Name: 使用基于 GFP 的报告系统分析 HEK-293T 细胞中的非同源末端连接和同源重组效率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学习利用基于GFP的报告系统在HEK-293T细胞中定量分析非同源末端连接和同源重组修复效率的实验方法。该技术通过流式细胞术快速评估DNA双链断裂修复机制，为研究基因组稳定性提供可靠工具。

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本研究由黑龙江省自然科学基金（YQ2022C036）和齐齐哈尔医学院研究生创新基金（QYYCX2022-06）资助。图1使用MedPeer制作。

1. 质粒提取
<ol>
	<li>按照标准转化方案20，将感受态E. coli转化以下质粒：EJ5-GFP、DR-GFP、pCBASceI（表达I-SceI的质粒）和PCI2-HA-mCherry（表达mCherry的质粒）（见材料表）。 
	注意：PCI2-HA-mCherry可用其他表达mCherry或DsRed的质粒替代。</li>
	<li>将转化后的E. coli在500 mL液体LB培养基中培养，添加100 µg/mL氨苄青霉素，于37 °C振荡过夜。</li>
	<li>按照生产商说明书，使用市售的无内毒素大提质粒提取试剂盒分离质粒（见材料表）。</li>
	<li>使用纳米微量分光光度计测定质粒浓度，并将质粒浓度调整至1 µg/µL。</li>
</ol>
2. 细胞准备与转染
<ol>
	<li>在添加了10%胎牛血清的DMEM培养基中培养HEK-293T细胞。确保HEK-293T细胞或已建立的HEK-293T稳定细胞处于良好的生长状态。 
	注意：冻存细胞在转染前应至少传代两次。</li>
	<li>转染前一天，将HEK-293T细胞以每孔2 × 105个细胞的密度接种于6孔板中，使次日细胞融合度约为60%。</li>
	<li>转染当天，确认细胞融合度约为60%。进行NHEJ检测时，在6孔板中使用商用转染试剂（遵循制造商说明，参见材料表），向实验样本细胞共转染1 µg EJ5-GFP质粒、1 µg pCBASceI质粒和1 µg PCI2-HA-mCherry质粒。进行HR检测时，将EJ5-GFP质粒替换为DR-GFP质粒。</li>
	<li>为FACS校准设置对照：留一孔细胞不进行转染，作为阴性对照；另取6孔板中的细胞，分别转染以下组合之一作为单色对照：(1) 1 µg EJ5-GFP（用于NHEJ检测）或1 µg DR-GFP（用于HR检测），同时加入1 µg pCBASceI，作为GFP单色对照；或(2) 1 µg PCI2-HA-mCherry，作为mCherry单色对照。</li>
</ol>
3. 通过流式细胞术分析GFP阳性与mCherry阳性细胞
<ol>
	<li>转染后两天，使用荧光显微镜确认 GFP 和 mCherry 蛋白的表达。</li>
	<li>转染后三天，从孔中移除培养基，用 PBS 洗涤一次，每孔加入 500 µL 胰蛋白酶。在 37 °C 下孵育 5 分钟，使所有细胞从培养板上脱落。在此步骤及后续步骤中，均需避免细胞暴露于直射光线下。</li>
	<li>每孔加入 500 µL 完全 DMEM 培养基，重悬细胞，确保无可见细胞团块。</li>
	<li>将每孔中的全部细胞转移至 1.5 mL 离心管中，于室温下以 1000 × g 离心 2 分钟。</li>
	<li>小心用移液器吸除上清液，并用 1.0 mL PBS 洗涤一次。</li>
	<li>再次小心用移液器吸除上清液，将细胞重悬于 500 µL PBS 中，转移至流式细胞术检测管中（见材料表）。 
	注意：为获得最佳结果，建议在收获细胞后立即进行流式细胞术分析。若需延迟，细胞可在冰上保存数小时。</li>
	<li>使用未转染的细胞（阴性对照）、EJ5-GFP/DR-GFP 细胞、pCBASceI 转染细胞（GFP 单色对照）以及 mCherry 转染细胞（mCherry 单色对照）对流式细胞仪进行校准。调节电压和补偿参数，以最小化 GFP 与 mCherry 之间的荧光溢出。</li>
	<li>从每根管中采集并记录至少 10,000 个完整细胞。</li>
</ol>
4. 数据分析
注意：以下步骤使用 FlowJo 软件（参见材料表）分析 FACS 数据。类似的操作也可在其他分析软件中进行。
<ol>
	<li>将所有 FACS 文件拖入仪表盘。双击其中一个文件以显示 FSC/SSC 图。</li>
	<li>创建一个多边形门以选择完整细胞，排除左下角的碎片。将此亚群命名为 &#34;Intact Cells&#34;，并将该门拖至 &#34;All Samples&#34; 栏。使用 Next Sample 按钮逐一样本滚动，确保每个样本的设门恰当（图 2A）。</li>
	<li>双击阴性对照样本（未转染细胞）的 Intact Cells 亚群以打开新图。将坐标轴更改为 FL1-H（x 轴，GFP）和 FL2-H（y 轴，mCherry）。</li>
	<li>选择 Quad Gating 工具，点击阴性细胞群的右上极端区域（图 2B）。将四个矩形门拖至 &#34;Intact Cells&#34; 栏。使用 Next Sample 按钮滚动查看 GFP 单色对照或 mCherry 单色对照样本，确保设门适当，以区分 GFP 阳性或 mCherry 阳性细胞与阴性对照细胞（图 2C,D）。如有必要，微调象限设门，并将此设门应用于所有 &#34;Intact Cells&#34; 亚群。</li>
	<li>点击 Layout Editor。右键单击代表性图谱，选择 Copy to Layout Editor。选中所有代表性图谱后，双击打开 Graph Definition。根据需要调整坐标轴标签、注释和图例。</li>
	<li>实验样本中 mCherry 阳性细胞的百分比作为转染效率的对照。通过比较同一图谱中 GFP 阳性细胞数量与 mCherry 阳性细胞数量，计算相对 DNA 修复效率。</li>
</ol>

