刀口扫描显微镜的样品制备，图像和分析协议

该程序的总体目标是展示在刀口扫描显微镜 （KESM） 下进行切片和成像的生物标本的制备，以及所得图像堆栈数据的可视化。这是通过首先固定、染色和包埋组织以准备在 KESM 下成像来实现的。该程序的第二步是配置 KESM 并使用自动控制软件进行切片和成像。

然后对生成的图像进行去噪配准和裁剪。最后一步是在基于 Web 的图谱和 3D 可视化软件中加载和探索数据集。最终，可以获得以亚微米分辨率显示全脑水平、神经元和血管组织的结果。

与现有的 Mesos（例如串行块基扫描电子显微镜）相比，该技术的主要优点是它可以成像更大的体积，尽管分辨率较低。这种方法可以帮助回答连接组学和神经科学领域的关键问题。这种方法可以深入了解大脑的结构组织，也可以应用于其他器官系统，如肺和肾。

为了开始此过程，将解剖的小鼠大脑置于含有 Golgi Cox 溶液的玻璃罐中。将玻璃罐放入室温下的不透光盒中 10 至 16 周。由于 Golgi Cox 溶液用作固定剂，因此不需要单独的固定步骤。

10 至 16 周后，第二天在黑暗中用去离子水冲洗大脑过夜，将冲洗后的大脑浸入去离子水中的 5% 氢氧化铵溶液中，在室温下避光浸泡 7 至 10 天。7 到 10 天后，在室温下再次用去离子水冲洗大脑 4 小时。然后通过一系列分级的乙醇使大脑脱水，将其在每个溶液中放置 24 小时，在 4 摄氏度下加入 50% 乙醇和 70% 乙醇以及 85% 乙醇。

室温下 3 次 95% 乙醇变化和 4 至 5 次 100% 乙醇变化。接下来，将脱水的大脑放入丙酮中，每次进行 3 到 4 次更换，持续一天。在此之后，将大脑放入冰箱中的每一种 aite 丙酮混合物中过夜，aite 与丙酮的比例为 1 比 2、1 比 1 和 2 比 1。

最后将大脑放入冰箱中的 100%aite 中，每次过夜进行 3 次更换。然后将处理过的大脑嵌入 100% aite 中并加热至 60 摄氏度三天。最后，将固化的试样块安装在金属试样环上，使用环氧树脂，并根据需要修剪块的侧面以开始此过程。

确认鼠标已深度麻醉并且对脚趾捏没有反应。然后使用室温磷酸盐缓冲盐水经亲切灌注小鼠，然后用冷的 4% 磷酸盐缓冲对位甲醛灌注。接下来，用 0.1% 硫的溶液灌注小鼠，并在去离子水中染料。

之后，将尸体放入 4 摄氏度的冰箱中 24 小时。24 小时后，从犊牛中取出大脑，放入 0.1% 硫氨酸的新鲜溶液中。将大脑置于 4 摄氏度 7 天。

七天后，通过一系列分级的乙醇滞留和脱水大脑。在 6 周的时间内，在 50% 乙醇中 3 到 5 天，在 70% 乙醇中 7 到 10 天，在 85% 和 95% 乙醇中各约 2 周，其余时间在 100% 乙醇中。在室温下更换丙酮 3 次后，大脑被嵌入 60 摄氏度的烤箱中

要开始用印度墨水对血管网络进行染色的程序，请通过缺乏脚趾撤退反射来确认鼠标已深度麻醉。然后使用室温磷酸盐缓冲盐水经式灌注小鼠，然后用室温 10% 中性缓冲福尔辛灌注小鼠。生理盐水和固定剂的全身灌注对于清除心血管系统中的血液和固定组织是必要的。

接下来，用 3.0 ccs 未稀释的印度墨水灌注灌注小鼠。对于印度来说，墨水是完全充满心血管系统所必需的。从小鼠中取出后，所得大脑通过一系列分级乙醇脱水，然后嵌入博学塑料中。

按照前面显示的协议设置 KESM 进行成像，打开相机、照明器和载物台，抬起刀和物镜。接下来，安装标本环。然后放下物镜和刀。

测量试样尺寸。然后为 KESM 舞台控制器创建一个配置文件。两个应用程序，在初始化阶段之前提高 KESM 的刀和目标。

启动 KESM 阶段控制器 2 并初始化阶段。然后放下刀和物镜并打开泵。通过转动光学系统上的对焦旋钮并调整相机相对于刀刃的视野来聚焦物镜和相机。

单击，逐步检查成像和切片的前几个步骤。然后单击 go。启动图像处理的成像和切片。

运行 KESM 堆栈处理器以消除照明伪影并标准化所有图像中的背景强度。对所有数据子文件夹重复上述步骤。要使用 KESM 脑图谱可视化数据，请访问此网站并选择合适的图谱以转到不同的深度。

从下拉菜单中选择每一步的深度，然后单击加号以增加或减号以减少 Z 深度。其他选项包括放大或使用 KESM 脑图谱进行导航。使用下拉菜单调整叠加编号和叠加间隔，以使用 VIS 实验室可视化数据。

启动应用程序，创建一个新项目。该项目应包括从 2D 文件组成 3D、设置世界矩阵、算术 1 和连接 3D 视图。按照该顺序，应设置适当的参数，如按下鼠标右键时 view 3D 所示。

四处移动鼠标以调整阈值区域可以裁剪的区域。方向已更改，照明已更改，或者背景已打开或关闭。代表性的 KESM 结果由以下说明首先显示的是 KESM 的体积可视化，血管数据集的全脑印度墨水数据堆栈，从宽度约为 100 微米的血管数据的特写开始。

KESM 的第二个剪辑，全脑印度墨水数据显示了整个小鼠脑脉管系统的三个标准视图，这些视图是从宽度约为 10 毫米的高分辨率数据中采样的。矢状视图、冠状面视图和水平视图，以及冠状截面的飞越。凯斯姆。该视频剪辑说明了全脑小鼠高尔基体数据，该视频剪辑显示了沿三个不同切片平面的飞行，从块状视图开始，然后是矢状视图、冠状视图和水平视图。

接下来显示了 KESM 全脑小鼠 GoGy 数据的详细信息。第一个视频剪辑是小脑细胞和浦肯野细胞。第二个剪辑显示了皮层和副金属细胞。

最后，KESM。这两个视频剪辑说明了全脑 nle 数据。首先显示的是 NLE 数据的特写。

第二个剪辑显示了从高分辨率数据中采样的整个小鼠大脑 Nle 数据订阅的三个标准视图。还显示了横截面，以便清楚地看到此开发后的内部结构。这项技术为神经科学领域的研究人员探索小鼠大脑中的神经元和血管网络铺平了道路。

看完这个视频，您应该对刀口扫描显微镜的标本制备、成像和数据分析有了很好的了解。