Name: 刀口扫描显微镜的样品制备，图像和分析协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学习刀口扫描显微镜的样品制备、成像与数据分析方法，用于小鼠全脑神经和血管网络的高分辨率可视化。该技术适用于连接组学和神经科学研究。

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本项目由美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH/NINDS，项目编号#1R01-NS54252）、美国国家科学基金会（NSF，项目编号#0905041、#0079874）、德克萨斯州先进技术计划（Texas Advanced Technology Program，项目编号#ATP-000512-0146-2001、#ATP-000512-0261-2001）及德克萨斯农工大学系统（Texas A&amp;M研究基金会，德克萨斯A&amp;M大学和3Scan。我们感谢Bernard Mesa（Micro Star Technologies）在KESM仪器方面的技术咨询与支持。KESM的主要设计与实施工作由Bruce H. McCormick完成，他于2007年逝世。

1. 标本制备：Golgi-Cox法
<ol>
	<li>本方案严格遵循 Mayerich 等人7的方案。</li>
	<li>使用异氟烷吸入麻醉使 C57BL/6J 小鼠深度麻醉，随后将其断头处死。</li>
	<li>取出脑组织并置于 Golgi-Cox 固定液中（含1%铬酸钾、1%重铬酸钾和1%氯化汞的去离子水溶液）。</li>
	<li>将脑组织置于 Golgi-Cox 溶液中，在室温避光条件下固定 10 至 16 周。</li>
	<li>在避光条件下，用去离子水冲洗脑组织过夜。</li>
	<li>将冲洗后的脑组织置于含5%氢氧化铵的去离子水溶液中，在室温避光条件下浸泡 7 至 10 天。此较长的处理时间旨在确保溶液充分渗透整个脑组织，从而使黑色沉淀物有充分机会在组织内完全形成。</li>
	<li>将脑组织在室温下再次用去离子水冲洗 4 小时，然后通过梯度乙醇进行脱水：50% 和 70% 乙醇在冰箱（4 °C）中进行，85%、95%（更换3次）和100%（更换4至5次）在室温下进行。每次更换溶液后，脑组织均需在相应溶液中放置 24 小时。</li>
	<li>脱水后的脑组织随后置于丙酮中（更换3至4次，每次一天），接着依次置于 Araldite-丙酮混合液中，Araldite 与丙酮的比例分别为 1:2、1:1、2:1，最后置于100% Araldite 中（更换3次，每次过夜），所有步骤均在冰箱（4 °C）中进行。</li>
	<li>最后，将处理后的脑组织包埋于100% Araldite 中，并在 60 °C 下加热 3 天（参见 Abbott 和 Sotelo2 的包埋方案）。 
若使用 LR White 包埋，则将样品从最后一次100%乙醇溶液中转移至 LR White 溶液中，共更换三次，每次在冰箱中过夜，这是聚合前的标准操作步骤。进行三次更换以确保充分渗透。随后将样品转移至新鲜的 LR White 溶液中，在密闭容器内于 60 °C 下聚合 24 小时，此为实现充分聚合所需的必要时间和温度。</li>
	<li>图1显示了经 Golgi-Cox 染色并包埋于 Araldite 中的脑组织。</li>
	<li>将固化后的样品块用环氧树脂固定在金属样品环上，并根据需要修整样品块的侧面（见图2）。</li>
</ol>
2. 标本制备：尼氏染色
<ol>
	<li>本方案严格遵循 Mayerich 等人7所述的实验方案。</li>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪对小鼠进行深度麻醉，随后经心脏灌注 50 mL 室温磷酸盐缓冲液（pH 7.4），接着灌注 250 mL 冷的 4% 磷酸盐缓冲戊二醛溶液（pH 7.4）。</li>
	<li>然后用 100 mL 含 0.1% 硫堇染料的去离子水溶液对小鼠进行灌注，并将尸体置于冰箱（4 °C）中保存 24 小时。</li>
	<li>24 小时后，将脑组织从颅骨中取出，放入新鲜的 0.1% 硫堇溶液中，在 4 °C 下保存 7 天。此步骤耗时较长，以确保硫堇充分渗透至整块脑组织中。</li>
	<li>随后通过梯度乙醇溶液对脑组织进行脱色和脱水处理，起始为 50% 乙醇与水的混合液，逐步过渡至 100% 乙醇，整个过程持续 6 周。50% 至 70% 的乙醇更换液保存于冰箱（4 °C），而浓度高于 70% 的乙醇更换液则在室温下保存。</li>
	<li>经过三次丙酮处理（每次在室温下持续 2–4 天）后，按照上述 1.8–1.9 步骤将脑组织包埋于 Araldite 塑料中。若使用 LR White 作为包埋介质，则遵循上述 1.10 步骤的操作方案。</li>