FACS Analysis of GFP and mCherry Reporter Cells to Evaluate NHEJ & HR Efficiency

<ol><li>Huang, R., Zhou, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+repair%3A+historical+perspectives%2C+mechanistic+pathways+and+clinical+translation+for+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).</li>
<li>Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhomologous+DNA+end-joining+for+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).</li>
<li>Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+and+the+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).</li>
<li>Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC3+promotes+homology-directed+repair+of+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells.</a> Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).</li>
<li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative-NHEJ+Is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).</li>
<li>Zuo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alternative+end-joining+in+HNSC+cell+lines+using+DNA+Double-strand+break+reporter+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays.</a> Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).</li>
<li>Schrank, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+ARP2%2F3+drives+DNA+break+clustering+for+homology-directed+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair.</a> Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).</li>
<li>Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+promotes+chromatin+decondensation+to+facilitate+initiation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response.</a> Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hCINAP+regulates+the+DNA-damage+response+and+mediates+the+resistance+of+acute+myelocytic+leukemia+cells+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy.</a> Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WASH+interacts+with+Ku+to+regulate+DNA+double-stranded+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair.</a> iScience. 25 (1), 103676(2022).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+RIG-I+and+XRCC4+connects+DNA+repair+with+RIG-I+immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling.</a> Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).</li>
<li>Watkins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+complexity+profiling+reveals+that+HORMAD1+overexpression+contributes+to+homologous+recombination+deficiency+in+triple-negative+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers.</a> Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP44+regulates+irradiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+and+suppresses+tumorigenesis+in+nasopharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma.</a> Nat Commun. 13 (1), 501(2022).</li>
<li>Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+double-strand+break+%28DSB%29+repair+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells.</a> JoVE. (43), e2002(2010).</li>
<li>Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakanishi%2C+K+%22DNA+recombination%3A+Methods+and+Protocols%22">DNA recombination: Methods and Protocols</a>. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).</li>
<li>Cavallo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+proficiency+in+homologous+recombination+underlies+the+high+sensitivity+of+embryonal+carcinoma+testicular+germ+cell+tumors+to+cisplatin+and+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition.</a> PLoS One. 7 (12), e51563(2012).</li>
<li>Unfried, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+NIHCOLE+promotes+ligation+efficiency+of+DNA+double-strand+breaks+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).</li>
<li>Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCavallo%2C+F+%22Testicular+Germ+Cell+Tumors%3A+Methods+and+Protocols%22">Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols</a>. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hanahan+method+for+preparation+and+transformation+of+competent+Escherichia+coli%3A+high-efficiency+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).</li>
<li>Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+steps+of+mammalian+homologous+repair+with+distinct+mutagenic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences.</a> Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).</li>
</ol>

