监测RNA结构平衡的变动情况"过氧化"和"氧化"羟基自由基足

以下实验的总体目标是确定 RNA 分子如何利用羟基自由基足迹折叠。这是通过末端标记、凝胶纯化和 RNA 的预折叠来实现的，这确保了在镁介导的折叠之前确认 RNA 的完整性作为下一步，将 Fenton 试剂混合以产生羟基自由基，随后可以根据其溶剂可及性切割 RNA 骨架。接下来，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 RNA 切割产物，并通过自动射线照相观察。

带积分通过半自动足迹分析软件进行量化。最终目标是产生反映 RNA 三级结构形成的折叠等温线。这是通过将归一化带积分缩放到分数饱和来实现的。

等温线随后可以拟合到 hill 方程中。羟基足迹的主要优点是您可以使用廉价的化学品获得 RNA 的三级结构信息，因为在小尺寸羟基自由基中具有较高的活性，是区分溶剂可接近和埋藏核苷酸的完美探针。这种方法可以帮助回答 RNA 结构生物学领域的关键问题。

例如，核糖体如何利用金属离子来实现其活性确认？羟基自由基足迹可用于了解 RNA 特异性和识别的基本原理。除了揭示有关 RNA 三级结构的信息外，该方法还可用于确定 RNA 或 DNA 分子中的精确蛋白质结合位点。

该方法的主要挑战是防止核糖核酸酶降解样品并优化铁浓度以获得适量的 RNA 切割。此外，频段间隔的详细分析可能非常棘手。本视频的主要好处是帮助观众了解羟基自由基足迹实验的计划阶段和成功执行在本方案开始之前，按照书面方案中的说明准备试剂中的所有足迹。

在本视频中，可以产生 DFO 四个相关和末端标记的 RNA，如图所示。使用变性凝胶电泳纯化放射性标记的 RNA。使用 0.3 摩尔乙酸钠通过随后的两次凝胶提取来回收纯化的 RNA。

然后通过将 0.5 mL 水溶液与 1 mL 乙醇混合来沉淀 RNA。将混合物在干冰上孵育 1 分钟离心样品后，丢弃 supinates。用 70% 乙醇洗涤 RNA 沉淀。

额外离心后去除腌芽液，并在真空中干燥沉淀。接下来，溶解纯化的 P 32 标记的 RNA 样品。在 330 μL 一次性反应缓冲液中，将 30 μL RNA 溶液移液到新的反应管中。

用乙醇沉淀 RNA，然后在真空中干燥沉淀干燥，该沉淀可用于生成参考分子量标准，如书面程序中所述，通过在 95 摄氏度下加热 2 分钟来自然剩余的缓冲 RNA 溶液。将样品加热至室温 15 分钟，然后快速旋转，使冷凝物恢复为溶液。要开始足迹实验，请设置 27 个反应管，用于填充足够的样品来填充 30 孔电泳凝胶。

在包括分子量标准和裂解对照后，确定最终的镁铁浓度，以便它们在对数刻度上均匀分布几个数量级，在滴定中点制备镁离子在一倍反应缓冲液中分别在文中描述。将 RNA 和镁离子溶液在 50 摄氏度下孵育 5 分钟。然后将 10 微升 RNA 溶液与 90 微升相应量的镁铁溶液混合。

要达到 100 微升的最终体积，请将每种混合物在 50 摄氏度下孵育 30 分钟。随后让溶液在 25 摄氏度下平衡 1 小时，同时发生 RNA 折叠。同时，在反应中开始羟基自由基足迹之前，按照书面方案中的说明制备幻影反应混合物。

通过在含有 RNA 溶液的反应管内的顶部吸取两微升铁、EDTA、抗坏血酸钠和过氧化氢滴来制备过氧化反应，以便液滴不接触。通过剧烈混合开始足迹反应。15 秒后，加入 300 μL 纯冷乙醇终止反应。

转动管子 3 到 5 次。最后，如前所述沉淀、洗涤和干燥沉淀，作为全氧化反应的替代方案，氧化羟基反应将通过向样品中加入 5 微升新鲜制备的 Fenton 反应混合物来进行。在 30 摄氏度下孵育氧化反应 25 分钟。