</ol>
3. 样本制备：印度墨水法
<ol>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪（每20克体重注射1.7 mg氯胺酮/0.26 mg赛拉嗪）使小鼠深度麻醉，随后经心脏灌注50 mL室温磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4），接着灌注250 mL室温10%中性缓冲甲醛溶液（pH 7.4），最后灌注3.0 cc未稀释的印度墨水。</li>
	<li>使用生理盐水和固定液进行全身灌注，目的是清除心血管系统中的血液并固定组织。灌注印度墨水可确保心血管系统的血管完全充填。</li>
	<li>随后将脑组织依次通过梯度浓度的乙醇（25%–100%）脱水，并按照上述1.8–1.9步骤中的方案将其包埋于Araldite塑料中。若使用LR White作为包埋介质，则遵循上述1.10步骤中的方案。</li>
</ol>
4. 标本制备：通用物种，通用器官
<ol>
	<li>对于一般情况，固定可使用10%中性缓冲福尔马林或4%多聚甲醛。</li>
	<li>对于小体积组织，建议采用浸透法而非灌注法进行固定和染色。对于小型生物体或器官，染色也可在脱水过程中进行。</li>
	<li>包埋步骤与上述相同，但对于远小于完整小鼠脑组织的器官或生物体，可缩短溶液浸透的时间。</li>
</ol>
5. KESM 设置与成像
<ol>
	<li>关闭泵，打开载物台，打开相机，打开照明器。</li>
	<li>升起刀片和物镜。</li>
	<li>安装样品环。</li>
	<li>测量样品尺寸，并为 KESM Stage Controller2 应用程序创建配置文件。</li>
	<li>启动 KESM Stage Controller2 并初始化载物台。</li>
	<li>降低刀片/物镜，开启泵。</li>
	<li>通过旋转光路中的调焦旋钮，并调整相机相对于刀刃的视野，对物镜和相机进行调焦。</li>
	<li>按下 [Go] 键以开始成像。</li>
	<li>参见图 3-8。技术细节参见9, 7。</li>
</ol>
6. 图像处理与数据准备
<ol>
	<li>将 KESM 图像栈处理器可执行文件复制到配置文件文件夹（00000、00001 等）下的数据文件夹中。</li>
	<li>运行 KESM 图像栈处理器，以去除光照伪影并校正所有图像的背景强度。对所有数据子文件夹重复此步骤。</li>
	<li>从数据集中生成多尺度切片，并上传至 KESM 脑图谱网络服务器，完成文件设置。</li>
	<li>参见图 9。</li>
</ol>
7. 数据可视化与分析
<ol>
	<li>使用 KESM 脑图谱进行可视化。前往 <a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a> 并选择相应的图谱。
	<ol>
		<li>像使用 Google 地图一样进行导航。</li>
		<li>像使用 Google 地图一样进行缩放。</li>
		<li>若要切换到不同深度，请从下拉菜单中选择每步进入的深度，然后点击 [+] 或 [-] 以增加或减少 z 深度。</li>
		<li>使用下拉菜单调整叠加层数量。</li>
		<li>使用下拉菜单调整叠加层间隔。</li>
		<li>参见图 11。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 MeVisLab 进行可视化。
	<ol>
		<li>启动 MeVisLab。</li>
		<li>创建一个新项目。</li>
		<li>在后续操作中，可通过在命令框中输入模块名称来创建新模块。</li>
		<li>创建 [Compose3Dfrom2DFiles] 模块，并进入目标文件夹。输入文件字符串后点击 [GetFileList]。确保所选图像能够完全载入内存。点击 [Create3D] 以生成三维数据。</li>
		<li>创建 [SetWorldMatrix] 模块，并在“基本变换”（Elementary Transforms）下的 x、y、z 方向将“Scale”设置为合适的体素尺寸（对于 10X 0.45NA 物镜，设置为 0.6、0.7、1.0）。将 [Compose3Dfrom2DFiles] 连接到 [SetWorldMatrix]。</li>
		<li>在“矩阵组合”（Matrix Composition）中，将矩阵和变换设置为“忽略”（Ignore）、“忽略”（Ignore）、“前向”（Forward）。</li>
		<li>创建 [Arithmetic1] 模块，并将“Function”设置为“Invert(Max-Img)”。
		 