不存在需要披露的利益冲突。

本文所述方法已在多篇论文中用于评估NHEJ效率和HR效率9,10,11,12,13,14,16,17,18,19。该方法适用于阐明DNA双链断裂（DSB）修复的潜在机制，并鉴定与NHEJ和HR相关的新因子。例如，通过应用这种染色体外方法，已揭示或验证了DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）9、coilin相互作用核ATP酶蛋白（hCINAP）10、WASH11、维甲酸诱导基因I（RIG-I）12、X射线修复交叉互补蛋白4（XRCC4）12、含HORMA结构域蛋白1（HORMAD1）13、泛素特异性蛋白酶44（USP44）14以及lncRNA NIHCOLE（在肝细胞癌中诱导表达并在连接效率中发挥促癌作用的非编码RNA）在NHEJ或HR中的功能。与染色体整合方法相比，这种染色体外方法能够利用已建立的稳定细胞系快速分析NHEJ或HR效率。
我们及其他研究者先前已在HEK-293T细胞中使用过染色体外NHEJ和HR检测方法10,11,12，其他多个研究团队也在多种细胞系中应用了该方法，包括U2OS细胞16,17、胚胎癌细胞17,19、HCT116细胞9、SUM159细胞13、HCC1143细胞13、MDA-MB-436细胞13、SUNE1细胞14、Huh7细胞18以及JHH6细胞18。本文方案详细描述了在HEK-293T细胞中进行的NHEJ和HR检测。鉴于HEK-293细胞具有较高的转染效率，对于培养于6孔板中的HEK-293T细胞，联合使用1 µg EJ5-GFP或1 µg DR-GFP与1 µg pCBASceI被认为已足够。然而，在HEK-293T以外的其他细胞系中，转染条件可能有所不同9,16,17，研究者需仔细确定实现成功转染的具体条件。
在转染前达到所需的细胞汇合度是本实验方案中的关键步骤。细胞数量过少或过多都会显著影响转染效率。细胞数量不足会加剧转染后的细胞毒性，从而妨碍对DNA双链断裂（DSB）修复的准确评估。此外，在同一实验中应使用相同配比的质粒与转染试剂，因为EJ5-GFP/DR-GFP、pCBASceI、PCI2-HA-mCherry以及转染试剂的混合比例若存在偏差，可能会对实验结果产生影响。
除了NHEJ和HR外，交替性末端连接（a-EJ）和单链退火（SSA）也被确认为修复DNA双链断裂（DSB）的其他机制。然而，在野生型细胞中，NHEJ和HR是DSB修复的主要通路，而a-EJ和SSA仅起次要作用。值得注意的是，利用EJ5-GFP质粒进行的NHEJ检测实验可同时检测NHEJ和a-EJ事件，因此可视为总NHEJ（包括NHEJ和a-EJ）的检测方法5。通过将EJ5-GFP替换为EJ2-GFP，即可简单实现对a-EJ的独立分析18。类似地，通过将断裂的GFP报告系统替换为hprtSAGFP，也可开展相应的实验以分析SSA的修复效率21。

