量化活性 顺式-利用外植体电穿孔技术研究小鼠视网膜中的调控元件

本实验的总体目标是通过电穿孔法将带有荧光转录报告基因的小鼠视网膜植入物导入，并定量其表达水平。该过程首先通过解剖分离新生小鼠的视网膜组织；第二步是利用携带荧光标记的DNA报告基因构建体对视网膜进行电穿孔处理。

该实验步骤的第三步是将电穿孔后的视网膜作为移植组织培养八天。最后一步是收获视网膜外植体并定量分析荧光报告基因的表达水平。最终，可通过视网膜外植体电穿孔结合定量数据分析，获得显示不同启动子报告基因构建体在发育中 小鼠视网膜中相对表达水平的结果。

我叫 Joe Corbo，是圣路易斯华盛顿大学医学院病理学与免疫学系的一名教职人员。今天我们将展示一个视频实验方案，演示将 X explan 电穿孔技术应用于新生小鼠视网膜，以定量分析光感受器特异性顺式调控元件（CYS regulatory elements）的活性。本实验方案将由我实验室的一名研究生 Cindy Montana 进行演示。首先，用 70% 乙醇对电穿孔腔室及所有器械进行灭菌，为眼球采集做好准备。

用乙醇对双手手套和实验台面进行消毒，并在整个操作过程中保持无菌条件。接下来，在组织培养超净台内，用移液器将六毫升解剖培养基加入一个无菌的60毫米培养皿中，再将三毫升培养基分别加入两个无菌的35毫米培养皿中。回到实验台后，用70%乙醇对新生小鼠幼崽的头部和颈部进行消毒。

使用剪刀快速剪下头部后，将头部转移至无菌的100毫米培养皿中，在解剖显微镜下用小剪刀剪除头皮以暴露眼睛。用弯头镊子轻轻将眼球从眼眶中取出，然后放入含有解剖培养基的35毫米培养皿中。继续收集眼球，使每份待电穿孔的DNA样品对应3至4个眼球，并在操作完成前将眼球和解剖培养基保持在室温条件下。

用70%乙醇对剃须刀片和无菌塑料移液管的包装进行消毒，然后用刀片将移液管尖端切去足够高度，以便能够吸取整个眼球。在解剖显微镜下高倍镜视野中，使用扩大的移液管将一个眼球从35毫米培养皿转移至60毫米培养皿。用精细镊子去除眼球表面的组织，例如眼外肌和脂肪。

然后在视神经根部将其夹断以移除视神经。为了分离视网膜，可在巩膜的角膜缘处刺一个小孔，巩膜和视网膜色素上皮相对于呈哑光灰色的视网膜组织显得有光泽。将两对镊子的各一个尖端插入该孔中，并轻轻撕开巩膜和视网膜色素上皮（RPE）。

务必保持晶状体原位。使用加宽的移液管将分离出的视网膜转移至第二个含有培养基的35毫米培养皿中。收集所有视网膜，并将其置于37°C的组织培养孵育箱中保存。

在组织培养罩内进行电穿孔操作之前，针对每种需要电穿孔的DNA Eloqua，准备一个无菌的35毫米培养皿并加入解剖液，另取一个培养皿加入培养液。使用P200移液器，用无菌1×PBS将电穿孔培养皿中的腔室冲洗3次。向腔室中加入60 µL的DNA分装液，将未使用的腔室加入60 µL的1×PBS填满。

将电极连接到电穿孔培养皿上，并在电穿孔仪上设置适当的参数。用精细镊子夹住视网膜的晶状体部位，将其转移至电穿孔腔室中，每个腔室内可放置最多四个视网膜。

将视网膜排列好，使晶状体紧靠连接正极的金属条。每次在不同电穿孔腔之间操作时，用镊子擦拭干净，以避免DNA从一个腔室带到下一个腔室。当所有视网膜均排列完毕后，按下电穿孔仪的启动按钮。

在连接负极的金属棒上应形成微小气泡。使用镊子断开电极并关闭电泳仪。轻轻将视网膜从室壁移开。

将视网膜从孵育 chamber 转移至含有解剖液的 35 毫米培养皿中。使用无菌移液管，将视网膜从解剖液转移至含有培养液的 35 毫米培养皿中。标记无菌六孔培养板的各孔，并向每孔加入 3 毫升培养液。

使用无菌镊子将圆形沃特曼（Watman）核滤膜轻轻放置于每个孔中培养基的液面上，滤膜光面朝上。在解剖显微镜辅助下，用无菌移液管将一片视网膜转移至滤膜上，确保其透镜面朝下。若视网膜着落时透镜面朝上，应将其重新吸入移液管中并再次尝试。

每个孔中放置的视网膜不超过四个，并将其置于独立的液滴中。视网膜放置于孔中后，将培养板转移至37°C组织培养孵育箱中，培养所需时间。通常培养八天后，成功的电穿孔可在视网膜表面四分之一至三分之一范围内观察到DNA构建体的表达。

通过比较均匀电穿孔区域（表达CRE构建体）与视网膜外区域的荧光水平，并归一化至对照GFP表达，来定量荧光水平。特别是视杆光感受器被高效转导，如图所示。以下是电穿孔实验的结果，其中两个视杆细胞特异性启动子驱动GFP和DS红在外界核层中的表达。

通过将这两种表达模式与此处以蓝色显示的 DPI 染色结果叠加，可以明显看出光感受器特异性表达。在透明层或神经节细胞层中均未观察到表达。观看本视频后，您应能够清楚了解如何分离、电转并培养小鼠视网膜外植体，以定量分析视网膜囊性调节元件的活性。

感谢观看，祝您的实验顺利。