Name: 监测RNA结构平衡的变动情况过氧化和氧化羟基自由基足 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: 学习利用羟基自由基足迹法分析RNA三级结构的形成过程。该方法通过末端标记、凝胶纯化和Fenton试剂产生羟基自由基，实现RNA折叠等温线的定量测定，为RNA结构生物学研究提供重要技术手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到了美国国立卫生研究院RO1-GM085130基金和美国国家科学基金会MCB0929394基金的资助。我们感谢Marion Schmidt博士提供的热情接待，并允许我们在她的实验室进行拍摄。

1. 足迹试剂的制备
<ol>
	<li>配制10倍反应缓冲液，包含100 mM 二甲胂酸钠、1 mM EDTA 和 1 M KCl，调节pH至7.4。使用0.2 μM醋酸纤维滤器（Nalgene）过滤缓冲液。注意：切勿将RNA直接加入10倍缓冲液中。</li>
	<li>按照表1所示，为每个反应配制滴定反应混合液。在加入10 μl RNA（溶于1倍缓冲液）之前，滴定混合液体积（1倍缓冲液和所需浓度的Mg(II)）应为90 μl。</li>
	<li>配制RNA酶T1消化缓冲液，包含6.63 M尿素、20 mM柠檬酸钠、1 mM EDTA、0.25 μg/μl tRNA、0.025% 二甲苯青蓝和0.025% 溴酚蓝。该缓冲液可在4 °C保存最多6个月。</li>
	<li>Fenton反应需要新鲜配制的水溶液，包括250 mM Fe(NH4)2(SO4)2、250 mM EDTA 和 500 mM L-抗坏血酸钠。第1.5节中注明的浓度适用于在不淬灭自由基的缓冲液（如二甲胂酸钠缓冲液）中进行的平衡实验，并适用于多种二价离子浓度条件。</li>
	<li>用于过氧化（1.5.1）和氧化（1.5.2）足迹反应的试剂。
	<ol>
		<li>过氧化Fenton反应需要新鲜配制的水溶液：100 mM Fe-EDTA溶液、50 mM L-抗坏血酸钠和1.5% H2O2。Fe-EDTA溶液通过将Fe(NH4)2(SO4)2与EDTA混合制备，使EDTA摩尔量比铁过量1.1倍。</li>
		<li>在启动氧化切割反应（3.4.2）前，立即配制Fenton反应混合液：将2 μl Fe(NH4)2(SO4)2（250 mM）、2.2 μl EDTA（250 mM）、62.5 μl L-抗坏血酸钠（500 mM）、22.5 μl 10倍反应缓冲液和135.5 μl H2O混合，使足迹反应体系（3.4.2）中终浓度分别为0.10 mM、0.11 mM和6.61 mM。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 足迹分析实验的 RNA 制备
<ol>
	<li>RNA 可通过 DNA 模板的标准体外转录6产生，或者如果长度短于 50 个核苷酸，也可直接购买（例如 Integrated DNA Technologies，www.idtdna.com）。在进行足迹实验期间，应遵循推荐的实验室清洁程序，以保持 RNA 样品的完整性。7</li>
	<li>在对 RNA 的 5' 端进行 32P 标记之前，必须对体外转录的 RNA 进行去磷酸化处理8。使用激酶反应对 10 pmol RNA 进行末端标记9。磷酸酶成功失活后，溶液应呈现浑浊状态。</li>
	<li>使用变性凝胶电泳纯化放射性标记的 RNA。通过两轮连续的凝胶提取法，使用 0.3 M 醋酸钠（pH 5.5）回收 RNA。将 0.5 ml 水溶液与 1 ml 乙醇混合后，在干冰上孵育 1 分钟以沉淀 RNA。在 4 °C、12500 rpm 条件下离心 0.5 小时。弃去上清液，并用 70% 乙醇洗涤 RNA 沉淀。再次离心后弃去上清液，并在真空下干燥沉淀。</li>
	<li>将 32P 标记的 RNA 样品溶解于 330 µl 的 1× 缓冲液中。取 30 µl RNA 溶液加入反应管中，用乙醇沉淀并在真空中干燥；保留此管用于生成参考梯度（步骤 3.5）。将缓冲液中的 RNA 溶液在 95 °C 加热 2 分钟以使其变性。随后将样品在室温下冷却 15 分钟，并短暂离心，使管盖上的冷凝液重新回到溶液中。</li>
</ol>
3. 足迹实验
<ol>
	<li>电泳梳子决定了每块分析胶的最大数据点数量。我们使用30孔梳子。参考分子量标记占用2个孔，未切割对照占用1个孔。准备27个反应管。最终Mg(II)浓度应在对数尺度上均匀分布，覆盖滴定中点附近的数量级范围。</li>