DNA双链断裂（DSB）是最具危害性的DNA损伤形式，若未及时修复，可能导致基因组不稳定、染色体重排、细胞衰老以及细胞死亡1。目前公认有两种有效的修复通路可应对DNA双链断裂，即非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）2,3。HR被认为是一种无错误的DSB修复机制，利用姐妹染色单体上的同源序列作为模板，恢复受损DNA分子的原始结构3。而NHEJ则是一种易错的DSB修复通路，它在无需模板的情况下直接连接断裂的DNA末端2。
NHEJ检测和HR检测是经典的实验方法，最初由纪念斯隆-凯特琳癌症中心Jasin实验室开发，分别用于定量分析NHEJ和HR的修复效率4,5,6,7。这些检测方法在研究与NHEJ和HR相关的机制及影响因素方面发挥着关键作用8,9,10,11,12,13,14。这两种检测均依赖于两个断裂的GFP报告系统——EJ5-GFP和DR-GFP，用以监测由I-SceI内切酶诱导的DNA双链断裂（DSB）的修复情况。其中，EJ5-GFP报告系统用于NHEJ检测，而DR-GFP报告系统则用于HR检测。每个报告系统均经过精细设计，使得I-SceI诱导产生的DNA双链断裂只能通过特定的修复途径修复，从而恢复GFP表达盒的功能4,5。
NHEJ检测和HR检测可采用染色体整合或染色体外方法进行15,16。染色体整合方法需要将断裂的GFP报告系统整合到基因组中，从而可在染色体环境中分析DSB修复过程6,15。然而，该方法需要长时间的细胞传代，且由于整合位点随机，除细胞系本身的固有差异外，还会引入额外的混杂因素，因此不适用于涉及多个细胞系的比较研究。在本实验方案中，我们描述了染色体外NHEJ检测和HR检测方法，即通过将断裂的GFP报告质粒和I-SceI质粒瞬时转染至HEK-293T细胞，随后进行流式细胞术分析（实验流程见图1）。这些非整合型报告系统最初由Jasin实验室报道，用于研究DNA链间交联修复16，并已被多个实验室用于评估NHEJ效率和HR效率9,10,11,12,13,14,17,18,19，包括我们实验室11。这些染色体外方法便于在涉及多个已建立的稳定细胞系的比较研究中分析DSB修复。

<table><tbody><tr><td>6 cm 培养皿&amp;nbsp;</td><td>BBI</td><td>F611202-9001</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Beyotime</td><td>ST007</td><td>工作浓度：100 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; 感受态细胞</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>DR-GFP</td><td>Addgene</td><td>26475</td><td></td></tr><tr><td>EJ5-GFP</td><td>Addgene</td><td>44026</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi 质粒&amp;nbsp;提取试剂盒</td><td>TIANGEN</td><td>DP117</td><td>可使用其他无内毒素质粒提取试剂盒</td></tr><tr><td>FACS 管</td><td>FALCON</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>CLARK</td><td>FB25015</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V.10.1</td><td>Treestar</td><td></td><td>可使用其他分析软件</td></tr><tr><td>HEK-293T 细胞</td><td>国家实验细胞资源共享平台</td><td>1101HUM-PUMC000091</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td>可使用其他转染试剂</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL601A</td><td></td></tr><tr><td>pCBASceI</td><td>Addgene</td><td>26477</td><td>表达 I-SceI 的质粒</td></tr><tr><td>PCI2-HA-mCherry</td><td></td><td></td><td>可使用含有 DsRed 的其他质粒</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

利用基于gfp的报告系统分析hek-293t细胞中非同源末端连接和同源重组效率

Analysis of Nonhomologous End Joining and Homologous Recombination Efficiency in HEK-293T Cells Using GFP-Based Reporter Systems

DNA 双链断裂（DSBs）是最危险的 DNA 损伤形式，可导致大量遗传信息丢失并引发细胞死亡。为应对此类损伤，细胞主要采用两种修复机制：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。分别定量 NHEJ 和 HR 的修复效率，对于研究各自相关的机制和影响因素至关重要。NHEJ 检测和 HR 检测是用于测量这两种修复通路效率的成熟方法。这些方法依赖于精心设计的质粒，其中包含一个被破坏的绿色荧光蛋白（GFP）基因，并含有可被内切酶 I-SceI 识别的位点，从而诱导 DSB 的产生。本文描述了染色体外的 NHEJ 检测和 HR 检测方法，该方法涉及将 EJ5-GFP/DR-GFP 质粒、表达 I-SceI 的质粒以及表达 mCherry 的质粒共同转染至 HEK-293T 细胞中。通过流式细胞术计数 GFP 阳性细胞与 mCherry 阳性细胞的比例，即可获得 NHEJ 和 HR 效率的定量结果。与染色体整合型检测方法相比，这种染色体外检测方法更适用于对多个已建立的稳定细胞系进行比较研究。

