使用基于 GFP 的报告系统分析 HEK-293T 细胞中的非同源末端连接和同源重组效率

DNA 双链断裂代表最危险的 DNA 损伤。作为回应，细胞采用两种主要的 DNA 双链断裂修复机制，即 NHEJ 和 HR。分别量化 NHEJ 和 HR 的效率对于探索与之相关的机制和因素至关重要。NHEJ 测定和 HR 测定是用于测量 NHEJ 和 HR 效率的既定方法。这些方法依赖于精心设计的质粒，这些质粒包含被破坏的绿色荧光蛋白基因，该基因具有用于诱导DSBs的核酸内切酶I-SceI的识别位点。

NHEJ 测定和 HR 测定可以使用染色体整合或染色体外方法进行。染色体整合方法能够在染色体竞争中分析 DSB 修复。然而，染色体整合方法需要延长细胞时间，不适合涉及多个细胞系的比较研究。

在该协议中，我们描述了染色体外NHEJ和HR测定，涉及将破坏的GFP和I-SceI质粒瞬时转染到HEK-293T细胞中以及随后的流式细胞术分析。包括我们的实验室在内的几个实验室已采用这些非整合报告基因检测来评估 NHEJ 效率和 HR 效率。与染色体整合方法相比，这种染色体外方法能够利用已建立的稳定细胞系来快速分析 NHEJ 或 HR 效率。