	<li>分别将RNA和Mg(II)溶液在50°C下孵育5分钟。取10 μl RNA溶液与90 μl相应量的Mg(II)在1x缓冲液中混合，使终体积为100 μl。将溶液在50°C下孵育30分钟。</li>
	<li>让溶液在25°C下平衡1小时，同时进行RNA折叠。</li>
	<li>过氧化（3.4.1）或氧化（3.4.2）羟基自由基足迹反应。
	<ol>
		<li>通过在含有RNA溶液的反应管内顶部分别放置2 μl Fe-EDTA（100 mM）、2 μl L-抗坏血酸钠（50 mM）和2 μl H2O2（1.5%），彼此分离，启动过氧化反应，并通过剧烈混合启动足迹反应。反应15秒后加入300 μl冷无水乙醇终止反应。将反应管翻转3–5次。按步骤2.4所述沉淀、洗涤并干燥沉淀物。</li>
		<li>通过加入5 μl新配制的Fenton反应混合液（1.6）启动氧化羟基自由基足迹反应。在25°C下孵育30分钟。加入300 μl冷无水乙醇以淬灭反应，并通过翻转反应管3–5次混匀。按步骤2.4所述沉淀、洗涤并干燥沉淀物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用步骤1.3中制备的溶液，按照标准操作程序10制备RNase T1消化参考样品。</li>
	<li>将RNA沉淀溶解于8 μl凝胶上样染料II（AMBION）中，并使用盖革计数器确认RNA已充分重悬。</li>
	<li>根据标准操作规程11制备变性8%聚丙烯酰胺测序胶。上样样品，包括两个参考样和一个对照样。在60 W–75 W功率下电泳2.5小时。将干燥后的凝胶过夜暴露于存储磷屏。使用无胶片自显影成像系统（如Storm 865（GE Healthcare）或Typhoon（GE Healthcare））扫描磷屏。将凝胶图像文件传输至计算机。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>通过定量分析凝胶上每条条带的强度来确定每个核苷酸的羟基自由基反应活性。下载、安装并打开SAFA软件，这是一款易于使用的开源软件，用于单一条带拟合与定量分析12, 13。请遵循用户手册中的说明。简要步骤如下：首先以.txt文件格式加载RNA序列，然后以.gel文件格式加载凝胶图像。调整条带强度，定义泳道，选择一个锚定泳道，并执行凝胶比对。条带与核苷酸的对应关系需参照RNase T1消化测序梯度进行指认。对条带积分进行定量，并利用归一化/色谱图功能对可能不变的残基进行归一化和指认。将输出结果保存为.txt文件。</li>
	<li>SAFA输出的电子表格中，各列代表凝胶上的泳道，各行代表对应RNA片段的单个条带的积分密度。首先，通过比较无Mg(II)样品的保护图谱与终点Mg(II)浓度（本例中为50 mM）的图谱，识别出溶剂可及性发生明显变化的保护位点。数值越低，表明该核苷酸对羟基自由基攻击的保护程度越高；反之亦然。</li>
	<li>根据单个或一组核苷酸的归一化条带积分值与Mg(II)浓度的关系绘制折叠等温线。通过公式 fi = L + (U - L)•<img src="/files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="静力平衡；ΣFy=0；力平衡图；物理教育；矢量力分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Y"> 将各等温线独立地缩放为分数饱和度，其中f表示被分析条带的积分密度，L和U分别代表转变的下限和上限，<img src="/files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="静力平衡；ΣFy=0；力平衡图；物理教育；矢量力分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Y">为分数饱和度14 。使用非线性最小二乘拟合分析程序（我们使用Origin（OriginLab）或GraphPad（GraphPad Software, Inc.））将数据按Hill方程（1）进行拟合， 
	<img alt="结合等温线方程； Ȳ=K_d^n[M]^n/(1+K_d^n[M]^n)；热力学公式。" src="/files/ftp_upload/3244/3244eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 1"> 