		将 [SetWorldMatrix] 连接到 [Arithmetic1]。</li>
		<li>创建 [View3D] 模块，并将其连接至 [Arithmetic1]。</li>
		<li>在 View3D 中，按住鼠标右键并移动鼠标以调整阈值。您可以裁剪区域、更改方向（按住鼠标左键移动）、切换照明模式（体绘制或最大强度投影 MIP）、开启或关闭背景等。</li>
		<li>参见图 10。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 代表性结果：
本文提供了全脑数据及相关细节。图12-15展示了全脑印度墨水、高尔基和尼氏染色数据集1, 4, 3。
<img alt="琥珀化石保存；树脂块内可见有机物；古生物学研究样本。" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 固定、染色并包埋的小鼠脑组织
<img alt="用于材料分析的树脂包埋样品；固态研究，检测装置。" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 固定在样品环上的包埋小鼠脑组织标本。
<img alt="用于光学激发的显微镜装置；示意图包含激光器、探测器；用于光谱分析。" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 刀刃扫描显微镜（KESM）。图中展示了KESM的照片，并标注了其主要组件：（1）高速线扫描相机，（2）显微镜物镜，（3）金刚石刀片组件和光束准直器，（4）样品槽（用于水浸成像），（5）三轴精密空气轴承载物台，（6）白光显微镜照明器，（7）水泵（位于后方），用于移除切下的组织，（8）用于载物台控制和图像采集的PC服务器，（9）花岗岩基座，以及（10）花岗岩桥架。
<img alt="组织切片示意图、显微镜设置、光路、载物台运动、线扫描显微成像过程。" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. KESM 的成像原理。图中展示了 KESM 的工作原理：物镜与刀片保持固定，而固定在定位载物台上的样品以 20 nm 的分辨率和 1–5 mm/s 的行进速度移动（实线箭头所示），并在移动过程中被刮过金刚石刀片（10X 物镜使用 5 mm 宽的刀片），从而产生连续的薄切片并流过刀面（实线箭头所示）。线扫描成像在刀片尖端附近完成。
<img alt="X射线衍射装置；晶体学分析设备；结构测定方法；实验室仪器。" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. KESM 相机与物镜聚焦控制装置。
<img alt="光谱学装置；光学激发；瞬态吸收测量；实验室设备。" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. KESM刀片组件及控制装置。
<img alt="光学显微镜装置；在焦与离焦成像对比；显微镜分析。" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 7"> 
图7. 通过观察端口进行初始对焦。
<img alt="发射分析光学系统界面；软件设置界面；光谱设置。" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 8"> 
图 8. KESM Stage Controller 2 应用程序（截图）。
<img alt="图像处理软件界面、序列加载、裁剪、重新布光设置、数据管理。" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 9"> 
图9. KESM 图像堆栈处理应用程序（截图）。
<img alt="用于分子结构渲染与分析的三维可视化软件界面。" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 10"> 
图 10. MeVisLab 应用程序（截图）。
<img alt="刀锋扫描小鼠脑显微镜，高尔基染色，横切面示意图。" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图11"> 
图11. KESM脑图谱：网络界面（截图）。
<img alt="微血管成像；脑切片 MRI；矢状面、水平面、冠状面及局部放大细节。" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 12"> 
图 12. KESM 全脑印度墨水数据。展示了 KESM 数据堆栈的血管数据集的体可视化结果。（a）血管数据的局部放大图，宽度约 100 µm。（b-d）小鼠全脑血管系统的三个标准视图（由高分辨率数据下采样获得），宽度约 10 mm。
<img alt="CT扫描视图；3D、矢状面、冠状面、水平面。医学影像分析、解剖学、诊断工具。" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图13"> 
图13. KESM全脑小鼠高尔基染色数据。
<img alt="神经元结构；浦肯野细胞、小脑、皮层、锥体细胞；显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图14"> 
图14. KESM 高尔基数据细节。
<img alt="3D脑部扫描切片；图A-D；MRI成像；大脑结构分析。" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图15"> 
图15. KESM全脑尼氏染色数据。（a）尼氏染色数据的局部放大图，约300 µm3。（b-d）全小鼠脑尼氏染色数据的三个标准视图（由高分辨率数据降采样获得）。显示横截面以清晰展示内部结构。

