组频率约为 3%。可通过使用不同基因型的菌株进行检测，以比较其通过单链修复双链断裂的能力差异。如本代表性图表所示，无论是在诱导前还是诱导后涂布条件下，RAD51Δ 纯合缺失突变株在选择性和非选择性条件下获得的易位频率，均与野生型菌株相应条件下的结果存在统计学上的显著差异。效率通过将培养物中可形成菌落的活细胞总数除以血细胞计数板计数确定的细胞总数来计算，如本表中诱导前后涂板结果所示。野生型细胞的效率差异无统计学意义，表明任一易位染色体的存在或缺失均不影响细胞在双链断裂形成过程中的存活能力。可通过基因组Southern印迹分析来检测携带易位的克隆。此处展示了易位形成前后相关染色体的图示。通过BAM H I消化亲本和重组菌株的基因组DNA，并利用1.8 kb的BAM H I片段作为探针进行杂交，可在印迹上显示相应序列的限制性片段大小。他的三个基因组克隆以千碱基对列出，用于Southern印迹分析。基因组DNA用BMH I限制性内切酶消化，并与32P标记的1.8千碱基HIS三个探针杂交，以显示这些诊断性片段。0.8 千碱基 HIS 三 delta 201.7 千碱基 hiss 三 delta 三端 4 千碱基 T 3 15 5 千碱碱 T 15 三和 8 千碱基 hiss 三 delta 五端片段。泳道 A 为亲本二倍体。泳道 B 为 hiss 阳性非交互易位重组子，泳道 C 为 his 阳性交互易位重组子。重组染色体BLO分析也可用于检测携带易位的克隆。将制备于琼脂糖小块中的完整染色体通过CHEF电泳分离，并用铱溴化物染色后在紫外光下观察。分离后的染色体被转印至尼龙膜，并与32P标记的1.8千碱基片段进行杂交。他使用三种探针来可视化1.1兆碱基完整的15号染色体、15.8兆碱基的T15三号染色体易位染色体、0.6兆碱基的T三15易位染色体以及0.3兆碱基完整的三号染色体。A泳道为亲本型展开图，B泳道为his加非相互易位重组型，C泳道为his加相互易位重组型。观看本视频后，您应能充分理解如何测定多次 ho 诱导的双链断裂后易位形成的频率。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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