	其中Kd为平衡解离常数，[M]为介导折叠反应的变量浓度（本例中为Mg(II)），nH为Hill系数。该方法可将转变过程缩放至分数饱和度，确定其转变中点，并提供一个现象学检验，判断该转变是否呈S形。由测序凝胶（图3A）获得并通过SAFA分析（图3B）后按上述方法拟合的等温线如图3C所示。图3中所示的分数饱和度等温线是通过在电子表格中将SAFA生成的数值依据最佳拟合的上下限（U和L）进行缩放得到的，计算公式为：分数 = 数值 / (U - L) - L / (U - L)。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
图3展示了P4-P6 RNA的•OH足迹实验的代表性结果。凝胶图像（左侧）表明：a）背景切割信号极低（右泳道）；b）由于T1泳道中条带清晰可辨，可实现单核苷酸水平的定位（RNase T1在每个G位点处切割）；c）RNA经羟基自由基诱导产生的断裂信号显著高于背景。随着Mg(II)浓度从低到高变化，单个或成组条带的整合密度降低，表明RNA三级结构的形成。切割程度同步发生变化的一个或连续多个核苷酸被称为“保护”（protection）。在Mg(II)介导的P4-P6 RNA折叠过程中观察到的•OH保护区域，与其晶体结构中观察到的溶剂不可及区域高度一致。15
折叠的RNA分子可能具有非常不同的三级接触保护程度（即条带密度下降至接近背景水平的程度），而这种差异尚未与明确的结构或动态现象相关联。因此，一些RNA分子会表现出明确的结构转变（如图3所示），而另一些则不会。条带强度通过SAFA12分析进行量化和归一化（图3B）。输出结果为“热图”，用于可视化RNA核苷酸对•OH攻击的相对保护程度。颜色变化描述了加入Mg(II)后可及性的改变：从白色到红色表示核苷酸可及性增加，从白色到蓝色表示保护性增强。每种灰度等级均对应一个数值，可绘制为保护曲线（图3C），并使用结合模型（如Hill方程（1））进行分析。保护区域153-155对应的平衡解离常数约为保护区域163-164对应值的两倍。
<img alt="Fe(II)-EDTA介导DNA切割的化学反应图示及Mg²⁺的影响；羟基自由基反应过程。" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 羟基自由基的生成与P4-P6 RNA的折叠。A) Fe(II)催化过氧化氢生成羟基自由基。抗坏血酸将Fe(III)还原为亚铁离子。B) 在缺乏Mg(II)时，P4-P6无法形成三级结构，羟基自由基可进入并切割所有可及的骨架位点。加入Mg(II)后，P4-P6开始折叠，仅溶剂可及的骨架区域可被羟基自由基切割。
<img alt="RNA标记与纯化；包含变性PAGE、羟基自由基足迹分析、片段分析的示意图" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 羟基自由基足迹分析实验流程示意图。A) RNA的去磷酸化及32P 5'端标记。B) 通过变性聚丙烯酰胺凝胶纯化32P标记的RNA。C) 切割RNA条带，随后进行RNA提取和乙醇沉淀。D) RNA的预折叠与折叠。E) 加入新鲜配制的芬顿反应混合液以产生羟基自由基。F) 通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离RNA片段。G) 使用SAFA软件对RNA片段进行定量分析。
<img alt="凝胶电泳，Mg²⁺ 结合分析，饱和曲线，蛋白质-配体相互作用研究。" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 过氧化芬顿足迹反应后RNA片段的分析。（A）RNA暴露于羟基自由基，切割产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离。图中显示随着Mg(II)浓度增加而产生的过氧化切割产物。参考和对照泳道已标注。该图像文件是SAFA程序的输入，用于定量每条条带的体积。（B）SAFA生成的“热图”。（C）SAFA输出的积分条带密度与核苷酸编号对应数值表，通过诸如Hill方程（1）的结合模型进行分析。根据条带积分密度随Mg(II)浓度增加的变化，选择受保护区域。Kd 是所监测位点处一半RNA发生折叠时的Mg(II)浓度。Hill系数nH 反映曲线斜率，提供结合协同性的信息，并对该特定位点折叠过程中涉及的镁离子数提供一个下限估计。
<img alt="RNA反应设置，不同Mg(II)浓度表格，变化条件，实验室实验数据。" src="/files/ftp_upload/3244/3244table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Table 1"> 
表1. 制备含有不同Mg(II)浓度RNA样品的代表性体积。