<ol><li>Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbbott%2C+LC+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).</li>
<li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
<li>Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+submicrometer+scans+of+mouse+brain+microstructure%3A+Neurons+and+vasculatures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22%5BJournal%5D)">Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22High-Throughput+Image+Reconstruction+and+Analysis%3A+Intelligent+Microscopy+Applications%22">High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications</a>. Ravi Rao, A., Cecchi, G. , Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+out+the+octopus+connectome+at+submicron+resolution+using+the+knife-edge+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope.</a> BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).</li>
<li>Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).</li>
<li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li>
<li>McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).</li>
<li>Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+connectome%3A+A+structural+description+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li>
</ol>

Todd Huffman 供职于 3Scan，这是一家生产和销售 KESM 技术（美国专利 #6,744,572）的商业公司。

KESM 能够对大体积生物样本（约 1 cm3）进行亚微米级的全面扫描。此类体积足以容纳完整的小型动物器官，例如脑、肺、心脏、肾脏等。对这些器官进行扫描所获得的图像，可提供前所未有的关于器官结构组织的定量信息，并能够实现对器官多种功能特性进行计算建模，包括神经环路与网络动态、电学特性、流体与气流动力学以及肌肉动力学。
本文详细阐述的样本制备流程和分析后处理流程，有望帮助外部研究团队更便捷地使用KESM及其所产生的数据。KESM操作流程将帮助这些外部研究人员充分理解这一独特成像模式的优势与局限性。

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

样本制备、成像与刀锋扫描显微镜分析方案

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

高通量、高分辨率的三维显微成像技术的显著进展，使得在亚微米分辨率下获取大量神经解剖学数据成为可能。最早能够产生全脑尺度数据的仪器之一是刀锋扫描显微镜（Knife-Edge Scanning Microscope, KESM）7, 5, 9，该设备由作者所在实验室研发并运行。KESM 已被用于对整只小鼠大脑进行亚微米分辨率的切片与成像，揭示了神经元网络（高尔基染色）1, 4, 8、血管网络（印度墨水灌注）1, 4以及细胞体分布（尼氏染色）3的精细结构。KESM 的应用不仅限于小鼠或大脑组织。我们已成功成像了章鱼脑6、小鼠肺和大鼠脑，并正在开展对整只斑马鱼胚胎的成像工作。此类数据可极大推动连接组学10研究、微循环与血流动力学研究，并通过提供精确的真实参考数据，助力体视学研究。
本文将介绍完整的工作流程，包括样本制备（固定、染色和包埋）、KESM 配置与设置、使用 KESM 进行切片与成像、图像处理、数据准备以及数据可视化与分析。重点将放在样本制备以及所获得 KESM 数据的可视化与分析上。我们期望本文提供的详细实验方案有助于扩大 KESM 技术的可及性，并提升其应用范围。