为确保非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）分析的准确性，必须进行适当的补偿调节并采用合理的设门策略。通常情况下，使用530 nm滤光片时，mCherry荧光不会出现在GFP检测通道中。然而，当细胞中GFP表达水平极高时，使用575 nm滤光片可能导致GFP荧光信号渗入mCherry检测通道。为解决这一问题，实验中使用了阴性对照、GFP单色对照和mCherry单色对照样本进行补偿调节，并优化设门策略。对照细胞的典型流式细胞术结果如图2所示。补偿调节和设门策略应使大多数GFP阳性细胞位于右下象限（图2C），而大多数mCherry阳性细胞位于左上象限（图2D）。
最终的代表性结果图见图3A、B。在I-SceI诱导产生DNA双链断裂（DSB）后，成功的修复事件将重建GFP基因。因此，GFP阳性细胞所占百分比反映了DNA双链断裂修复效率和转染效率。而mCherry阳性细胞的百分比仅反映转染效率。DNA双链断裂修复的相对效率可通过GFP阳性细胞与mCherry阳性细胞的比值来计算（图3C）。
WASH蛋白在DNA修复中作用的NHEJ检测实例分析 图 4. 在本示例中，我们进行了NHEJ检测，以评估shControl细胞和shWASH细胞的NHEJ效率（图4显然，WASH 的缺失导致 NHEJ 效率降低，证实了 WASH 在促进 NHEJ 效率方面的作用，该结论由 NHEJ 检测实验确定。
<img alt="细胞转染过程；质粒插入；流式细胞术分析；GFP、mCherry表达。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：NHEJ/HR检测实验流程示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术图谱；细胞分析，FSC-H 与 SSC-H，GFP 与 mCherry；群体设门方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：流式细胞术分析的设门策略。 （A）对完整细胞进行 FSC-H/SSC-H 设门。（B）未转染的 HEK-293T 细胞用作阴性对照，以排除自发荧光细胞。（C）转染 EJ5-GFP 和 pCBASceI 质粒的 HEK-293T 细胞用于设定 GFP 阳性细胞的门控。（D）转染 mCherry 质粒的 HEK-293T 细胞用于设定 mCherry 阳性细胞的门控。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术图A和B显示GFP与mCherry表达；C包含计算公式。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：典型结果。（A）代表性图示，展示NHEJ分析结果。（B）代表性图示，展示HR分析结果。（C）计算方法的模型示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析、GFP-mCherry 散点图、NHEJ 效率比较、柱状图结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：WASH 促进 NHEJ 效率。（A）代表性图示展示在 shControl 细胞和 shWASH 细胞中 NHEJ 效率的分析结果。（B）shControl 与 shWASH 细胞之间 NHEJ 效率比较的代表性统计结果。数据以均值 ± 标准差表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了一种用于定量HEK-293T细胞中非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）效率的染色体外非同源末端连接（NHEJ）检测方法和同源重组（HR）检测方法。