<ol><li>Tullius, T. D., Dombroski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl+radical+%22footprinting%22%3A+high-resolution+information+about+DNA-protein+contacts+and+application+to+lambda+repressor+and+Cro+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl radical "footprinting": high-resolution information about DNA-protein contacts and application to lambda repressor and Cro protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5469-5473 (1986).</li>
<li>Celander, D. W., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron%28II%29-ethylenediaminetetraacetic+acid+catalyzed+cleavage+of+RNA+and+DNA+oligonucleotides%3A+similar+reactivity+toward+single-+and+double-stranded+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Iron(II)-ethylenediaminetetraacetic acid catalyzed cleavage of RNA and DNA oligonucleotides: similar reactivity toward single- and double-stranded forms.</a> Biochemistry. 29, 1355-1361 (1990).</li>
<li>Celander, D. W., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+higher+order+folding+of+a+catalytic+RNA+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing the higher order folding of a catalytic RNA molecule.</a> Science. 251, 401-407 (1991).</li>
<li>Sclavi, B., Sullivan, M., Chance, M. R., Brenowitz, M., Woodson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+folding+at+millisecond+intervals+by+synchrotron+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA folding at millisecond intervals by synchrotron hydroxyl radical footprinting.</a> Science. 279, 1940-1943 (1998).</li>
<li>Tullius, T. D., Dombroski, B. A., Churchill, M., Kam, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl+radical+footprinting%3A+a+high-resolution+method+for+mapping+protein-DNA+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl radical footprinting: a high-resolution method for mapping protein-DNA contacts.</a> Methods. Enzym. 155, 537-558 (1987).</li>
<li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic. Acids. Res. 15, 8783-8798 (1987).</li>
<li>Schlatterer, J. C., Brenowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementing+global+measures+of+RNA+folding+with+local+reports+of+backbone+solvent+accessibility+by+time+resolved+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Complementing global measures of RNA folding with local reports of backbone solvent accessibility by time resolved hydroxyl radical footprinting.</a> Methods. 49, 142-147 (2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , 3 ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor. New York. (2001).</li>
<li>Zaug, A. J., Grosshans, C. A., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+endoribonuclease+activity+of+the+Tetrahymena+ribozyme%3A+enhanced+cleavage+of+certain+oligonucleotide+substrates+that+form+mismatched+ribozyme-substrate+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific endoribonuclease activity of the Tetrahymena ribozyme: enhanced cleavage of certain oligonucleotide substrates that form mismatched ribozyme-substrate complexes.</a> Biochemistry. 27, 8924-8931 (1988).</li>
<li>Knapp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+approaches+to+probing+of+RNA+secondary+and+tertiary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Enzymatic approaches to probing of RNA secondary and tertiary structure.</a> Methods. Enzym. 180, 192-212 (1989).</li>
<li>Slatko, B. E., Albright, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+gel+electrophoresis+for+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Denaturing gel electrophoresis for sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 7, Unit 7.6-Unit 7.6 (2001).</li>
<li>Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAFA%3A+semi-automated+footprinting+analysis+software+for+high-throughput+quantification+of+nucleic+acid+footprinting+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">SAFA: semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments.</a> RNA. 11, 344-354 (2005).</li>
<li>Simmons, K., Martin, J. S., Shcherbakova, I., Laederach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+and+analysis+of+kinetic+%2AOH+radical+footprinting+data+using+SAFA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification and analysis of kinetic *OH radical footprinting data using SAFA.</a> Methods. Enzym. 468, 47-66 (2009).</li>
<li>Uchida, T., He, Q., Ralston, C. Y., Brenowitz, M., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+of+monovalent+and+divalent+ion+binding+in+the+folding+of+the+P4-P6+domain+of+the+Tetrahymena+ribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Linkage of monovalent and divalent ion binding in the folding of the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme.</a> Biochemistry. 41, 5799-5806 (2002).</li>
<li>Cate, J. H., Gooding, A. R., Podell, E., Zhou, K., Golden, B. L., Kundrot, C. E., Cech, T. R., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+group+I+ribozyme+domain%3A+principles+of+RNA+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing.</a> Science. 273, 1678-1685 (1996).</li>
<li>Petri, V., Brenowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+nucleic+acids+footprinting%3A+thermodynamic+and+kinetic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative nucleic acids footprinting: thermodynamic and kinetic approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 8, 36-44 (1997).</li>
<li>Takamoto, K., Das, R., He, Q., Doniach, S., Brenowitz, M., Herschlag, D., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+RNA+compaction%3A+insights+from+the+equilibrium+folding+pathway+of+the+P4-P6+RNA+domain+in+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of RNA compaction: insights from the equilibrium folding pathway of the P4-P6 RNA domain in monovalent cations.</a> J. Mol. Biol. 343, 1195-1206 (2004).</li>
<li>Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+DNase+footprint+titration%3A+a+method+for+studying+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions.</a> Methods. Enzym. 130, 132-181 (1986).</li>
<li>Shcherbakova, I., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl-radical+footprinting+to+probe+equilibrium+changes+in+RNA+tertiary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl-radical footprinting to probe equilibrium changes in RNA tertiary structure.</a> Methods. Enzym. 468, 31-46 (2009).</li>
<li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+for+the+study+of+protein+association+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly.</a> Curr. Opinion. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).</li>
<li>McGinnis, J. L., Duncan, C. D., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+SHAPE+and+hydroxyl+radical+analysis+of+RNA+structure+and+ribonucleoprotein+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzym%22%5BJournal%5D)">High-throughput SHAPE and hydroxyl radical analysis of RNA structure and ribonucleoprotein assembly.</a> Methods. Enzym. 468, 67-89 (2009).</li>
<li>Jonikas, M. A., Radmer, R. J., Laederach, A., Das, R., Pearlman, S., Herschlag, D., Altman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-grained+modeling+of+large+RNA+molecules+with+knowledge-based+potentials+and+structural+filters%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Coarse-grained modeling of large RNA molecules with knowledge-based potentials and structural filters.</a> RNA. 15, 189-199 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