本文描述了从脑组织样本制备，到使用刀刃扫描显微镜进行连续切片成像，再到数据可视化与分析的完整流程。该技术目前用于获取小鼠脑部数据，但也适用于其他器官和其他物种。

高通量、高分辨率三维显微成像技术的重大进展使得获取大量神经解剖学数据成为可能

本实验的总体目标是演示如何制备生物样本，以便在刀片边缘扫描显微镜（KESM）下进行切片和成像，并可视化所获得的图像堆叠数据。该过程首先通过固定、染色和包埋组织，使其适用于KESM成像；第二步是配置KESM系统，并利用自动化控制软件进行切片与成像操作。随后对获得的图像进行去噪、配准和裁剪。最后一步是在基于网络的图谱和三维可视化软件中加载并浏览数据集。最终可获得能够显示全脑水平下亚微米分辨率的神经元和血管结构的结果。与现有的介观成像技术（如连续块面扫描电子显微镜）相比，该技术的主要优势在于能够对更大体积的样本进行成像，尽管分辨率相对较低。该方法有助于回答连接组学及神经科学领域中的关键问题。此技术可揭示大脑的结构组织特征，同时也可应用于肺、肾等其他器官系统。开始此操作时，将解剖得到的小鼠脑组织放入含有高尔基-考克斯溶液的玻璃瓶中。将玻璃瓶置于避光盒内，在室温下放置10至16周。由于高尔基-考克斯溶液本身具有固定作用，因此无需单独进行固定步骤。10至16周后，于次日在避光条件下用去离子水浸泡脑组织过夜。随后将清洗后的脑组织置于含5%氢氧化铵的去离子水溶液中，在室温避光环境下浸泡7至10天。7至10天后，在室温下用去离子水再次清洗脑组织4小时。然后通过梯度乙醇溶液对脑组织进行脱水处理，每种浓度溶液中放置24小时，分别为4°C下的50%乙醇、70%乙醇和85%乙醇。在室温下用95%乙醇换液三次，再用100%乙醇换液四到五次。接着将脱水后的脑组织置于丙酮中，每天更换一次，共更换三到四次。此后，将脑组织依次置于冰箱中过夜，分别使用aite与丙酮比例为1:2、1:1和2:1的aite-丙酮混合液。最后将脑组织置于100% aite中，放入冰箱，每次过夜更换一次，共更换三次。处理后的脑组织随后包埋于100% aite中，并在60摄氏度下加热三天。最后，将固化好的样本块用环氧树脂固定在金属样本环上，并根据需要修整样本块的侧面，以开始此操作步骤。确认小鼠已深度麻醉，且对脚趾挤压无反应。随后，使用室温磷酸盐缓冲盐水经心脏灌注小鼠，接着灌注冷的含4%磷酸盐缓冲的多聚甲醛。然后，用0.1%硫堇染料溶于去离子水的溶液对小鼠进行灌注。之后，将尸体置于 4 °C 冰箱中保存 24 小时。24 小时后，取出大脑，放入新鲜的 0.1% 硫堇溶液中，并在 4 °C 下保存 7 天。七天后，通过梯度乙醇系列对脑组织进行固定和脱水。在六周的时间内，依次在50%乙醇中放置3至5天，70%乙醇中7至10天，85%和95%乙醇中各约两周，其余时间置于100%乙醇中。在室温下用丙酮更换三次后，将脑组织包埋于环氧树脂塑料中，并置于60摄氏度烘箱内聚合。开始使用印度墨水对血管网络进行染色时，首先通过观察小鼠是否缺乏足趾回缩反射来确认其已处于深度麻醉状态。随后，经心脏灌注室温的磷酸盐缓冲盐水，接着灌注室温的10%中性缓冲甲醛。通过全身灌注盐水和固定液，可清除心血管系统中的血液并固定组织。接下来，用 3.0 ccs 未稀释的印度墨水对小鼠进行灌注。使用印度墨水是为了完全填充心血管系统的血管网络。从小鼠体内取出脑组织后，将其通过一系列梯度乙醇脱水，然后包埋于环氧树脂塑料中。按照之前展示的KESM成像设置步骤，打开相机、照明光源和载物台，升起刀片和物镜。接着安装样品环。然后降低物镜和刀片。测量样本尺寸，然后为KESM切片机控制器创建配置文件。在初始化切片机之前，需运行两个应用程序，分别将KESM的刀片和物镜抬起。启动KESM阶段控制器二并初始化载物台。然后降低刀片和物镜，并打开泵。通过旋转光学系统上的调焦旋钮，并调整相机相对于刀片边缘的视野，来对物镜和相机进行对焦。单击，逐步检查成像和切片的前几个步骤，然后单击“开始”，以启动成像和切片，用于图像处理。运行 KESM 图像栈处理器，以去除光照伪影并标准化所有图像的背景强度。