利用基于GFP的报告系统分析HEK-293T细胞中非同源末端连接和同源重组效率

DNA双链断裂（DSBs）是最危险的DNA损伤类型，可导致大量遗传信息丢失和细胞死亡。在……

双链断裂是最具破坏性的DNA损伤类型。针对此类损伤，细胞主要采用两种修复机制：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。分别定量NHEJ和HR的修复效率，对于研究与这两种机制相关的分子通路及调控因素至关重要。NHEJ检测和HR检测是用于评估NHEJ与HR修复效率的成熟实验方法。这些方法依赖于精心设计的质粒，质粒中包含带有核酸酶识别位点的断裂型荧光报告基因，可诱导双链断裂（DSBs）的发生。非同源末端连接（NHEJ）检测和同源重组（HR）检测可采用染色体整合或结构性染色体方法进行。染色体整合方法能够在染色体环境中分析DNA双链断裂（DSB）的修复情况。然而，染色体整合方法需要长时间的细胞传代，因此不适用于涉及多种细胞系的比较研究。在本实验方案中，我们描述了非染色体整合的NHEJ和HR检测方法，该方法涉及将断裂的GFP和ISEC1质粒转染至HK2和N3T细胞，随后进行流式细胞术分析。这种非整合型报告系统已被包括我们实验室在内的多个研究团队用于评估NHEJ效率和HR效率。与染色体整合方法相比，这种非染色体整合方法能够利用已建立的稳定细胞系，快速分析NHEJ或HR效率。首先，在添加了10%胎牛血清的DMEM培养基中培养HEK 293T细胞。转染前一天，将HEK 293T细胞接种于六孔板中，使次日细胞融合度达到约60%。随后，使用 commercial transfection kit 在六孔板中对实验样本细胞转染用于NHEJ或HR检测的质粒。进行传真校准对照时，留出一孔未转染的细胞作为阴性对照。使用编码 GFP 的质粒、单色对照质粒或 mCherry 单色对照质粒，在六孔板中转染细胞。首先转染 HEK 293T 细胞。转染后三天，从孔中移除培养基，并用 PBS 洗涤一次。每孔加入 500 µL 胰蛋白酶。在 37 °C 下孵育 5 分钟，使所有细胞从培养板上脱落。然后，向每个孔中加入 500 µL 完全 DMEM 培养基，重悬细胞。将每个孔中的所有细胞转移至 1.5 mL 离心管中。随后，在室温下以 1000 ×g 离心 2 分钟。用移液器小心吸去上清液，并用一毫升 PBS 洗涤沉淀一次。再次小心吸去上清液，将细胞重悬于 500 微升 PBS 中。将细胞转移至流式管中。使用流式细胞仪检测细胞。加载未转染的细胞悬液。在流式细胞术工作表上，按下“获取”按钮，并调节前向散射和侧向散射电压。为了将细胞定位在中间区域，围绕此群体 R1 设门，以排除左下象限中的碎片。调整 FL1 和 FL2 的门，将 G 设为 R1。选择四象限设门工具，并点击 FL1、FL2 图中细胞群体的右上极端区域。将印迹设为G等于R1。调节FL1和FL2电压，使细胞位于左下象限。按下暂停并中止。然后，加载GFP单色对照细胞。按下采集按钮，并调节补偿参数，使GFP阳性细胞位于右下象限。然后按下暂停并中止。接下来，加载mCherry单色对照细胞。按下“获取”按钮，并调节补偿，使mCherry阳性细胞位于左上象限。按下“暂停”并中止。点击菜单栏上的“获取”，然后选择“采集与存储”。在采集条件中，选择当计数到 10,000 个 G1 等于 R1 的事件时停止采集。取消勾选设置项。加载待测细胞样品。按下采集按钮，等待直至计数达到10,000个G1期细胞等于R1细胞。对其他样本和对照组重复相同操作。开始分析时，将所有fax文件导入分析仪表板。打开其中一个文件以查看前向散射-侧向散射图。构建一个多边形门以圈选完整细胞，避开图中左下角的碎片区域。将该亚群标记为完整细胞，并将此门拖动至所有样本栏。使用下一个样本按钮验证每个样本的设门。双击阴性对照样本中的完整细胞亚群以调出新图。调整图的坐标轴，将 FL1-H 设为横轴以代表 GFP，将 FL2-H 设为纵轴以代表 mCherry。接下来，选择四象限门控工具，点击阴性细胞群的右上极端。将四个矩形门拖动至完整细胞条带处。使用下一个样本按钮，依次检查每个GFP或mCherry单色对照样本，以确认门控正确。进入布局编辑器。在此处选择具有代表性的图谱，然后选择复制到布局编辑器。选中所有具有代表性的图谱。然后，双击打开图表定义。将 x 轴标签命名为 GFP，y 轴标签命名为 mCherry。通过比较同一图中 GFP 阳性细胞数量与 mCherry 阳性细胞数量，确定相对 DNA 修复效率。采用适当的补偿调节和设门策略，以确保NHEJ和HR分析的准确性。该策略将GFP阳性细胞定位在右下象限，mCherry阳性细胞定位在左上象限。GFP阳性细胞的百分比反映了DNA双链断裂修复效率和转染效率。相反，mCherry 阳性细胞的百分比仅反映转染效率。DNA 双链断裂（DSB）修复效率通过计算 GFP 阳性细胞与 mCherry 阳性细胞的比值来确定。此外，通过在 shControl 和 shWASH 细胞上进行 NHEJ 检测，验证了 Wiskott-Aldrich 综合征蛋白及其同源蛋白 SCAR 或 WASH 蛋白在 DNA 修复中的作用。WASH的缺失降低了NHEJ效率，凸显其在促进NHEJ过程中的作用。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用基于 GFP 的报告系统分析 HEK-293T 细胞中的非同源末端连接和同源重组效率