羟基自由基足迹法是一种用于评估核酸溶剂可及表面积的有效工具。可以依据离子类型和浓度、pH、温度、结合蛋白或折叠辅助因子等参数，追踪三级结构形成的定性与定量变化14。该方法操作简便、成本低廉，且能提供单核苷酸水平上的溶剂可及性和折叠信息，因而极具吸引力。传统上，•OH 足迹反应使用外源添加的 H2O2 进行，我们称此方法为“过氧化性”方法（图1A）。我们所强调的另一种替代方法（“氧化性”方法）17 则利用自然溶解的 O2，通过以下反应生成少量过氧化氢： 
<img alt="氧化还原反应，Fe(III)+O2→Fe(III)+O2；O2+2H+→H2O2+O2，化学方程式。" src="/files/ftp_upload/3244/3244eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 2">
两种方法均通过 H2O2 将 Fe(II) 氧化为 Fe(III) 来...

<table><tbody><tr><td>名称</td><td>公司</td><td>货号</td><td></td></tr><tr><td>二甲胂酸钠（注意！有毒）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4945-25g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 处理水</td><td>Ambion</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠 (3 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Ambion</td><td>AM9902</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-7876</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7631-25g</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; · 6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1543-500g</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>Fermentas</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢 (30%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>349887</td><td></td></tr></tbody></table>

通过“过氧化”和“氧化”羟基自由基足迹法监测rna结构的平衡变化

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA分子在生物学中发挥着至关重要的作用。除了传递遗传信息外，RNA还能折叠成独特的三级结构，作为调节因子、结合分子或催化剂执行特定的生物学功能。了解RNA分子中三级接触的形成信息对其功能研究至关重要。羟基自由基（•OH）因其高反应活性和小分子尺寸，是研究核酸结构的独特探针1 。作为足迹探针使用时，羟基自由基能够以单核苷酸分辨率精确绘制DNA1 和RNA2磷酸二酯骨架的溶剂可及表面图谱。羟基自由基足迹法可用于鉴定分子间接触表面内的核苷酸，例如在DNA-蛋白质1和RNA-蛋白质复合物中。通过将羟基自由基足迹实验作为溶液变量或时间的函数进行，可分别确定体系的平衡3和动力学4变化过程。足迹法的一个关键特征是，对探针的有限暴露（例如“单次撞击动力学”）可实现对聚合物中每个核苷酸的均匀取样5。
在本视频文章中，我们以嗜热四膜虫（Tetrahymena）核酶的 P4-P6 结构域为例，说明 RNA 样品的制备以及 Mg(II) 介导的折叠等温线的测定。我们描述了常用的羟基自由基足迹分析方案，该方案需要使用 H2O2（我们称之为“过氧化”方案），以及一种有价值但尚未广为人知的替代方法，即利用自然溶解的 O2（我们称之为“氧化”方案）。本文还概述了数据归约、转换和分析的流程。