对所有数据子文件夹重复此操作。要使用 KESM 脑图谱可视化数据，请访问此网站并选择相应的图谱以进入不同的深度。从下拉菜单中选择每步移动的深度，然后点击加号以增加或点击减号以减小Z轴深度。其他选项包括使用KESM脑图谱进行放大或导航。使用下拉菜单调整叠加层数量和叠加间隔，以通过VIS实验室工具可视化数据。启动应用程序，创建一个新项目。该项目应包含从二维文件生成三维、设置世界矩阵算术为一，以及查看三维连接。按此顺序，在按下鼠标右键的同时，应在查看三维界面中设置相应的参数。移动鼠标可调整阈值，以裁剪相应区域。当方向改变、照明条件改变或背景开启与关闭时，均可进行调整。以下视频片段展示了具有代表性的KESM结果，首先显示的是KESM的体可视化图像，即用于血管数据集的全脑印度墨水数据堆栈，起始部分为血管数据的特写，宽度约为100微米。这段KESM全脑印度墨水数据的第二段视频展示了小鼠全脑血管系统的三个标准视角，数据来源于高分辨率图像，宽度约为10毫米。包括矢状面视图、冠状面视图和水平面视图，以及沿冠状面切片的穿行动画。KESM。本视频片段展示了小鼠全脑高尔基染色数据，沿三个不同切片平面进行穿行演示，依次呈现组织块整体视图、矢状面视图、冠状面视图和水平面视图。接下来展示的是小鼠全脑KESM GoGy数据的更多细节。第一个视频片段显示了小脑和浦肯野细胞。第二个片段展示了大脑皮层和顶内侧细胞。最后是KESM。这两个视频片段展示了全脑nle数据。首先显示的是NLE数据的特写。此第二个视频展示了从小鼠全脑 Nle 数据中从高分辨率数据下采样得到的三个标准视图。此外，还显示了一个横截面，以清晰呈现发育后内部结构。该技术为神经科学领域的研究人员探索小鼠大脑中的神经元和血管网络铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解刀刃扫描显微镜的样品制备、成像及数据分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

刀口扫描显微镜的样品制备，图像和分析协议

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利用扫描电子显微镜观察离解组织以可视化细胞外基质

本文描述了一种方法，即利用量子点（QD）纳米颗粒对环氧树脂包埋的人类病理组织进行相关免疫细胞化学研究。我们采用 commercially available...

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通过扫描透射电子断层成像技术制备与观察厚生物样品

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一种用于透射电子显微镜下获取微生物连续超薄切片的方法

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高压冷冻、微波辅助对比度增强及最小树脂包埋的生物样本制备用于体积成像

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本方案概述了一种使用连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）的常规方法，SBF-SEM是一种强大的三维成像技术。SBF-SEM的成功应用依赖于适当的固定和组织染色技术，以及对成像参数的仔细设置。本方案涵盖了该过程各个阶段的实用注意事项。...

生物组织样本的连续块面扫描电子显微镜成像（SBF-SEM）

我们介绍了一种名为光学多层干涉断层成像（Optical Multilayer Interference Tomography,...

一种与扫描电子显微镜兼容的光学成像方法用于介观全细胞脑图谱绘制

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