哺乳动物细胞中DNA双链断裂（DSB）修复的分析

我们提供一种方法，通过RNA干扰技术耗尽细胞内源性的BRCA1蛋白，并用含有编码改变的BRCA1点突变体进行替代，在基于组织培养的体系中检测BRCA1变异体在DNA损伤同源重组修复中的功能。...

利用表达内源性野生型 BRCA1 的细胞鉴定 BRCA1 突变对同源重组的影响

HO诱导的转位检测法可监测二倍体Saccharomyces...

通过单链退火法在Saccharomyces cerevisiae中定量与分析HO内切酶诱导的染色体易位的形成

本方案概述了一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统，用于修复哺乳动物细胞中的点突变。在此，我们采用组合式基因编辑方法，并结合详细的后续实验策略，以检测靶位点处的插入缺失（indel）形成情况——实质上是对靶位点的诱变效应进行分析。...

一种检测人细胞中CRISPR/Cas9与单链寡脱氧核苷酸介导的定点突变修复所致原位诱变性的标准方法

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。...

通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

本文介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀的关键步骤。这些实验方案常用于研究与DNA损伤相关的细胞过程，并用于可视化及定量分析参与DNA修复的蛋白质的募集情况。...

可视化与定量内切酶介导的位点特异性DNA损伤

本文介绍了一种sgRNA/CAS9核酸酶与下一代测序的实验方案，可用于鉴定与CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变。...

利用下一代测序技术鉴定与Cas9诱导的CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变

本方案描述了一种微型基因报告基因检测方法，用于监测5´剪接位点突变对剪接的影响，并开发了用于挽救突变所致剪接抑制的抑制性U1 snRNA。将报告基因和抑制性U1...

基于报告基因的细胞检测法用于监测剪接效率

我们介绍了利用基于发光的染色体外报告底物体系来评估细胞中双链断裂修复通路功能完整性的实验方案。...

基于高通量定量发光报告系统的DNA双链断裂修复活性评估

本文介绍一种用于固定哺乳动物细胞中聚（ADP-核糖）（PAR）富集灶的细胞水平可视化、亚细胞定位及定量分析的方法。该检测方法可对暴露于基因毒素的细胞核内由DNA损伤诱导的PARP激活位点进行定量分析，包括与碱基切除修复或单链断裂修复相关的激活位点。...

利用基于荧光融合蛋白的报告系统对细胞中基因毒素诱导的PARP1/PARP2激活进行可视化与定量分析

学习利用基于GFP的报告系统在HEK-293T细胞中定量分析非同源末端连接和同源重组修复效率的实验方法。该技术通过流式细胞术快速评估DNA双链断裂修复机制，为研究基因组稳定性提供可靠工具。

利用基于GFP的报告系统分析HEK-293T细胞中非同源末端连接和同源重组效率

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