然后加入 300 微升纯冷乙醇淬灭反应并通过转动试管混合。再一次，沉淀。在完成全氧化或氧化反应后清洗并干燥沉淀。

将干燥的 RNA 沉淀溶解在 8 微升凝胶上样染料 2 中。使用 geer 计数器确认 P 32 标记的 RNA 重悬，根据标准方案制备变性 8% 聚丙烯酰胺测序凝胶。使用 30 孔梳加载样品，包括两个参比和一个裂解对照。

以 60 至 75 瓦的功率分离 RNA 片段 2 个半小时。将干燥的凝胶暴露在储存的磷酸化筛网中过夜。使用成像系统扫描磷酸化屏幕，进行无胶片自动 X 线摄影。

然后将凝胶图像文件传输到计算机进行分析。要开始数据分析，请打开 Safa 和开源软件进行单波段拟合和定量。将 RNA 序列加载为点 TXT 文件，然后将凝胶图片加载为点状凝胶文件。

定义通道并调整频段强度。然后选择一个锚点泳道并执行条带到核苷酸的凝胶对齐分配，参考 RNA T one 消化梯。量化谱带强度，并使用归一化斜杠颜色图功能对潜在不变的残基进行归一化和分配。

将输出另存为 txt 文件。SFA 输出一个电子表格，其中包含表示凝胶上泳道的列和代表对应于 RNA 片段的单个条带积分的行。首先，必须通过将无镁离子样品得出的保护曲线与终点镁离子浓度曲线进行比较，来确定溶剂可及性发生显著变化的保护位点。

该值越低，核苷酸对羟基自由基攻击的保护就越好，反之亦然。接下来，使用电子表格格式创建条带、单个或一组核苷酸的强度与镁铁浓度的过渡曲线，将这些过渡单独缩放到分数饱和函数，如本协议的文本部分所述。最后一步，将数据拟合到 hill 方程中。

该分析缩放到分数饱和度的过渡，确定过渡中点，并提供过渡是否显示为 S 形的现象学测试。以下是 P 4 P 6 RRNA 羟基自由基足迹实验的代表性结果。等温线来自通过 Safa 分析的测序凝胶，然后按照分析部分所述进行拟合。

凝胶图像表明背景切割最小，并且由于 T one 泳道中明确定义的条带，因此可以进行单核苷酸分配。羟基自由基诱导的 RNA 片段化远高于背景。从低镁离子到高镁离子的转变选择性地与指示 RNA 形成的单个和组条带强度的降低有关。

三级结构保护是指单个或一组连续核苷酸，其切割随着条带强度的变化而通过 Saffer 分析进行定量和归一化。输出是一个热图，显示了对羟基自由基的保护程度。颜色过渡描述了添加镁铁后的可及性变化，白色到红色表示更容易接近的核苷酸，而白色到蓝色表示更多受保护的核苷酸。

每个阴影度数都与一个数值相关联，该值可以绘制为保护曲线，并通过 hill 方程等绑定模型进行分析。在此示例中，隶属于保护 1 5 3 到 1 5 5 的平衡解离常数大约是保护 1 6 3 到 1 6 4 的相应值的两倍。如果执行得当，这个羟基自由基足迹实验可以在一天半内完成。

在尝试此过程时，请务必记住戴上手套和实验室外套，以避免任何 RNA 污染。此外，最终的铁浓度取决于实验系统。因此，我们建议在遵循此程序进行足迹采集前进行剂量反应实验。

可以执行其他方法，例如时间分辨羟基自由基足迹，以回答其他问题。例如，RNA 分子在发育后在什么关键时间点达到错误折叠或活性确认？这项技术为结构生物学领域的研究人员探索核酸的分子间和中期分子三级相互作用铺平了道路。

看完这个视频，你应该对如何确定 RNA 分子的三级结构形成有了很好的了解。不要忘记 caate 和 phosphorous stage two 是危险的预防措施，例如在执行此程序时建议戴手套和护目镜，以及使用有机玻璃屏蔽。