本实验方案介绍了通过两种羟基自由基足迹法来定量分析依赖于镁离子（Mg(II)）的RNA三级结构形成的方法。

通过“过氧化”和“氧化”羟基自由基足迹法监测RNA结构的平衡变化

RNA分子在生物学中发挥着至关重要的作用。除了传递遗传信息外，RNA还能折叠成独特的三级结构，执行多种功能……

以下实验的总体目标是利用羟基自由基足迹法确定RNA分子的折叠方式。该过程首先对RNA进行末端标记、凝胶纯化和预折叠处理，以确保在后续依赖镁离子的折叠反应之前RNA构象的完整性。接着，混合芬顿试剂以产生羟基自由基，这些自由基可根据RNA骨架的溶剂可及性对其进行切割。随后，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离RNA切割产物，并通过放射自显影进行检测。通过半自动化的足迹分析软件对条带积分进行定量。最终目标是生成反映RNA三级结构形成的折叠等温线。这一步骤通过将归一化的条带积分按饱和分数进行缩放来实现。随后可将等温线拟合到Hill方程。羟基足迹法的主要优势在于，利用廉价的化学试剂即可获得RNA的三级结构信息，由于小尺寸的羟基自由基具有较高活性，因此是区分溶剂可及与埋藏核苷酸的理想探针。该方法有助于解答RNA结构生物学领域中的关键科学问题。例如，核糖体如何利用金属离子达到其活性构象？羟基自由基足迹法可用于理解RNA特异性和识别的基本原理。除了揭示RNA三级结构的信息外，该方法还可用于确定RNA或DNA分子中蛋白质的精确结合位点。该方法的主要挑战在于防止核糖核酸酶导致的样品降解，以及优化铁浓度以获得适当的RNA切割程度。此外，对条带间距的详细分析也可能相当复杂。本视频的主要优势在于帮助观众理解羟基自由基足迹实验的规划阶段及成功实施的关键步骤。在开始本方案之前，应按照书面方案中的说明准备好所有足迹实验所需的试剂。在此视频的配套实验中，可制备与DFOs相关的四种RNA，并按所述方法进行末端标记。使用变性凝胶电泳纯化放射性标记的RNA。通过两次连续的凝胶抽提，使用0.3摩尔的醋酸钠回收纯化后的RNA。然后通过将0.5毫升水溶液与1毫升乙醇混合来沉淀RNA。将混合物在干冰上孵育1分钟。离心样品后，弃去上清液。用70%乙醇洗涤RNA沉淀。额外离心后去除上清液，并在真空条件下干燥沉淀。随后，将纯化的 P 32 标记的 RNA 样品溶解。在新的反应管中，用移液器加入 330 微升 1 倍反应缓冲液和 30 微升 RNA 溶液。用乙醇沉淀RNA，然后在真空条件下干燥沉淀。干燥后的沉淀可用于生成参考ladder，具体操作如书面实验步骤所述。将剩余的缓冲RNA溶液在95摄氏度加热2分钟以进行变性。将样品置于室温下15分钟，随后短暂离心，使冷凝液重新回到溶液中。开始足迹实验时，准备27个反应管，以获得足够填充30孔电泳胶的样品量。加入分子量标记物和切割对照后，确定最终的镁离子和铁离子浓度，使其在滴定中点附近的多个数量级范围内以对数尺度均匀分布。文中将单独描述在1倍反应缓冲液中制备镁离子的步骤。将RNA与镁离子溶液在50摄氏度下孵育5分钟。然后取10微升RNA溶液与90微升相应浓度的镁离子溶液混合。将每个混合物在50摄氏度下孵育30分钟，以达到100微升的终体积。随后，让溶液在25摄氏度下平衡1小时，以完成RNA折叠。在此期间，立即在启动羟基自由基足迹反应前，按照书面实验方案所述配制空白反应混合液。在含有RNA溶液的反应管内壁顶部，用移液器分别加入两微升的铁-EDTA、抗坏血酸钠和过氧化氢液滴，使各液滴互不接触，以配制过氧化反应体系。通过剧烈混匀启动足迹反应。反应15秒后，加入300微升纯的冷乙醇终止反应。将离心管轻轻翻转3至5次。