使用细胞色素线粒体呼吸功能的可视化 C氧化酶/琥珀酸脱氢酶（COX / SDH），双标组织化学

该程序的总体目标是允许直接观察新鲜冷冻组织切片中的线粒体呼吸酶缺陷。这是通过首先从感兴趣的器官收集低温恒温器切片来实现的。该程序的第二步是执行 Cox Histo 化学，然后是 SDH Histo 化学。

最后，将组织切片脱水、封片并盖玻片。最终，结果可以通过细胞蓝色染色的量来显示线粒体功能障碍的量。Hi.Today 我们将讨论 Cox SCH 双标记组织化学技术。

虽然这种方法可以应用于研究线粒体疾病，但它也可以提供对衰老和与年龄相关的疾病的见解。从根据道德许可处死的动物身上取出大脑后，将其在干冰上快速冷冻。冷冻组织可以保持在零下 80 摄氏度，用铝箔包裹，直到准备好切片。

通过将大脑放在低温恒温器卡盘上并用包埋化合物包围它来准备用于冷冻切片的组织。将卡盘快速放入低温恒温器中，并在零下 21 摄氏度下收集 14 微米的切片。使用加热块将切片解冻到载玻片上，然后让载玻片在室温下干燥 1 小时。

将载玻片放入带有湿纸条的载玻片染色室中。由于反应时间在该检测中很重要，因此建议在化学罩下每个实验最多处理 10 张玻片。在 PBS 中制备含有 dab 和细胞色素 C 的孵育培养基并涡旋。

向培养基中快速添加 2 μg 牛 CDE，涡旋混合均匀。要打碎所有仍在引擎盖下工作的 CDE 颗粒，请使用移液器吸头将 150 至 200 μL 孵育培养基涂抹到每张载玻片上，使其均匀涂抹在所有切片上。将玻片在 40 摄氏度下孵育 37 分钟。

40 分钟后，从玻片上去除孵育培养基。用 PBS 洗涤玻片 4 次，每次 10 分钟。清洗载玻片后，将它们放回载玻片染色室，并在化学罩下使用湿纸条。

在 PBS 中制备 NBT 溶液，注意保护 PMS 免受光涡旋的影响，使用移液器吸头将 150 至 200 微升 NBT 溶液快速涂抹到每张载玻片上，使其均匀涂抹在所有切片上。40 分钟后，将载玻片在 37 摄氏度下孵育 40 分钟，从载玻片上去除多余的溶液。用 PBS 洗涤玻片 4 次，每次 10 分钟。

载玻片在以下顺序浓度的乙醇中脱水各 2 分钟。70%70%95%95% 和 99.5%最后，以额外的 99.5% 步骤放置 10 分钟。将玻片放入二甲苯中 10 分钟，用 LAN 封片并盖上盖玻片。

让载玻片干燥过夜或在通风处干燥至少 1 到 2 小时。野生型和过早衰老的脑切片。山。DNA 突变小鼠依次标记 COX 和 SDH 活性。

在野生型小鼠的海马体中可以看到深棕色染色表明的正常 Cox 活性。在 12 周和 46 周时，在 MT DNA 突变小鼠的海马体中发现了蓝色染色指示的 Cox 缺陷。在 M-T-D-N-A 突变小鼠中，到 46 周龄时 Cox 活性进一步降低，表明呼吸链功能障碍的广泛恶化。

10 分钟和 25 分钟的孵育时间不足导致棕色 dab 反应产物的沉积减少。缩短的孵育时间允许在 SDH 孵育期间形成蓝色 Foran 终产物，误导性地表明存在 COX 缺陷覆盖滑落的细胞。COX 孵育过程中的玻片也会导致 DAB 反应产物的形成和沉积不准确。

尽管 Cox 和 SDH 活性可以如图所示单独标记，但顺序标记已被证明有利于定位具有线粒体功能障碍的细胞。野生型小鼠大脑中 COX 和 SDH 活性的特异性对照示例显示负标记。因此，不要忘记，使用 Cox SCH 双重标记中的化学品是极其危险的化学方案，每次进行此分析时，都应采取预防措施，例如穿着适当的实验室服装和在化学罩下工作的口罩，以及处理孵育培养基。