定量分析和HO -核酸内切酶的形成，刺激单链退火染色体易位酿酒酵母

该程序的总体目标是确定二倍体出芽酵母细胞中单链跪姿形成易位形成的遗传控制。这是通过首先用特定基因型的单个菌落接种培养物并在过夜内培养来实现的。该程序的第二步是通过向培养物中添加半乳糖，通过两条染色体上的 ho 核酸内切酶诱导同时形成双链断裂。

接下来将这些培养物的稀释液接种在选择性和非选择性培养基上。最后一步是通过计数在选择性和非选择性培养基上出现的菌落来确定易位频率。最终，可以获得显示单链易位形成的遗传控制的结果，即通过跪下改变 ho 刺激不同基因型菌株的易位形成。

该技术的含义延伸到癌症患者治疗性辐射暴露的后果，因为 DNA 双链断裂和易位形成是这种治疗的主要后果 治疗。为了开始确定 ho 刺激的易位频率的程序，接种 10 至 20 个独立的 1 毫升 Y 峰甘油乳酸培养基培养物与所需基因型的单个菌落，将培养物在 30 摄氏度下在旋转器上孵育过夜。当培养物达到所需的细胞密度时，向培养物中加入 20% 半乳糖至最终浓度为 2%半乳糖将诱导核酸内切酶的表达，它将在 3 号染色体上的历史 delta 5 原始等位基因处指导双链断裂，并在 15 号染色体上具有 3 个 delta 3 原始等位基因，在 30 摄氏度下在旋转器上孵育 4 小时。

下一步对于手术的成功至关重要。必须对培养物进行仔细稀释和铺板。如果您要获得具有足够可重复性的易位频率，以允许在不同基因型的菌株之间进行统计学意义比较：4 小时后，将培养物适当稀释到缺乏组氨酸的培养基以及 YPD td 上，每个板大约 100 至 200 个菌落，在 30 摄氏度下孵育板 2 至 3 天。

当菌落出现时，可以确定易位频率。诱导 ho 核酸内切酶表达前后的接种效率将表明任一易位染色体的存在与否是否影响在 DSB 形成后存活的能力。这会将 3 号染色体和 15 号染色体的一个拷贝片段化，以确定诱导前接种效率。

首先，从每个过夜培养物中取出等分试样的细胞，并通过用血细胞仪计数来确定细胞数量。接下来，使用适当的稀释度将大约 100 到 200 个细胞接种到 YPD 上，在 30 摄氏度下孵育 2 到 3 天，直到出现菌落。将 20% 半乳糖添加到剩余的培养物中，至终浓度为 2%，并在 30 摄氏度下孵育 4 小时，以确定诱导接种后的效率。

诱导 4 小时后，从每种培养物中取出等分试样细胞，并通过血细胞计数器测定细胞数量，使用适当稀释度计数板大约 100 至 200 个细胞，在 YPD 上，在 30 摄氏度下孵育 2 至 3 天，直到出现菌落。一旦板上出现菌落，就可以确定接种效率。推定的易位携带克隆可以通过 Southern 印迹进行检查。

该程序使用由单个嘶嘶声和来自每个独立试验的重组菌落制备的基因组 DNA，每个 DNA 样品中大约 4 微克，其中 BAM H 一种限制性核酸内切酶，在 0.7%aros she 上分离 BAM H，一个消化片段，然后转移到带正电荷的尼龙膜上，该膜与 P 32 标记探针杂交，通过与 1.8 KILOBASE BMH 1 BMH 1 基因组克隆随机引发获得，含有 HIS三个基因。通过自动 X 线照相或磷酸化成像观察 DNA 片段。另一种检查推定易位携带克隆的方法是通过染色体图分析。

染色体首先由 aros 栓中的选定 hiss 加上重组体制备，在 1% aros 凝胶上分离染色体，在 14 摄氏度的轮廓夹均匀电场或 chef 中。以下参数用于第一个块 14 摄氏度、第 72 个开关时间和 6 伏厘米的 15 小时，第二个块，14 摄氏度，第 122 个开关时间和 11 小时，每厘米 6 伏。电泳完成后，用 AUM 溴化物对凝胶染色 30 分钟，然后用紫外线照射并通过毛细管作用将滞留和蒸馏水转移到带正电的膜上，从而使染色体可视化。

变性条件与P 32标记的探针杂交，该探针是通过用含有嘶嘶声的1.8 kb bam H one bam H one基因组克隆随机引发获得的。三个基因通过自动 X 线照相或磷酸成像可视化染色体。染色体易位的频率可以通过将组胺光养菌落的数量除以通过铺板到 YPD 确定的活细胞总数来计算。

在这个例子中，计算的重组频率约为 3%可以使用不同基因型的菌株进行 ho 刺激的易位频率的测定，以比较单链修复双链断裂能力的差异。跪着，如此代表性图表所示。使用 RAD 51 delta 无效纯合子选择性和非选择性获得的易位频率与使用野生型菌株在诱导前和诱导后接种的相应条件下获得的易位频率在统计学上不同。

效率的确定方法是将活菌落形成细胞的总数除以由血细胞计数器计数确定的培养物中的细胞体总数，如下表所示：诱导接种前后。野生型细胞的效率没有显著差异，这表明任一易位染色体的存在与否都不会影响生存能力。DSB 形成。

推定的易位携带克隆可以通过基因组 Southern 印迹分析进行检查。此处显示了易位形成前后相关染色体的图形表示。含有相关序列的限制性片段的大小，这些序列由 BAM H 对来自亲本和重组菌株的基因组 DNA 进行一次消化，并通过与 1.8 kb BAM H 杂交在印迹上显示。

他的三个基因组克隆以千碱基对列出，用于 Southern 印迹分析。基因组 DNA 用 BMH 一种核酸内切酶消化，并与 P 32 标记的 1.8 kb 杂交。HIS 三个探针来可视化这些诊断片段。

0.8 千克碱基 HIS 三个 delta 201.7 千克碱基 希斯 三个 delta 三 素数 4 千克碱基 T 3 15 5 千克碱基 T 15 三和八千克碱基 希斯 三个 delta 五 素数片段。泳道 A 是父二倍体。泳道 B 是 hiss 加非互易易位重组体，泳道 C 是 his 加往易位。

重组染色体 BLO 分析也可用于检查易位携带的克隆。在 aros 栓中制备的完整染色体通过 Chef 电泳分离，凝胶用溴化铱染色并在紫外光下观察。然后将分离的染色体印迹到尼龙上，并与标记的 1.8 kb 的 P 32 杂交。

他的三个探针可视化了 1.1 兆碱基完整染色体 15.8 兆碱基 T 15 三个易位染色体 0.6 兆碱基 T 三个 15 个易位染色体和 0.3 兆碱基完整染色体 3。泳道 A 是部署的父级。泳道 B 是 A his plus 非互易易位重组体，泳道 C 是 his plus 互易易位重组体。

看完这个视频后，你应该对如何确定多次 ho 刺激的双链断裂后易位形成的频率有一个很好的了解。