最后，沉淀、洗涤并干燥沉淀物，操作步骤同前。作为过氧化反应的替代方法，可进行氧化羟基化反应，即向样品中加入5微升新配制的芬顿反应混合液。在25摄氏度下孵育氧化反应30分钟。然后加入 300 µL 纯的冷乙醇以终止反应，并通过翻转离心管混匀。再次进行沉淀。在完成过氧化或氧化反应后，洗涤并干燥沉淀物。将干燥的RNA沉淀溶解于8 µL的凝胶上样染料2中。使用盖革计数器确认P 32标记的RNA已重悬，然后根据标准方案制备变性的8%聚丙烯酰胺测序凝胶。使用30孔梳子上样样品，包括两个参照样品和一个已切割的对照样品。在60至75瓦功率下分离RNA片段，持续两个半小时。将干燥的凝胶置于储存磷屏中避光曝光过夜。使用成像系统对磷屏进行扫描，实现无胶片自显影。然后将凝胶图像文件转移至计算机进行分析。开始数据分析时，打开Safa——一款用于单条带拟合与定量的开源软件。首先加载RNA序列的点TXT文件，随后加载凝胶图像的点gel文件。定义泳道并调整条带强度。然后选择一个锚定泳道，并以RNA的T1酶消化测序梯度为参照，将凝胶中各条带与相应核苷酸位置进行比对。量化条带强度，并利用归一化/着色图功能进行归一化处理，识别并标记可能不变的核苷酸残基。将输出保存为 txt 文件。SFA 输出一个电子表格，其中列表示凝胶上的泳道，行表示对应 RNA 片段的各个条带积分值。首先，需通过比较无镁离子样品的保护图谱与终点镁离子浓度图谱，识别出溶剂可及性发生明显变化的保护位点。数值越低，核苷酸对羟基自由基攻击的保护程度越高；反之亦然。接下来，使用电子表格格式，分别绘制条带强度随镁离子浓度变化的过渡曲线，或将单个或成组核苷酸的强度对镁离子浓度作图，并按照本实验方案文本部分所述，将这些过渡曲线各自缩放至分数饱和函数。最后一步，将数据拟合到Hill方程。该分析将转变过程标度化为分数饱和度，确定转变的中点，并提供一种现象学方法来检验转变是否呈S形。以下是来自P四P六核糖体RNA羟基自由基足迹实验的代表性结果。等温曲线由通过Safa分析的测序凝胶数据得出，随后按照分析部分所述方法进行拟合。凝胶图像表明，背景切割信号极低，且由于T泳道中条带清晰，可实现单核苷酸定位。RNA的羟基自由基诱导断裂信号显著高于背景。随着镁离子浓度由低到高转变，特定单一条带或条带群的信号强度选择性降低，表明RNA结构的形成。三级结构保护是指一个或连续多个核苷酸，其切割会同时改变条带强度，通过Saffer分析对这些强度进行定量和归一化。结果以热图形式展示，直观显示核苷酸对羟基自由基的保护程度。颜色变化描述了在添加镁离子后核苷酸可及性的改变：从白色到红色表示核苷酸更易接近，而从白色到蓝色则表示核苷酸受到更强的保护。每种程度的遮蔽都对应一个数值，该数值可绘制为保护曲线，并通过结合模型（如Hill方程）进行分析。在此示例中，保护位点1 5 3至1 5 5对应的平衡解离常数大约是保护位点1 6 3至1 6 4对应值的两倍。如果操作得当，该羟基自由基足迹实验可在一天半内完成。进行该实验操作时，务必记得佩戴手套和实验服，以避免任何RNA污染。此外，最终的铁浓度取决于具体的实验体系。因此，我们建议在按照本方案进行足迹分析之前，先开展剂量反应实验。其他方法，例如时间分辨的羟基自由基足迹法，也可用于回答更多问题。例如，RNA分子在生成后，在哪个关键时间点达到错误折叠或活性构象？该技术为结构生物学领域的研究人员探索核酸分子间的以及中间态的三级分子相互作用铺平了道路。观看本视频后，您应该能够很好地理解如何确定 RNA 分子的三级结构形成。请注意，进行此操作时，钙和磷阶段二具有危险性，建议采取相应的安全预防措施，例如佩戴手套和护目镜，以及使用有机玻璃屏蔽装置。

