使用光刺激神经元的负担得起的LED阵列

该程序的目标是准备和远程作 LED 阵列以控制脑切片中的神经活动。这是使用带有通道 REDSIN 两个表达神经元的动物的体外切片，并使用 LED 阵列与显微镜一起激活这些神经元来实现的。本视频介绍了如何校准 LED 和显微镜，以将已知强度的光传递到切片室。

通过这种设置，可以通过对表达通道 Opin 2 的神经元进行宽场刺激，准确测量表达通道 2 的神经元的激活阈值，以响应光刺激。该技术允许对大量神经元群进行临时精确的光学控制。与现有的光遗传学方法（包括使用激光或基于快门的方法的方法）相比，该技术的主要优点是它非常便宜，并且可以很容易地安装到现有的膜片钳内窥镜上。

这种方法可以帮助回答成人神经发生领域的关键问题，包括活动如何塑造新神经元融入成人大脑。这项技术的影响延伸到基于成体神经干细胞的治疗或诊断，因为它提供了对成年出生神经元整合到现有神经回路中的活动的精确时间控制。虽然这种方法可以深入了解成体神经发生的功能后果，但它也可以在任何体外制备中进行。

包含表达通道采用的神经元 首先选择一个 LED 阵列，该阵列可在所需波长下产生其峰值功率。此外，选择具有最大额定电流的阵列。将 LED 阵列集成到显微镜中。

首先，使用导热膏将 LED 阵列连接到称为散热器的风扇上，以提高散热器的效率。然后从镜头组件中取出低功率原装 LED，并将高功率 LED 固定到镜头上。现在，将 Brightfield 灯更换为组装好的 LED 设备，并确保风扇牢固地接地到系统的公共接地。

需要仔细定位 LED 阵列，以确保呼叫的光线与目标一致。目的。通过聚焦聚光镜来实现科勒照明，使视场光阑的图像聚焦在切片室上，并在物镜光路下居中。一张薄薄的镜头纸组织可以帮助将后光圈的图像聚焦在其他深度。

现在，在不透明材料上钻已知直径的针孔，该材料可以用作功率计的孔径。将其中一个小针孔放在光功率计的传感器上。然后将功率计固定在显微镜上，将聚光镜对准针孔。

手动定位功率计，直到它给出最大读数。将功率计固定在此位置。如果功率计最大值高于切片平面，则在该平面上重新建立 Kohler 照明。

接下来，完全打开所有孔。使用载物台纵器系统地相对于光路移动功率计。完成后，通过在最大功率周围的网格中系统地获取功率读数来测量照明区域内光功率的均匀性，该功率应位于物镜的焦点下，显微镜设置得适当，以物镜焦点为中心的较冷照明，阵列的最大功率应在焦点之外的该焦点区域，现在应根据均匀性获得已知的功率情节。

现在，通过了解用于使每个针孔的光功率作为针孔面积的函数的钻头直径来测量每个尺寸针孔的最大功率。由于钻孔的针孔并不完美，因此平均这些值将产生良好的光功率密度估计值。LED 阵列将用于修补光学元件。

确保在构建功效图和均匀性图时考虑修补所需的所有光学元件。例如，许多显微镜都有一个可翻转的扩散器屏幕，您可以使用它来牺牲功率以保证均匀性。使用标准方法制备脑组织切片，同时让切片在加热的 A CSF 中恢复 30 至 45 分钟，然后制作贴剂移液管。

组织恢复后，在含氧 A CSF 的持续灌注下，轻轻地将切片放入显微镜的记录室中。在荧光照射下通过落射荧光确认 EYFP 通道 redsin 两个通道的存在。在切片中找到一个具有成熟形态的健康通道两个 EYFP 神经元。

然后在修补光学元件下找到这个神经元胞体，并在质膜和贴片电极壁之间产生千兆欧姆密封。如果电极与尖峰神经元充分接近，即使没有千兆欧姆密封，自发活动也应产生可测量的局部场电位。现在，激活通道通过闪烁不同剂量的光来在这个神经元中采用两个，因为光剂量是 LED 功率和持续时间的函数，计算在多个功率和持续时间下需要多少光才能唤起动作电位。

奥林巴斯 BX 51 wi 显微镜配置了一个带有两个孔径的 LED 内联 LED 和一个聚光镜。通过关闭场光阑和孔径光阑，获得了用于膜片钳记录的足够明场对比度。在虚线圆圈指示的物镜视场周围的区域构建了 LED 光强度的均匀性图。

在所有隔膜完全打开的情况下，切片器暴露在最大光功率下以激活通道adoptin 。这种配置产生的光比用于膜片钳可视化的配置强三个数量级。在喙部迁移流中迁移的神经母细胞慢病毒感染后 4 周观察到成人出生的嗅球颗粒和肾小球神经元的广泛标记。

来自单个出生通道 Adoptin 两个 EYFP 表达颗粒细胞的松散补丁记录表明，对于该神经元，以最大功率进行 5 毫秒的刺激就足以引起尖峰。一旦掌握，这项技术可以在一个下午完成。重要的是要记住，在此过程之后，要始终监测您的设备和设置是否随时间漂移 自开发以来，这种光遗传学技术为神经科学领域的研究人员探索许多模式生物（如蠕虫、蝇鼠甚至灵长类动物）中的突触传递和整合铺平了道路。