monitoring-equilibrium-changes-rna-structure-peroxidative-oxidative

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

监测RNA结构平衡的变动情况“过氧化”和“氧化”羟基自由基足

高通量选择性2'羟基酰化结合引物延伸分析（SHAPE）利用一种新型化学探针技术，结合逆转录、毛细管电泳和二级结构预测软件，以单核苷酸分辨率测定长度从数百到数千个核苷酸的RNA结构。...

利用高通量SHAPE进行RNA二级结构预测

基于自由基的仿生化学已被应用于构建生物标志物开发所需的化合物库。...

化学生物学中的自由基：从化学行为到生物标志物的开发

本文介绍一种依赖脱氧核酶（DNAzyme）的RNA切割实验方案。该方法可实现对RNA...

DNA酶依赖性分析rRNA的2'-O-甲基化

本文描述了对DNA中的损伤产物8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxodGuo）、1,N6-乙烷-2'-脱氧腺苷（1,N6-dAdo）和1,N2-乙烷-2'-脱氧鸟苷（1,N2-dGuo）进行高灵敏度和准确测定的方法。这些方法已应用于评估暴露于细颗粒物（PM2.5）的A/J小鼠组织（肺、肝和肾）中的损伤效应。...

通过质谱法定量三种DNA损伤及其在暴露于环境细颗粒物小鼠组织中水平的评估

活体快速光化学蛋白质氧化（IV-FPOP）是一种羟基自由基蛋白质足迹技术，可用于在天然环境中绘制蛋白质结构图。本方案描述了IV-FPOP微流控流动系统的组装与设置。...

体内羟基自由基蛋白质足迹法用于研究蛋白质相互作用 秀丽隐杆线虫

本文利用一种称为细胞内快速光化学蛋白质氧化（IC-FPOP）的蛋白质足迹技术，在活细胞中表征蛋白质结构及相互作用位点。...

利用细胞内快速光化学氧化蛋白质法表征细胞蛋白质

动力学交联与cDNA分析是一种能够在活细胞中以高时间分辨率研究蛋白质-RNA相互作用动态过程的方法。本文详细描述了该实验方案，包括酵母细胞培养、紫外交联、细胞收集、蛋白质纯化以及下一代测序文库制备等步骤。...

使用&#967;CRAC技术在活体内以高时间分辨率监测蛋白质-RNA相互作用动态

蛋白质的快速光化学氧化是一种新兴的蛋白质结构表征技术。不同的溶剂添加剂和配体具有各异的羟基自由基清除特性。为了比较不同条件下的蛋白质结构，需要对反应中产生的羟基自由基进行实时校正，以标准化反应条件。...

实现快速蛋白质光化学氧化中实时校正以确定蛋白质拓扑结构变化

本方案介绍了一种利用在线自由基剂量测定和等离子体光源进行闪光氧化蛋白质足迹分析的方法。该方法取代了具有潜在危险的紫外激光，从而简化了蛋白质快速光化学氧化研究的操作，并提高了其实验重复性。...

无需激光的羟基自由基蛋白质足迹法用于蛋白质高级结构分析

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）对氧化RNA与外切核糖核酸酶Xrn-1反应产生的片段进行表征。本方案所描述的方法可应用于涉及RNA和/或DNA的其他过程。...

利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定酶降解产生的RNA片段

该方案提供了使用二甲基硫酸酯对RNA进行修饰以开展突变谱分析实验的操作指导。内容包括 体外 和 体内...

利用二甲基硫酸盐突变谱结合测序技术探究RNA结构 体外 以及在细胞中

学习利用羟基自由基足迹法分析RNA三级结构的形成过程。该方法通过末端标记、凝胶纯化和Fenton试剂产生羟基自由基，实现RNA折叠等温线的定量测定，为RNA结构生物学研究提供重要技术手段。

通过“过氧化”和“氧化”羟基自由基足迹法监测RNA结构的平衡变化

探索更多视频