量化的活动顺调控元件外植体电穿孔
June 28th, 2011
本协议描述了一个简单而廉价的方式来量化的顺式调控元件的活动（即，增强/促销员）通过外植体电小鼠视网膜生活。 DNA的制备，视网膜剥离，电，视网膜外植体文化，和固定后的分析和定量描述。
该程序的总体目标是用荧光转录报告基因电净化小鼠视网膜植入物并量化其表达水平。这是通过首先通过解剖分离新生小鼠视网膜组织来实现的。该程序的第二步是用荧光 DNA 报告基因构建体对视网膜进行电击。
该程序的第三步是将电穿孔视网膜作为植入物培养 8 天。该程序的最后一步是收集视网膜外表并量化荧光报告基因的表达水平。最终，可以通过 x exclear 电穿孔获得显示发育中的小鼠视网膜中不同启动子报告基因构建体的相对表达水平的结果，然后进行定量数据分析。
我叫 Joe Corbo，是圣路易斯华盛顿大学医学院病理学和免疫学系的一名教员。今天，我们将展示一个视频方案，演示 X 外电穿孔到新生小鼠视网膜中的技术，以量化光感受器特异性 CYS 调节元件的活性，并演示该方案，来自我实验室的研究生 Cindy Montana。首先用 70% 乙醇对电穿孔室和所有仪器进行消毒，以准备眼睛采集。
用乙醇对手套和工作台进行消毒，并在整个过程中保持无菌条件。接下来，在组织培养罩中，将 6 毫升解剖培养基移液到一个无菌 60 毫米培养皿中，将 3 毫升培养基移液到两个无菌 35 毫米培养皿中。回到工作台上，用 70% 乙醇对新生小鼠幼崽的头部和颈部进行消毒。
用剪刀快速斩首后，将头部转移到无菌的 100 毫米培养皿中，用小剪刀切掉头皮，在解剖显微镜下露出眼睛。使用弯曲的镊子，轻轻地将眼睛从眼眶中舀出，然后将眼睛放入装有解剖的 35 毫米培养皿中。中等。继续收集眼睛，使每等分试样的 DNA 有 3 到 4 只眼睛进行电穿孔，将眼睛和解剖培养基保持在室温下直至完成。
用 70% 乙醇对剃须刀片和无菌塑料移液管的包装纸进行消毒，然后使用剃须刀片将移液器的尖端切掉足够高，以便可以移液整个眼睛。使用加宽的移液器在解剖显微镜下以高功率将一只眼睛从 35 毫米培养皿转移到 60 毫米培养皿。使用细镊子从眼睛表面去除任何组织，例如眼外肌和脂肪。
然后通过在底部捏掉视神经来去除视神经。为了隔离视网膜，在角膜缘的巩膜上戳一个小洞，巩膜和视网膜色素上皮相对于视网膜组织显得有光泽，这就是马特格雷。将两对镊子的一个插叉插入孔中，轻轻撕开巩膜和 RPE。
请务必将镜头留在原位。使用加宽的移液器将解剖的视网膜移动到第二个含有培养基的 35 毫米培养皿中。收集所有视网膜并将它们储存在 37 摄氏度的组织培养箱中。
在组织培养罩中对每个要电穿孔的 DNA Eloqua 进行电穿孔之前，用解剖培养基填充一个无菌 35 毫米培养皿，用培养基填充第二个培养皿。使用 P 200 移液器，用无菌 1 XPB S3 清洗电穿孔培养皿中的腔室。用 60 μL DNA 等分试样填充腔室，并用 60 μL 的 1 XPBS 填充任何未使用的腔室。
将电极连接到电穿孔皿，并在电介质上输入适当的设置。使用细镊子通过晶状体抓住视网膜并将其转移到电穿孔室中。在每个腔室中放置最多四个视网膜。
布置视网膜，使晶状体靠在连接到正极的金属棒上。擦拭每个腔室之间的镊子，以避免 DNA 从一个腔室携带到另一个腔室。所有视网膜对齐后，按电上的开始。
连接到负极的金属棒上应形成微小气泡。断开电极并使用镊子关闭电。轻轻地将视网膜从腔室壁上移开。
将视网膜从腔室转移到含有解剖培养基的 35 毫米培养皿中。使用无菌移液管，将视网膜从解剖培养基转移到含有培养基的 35 毫米培养皿中。标记无菌 6 孔培养板的孔，并在每个孔中填充 3 毫升培养物。中等。
使用无菌镊子将圆形 Watman Nucleo 过滤器漂浮在每个孔的培养基顶部，过滤器的光亮面朝上。在解剖镜的帮助下，用无菌移液管镜片面朝下将单个视网膜转移到过滤器上。如果视网膜晶状体正面朝上，请将其拉回移液器中，然后重试。
在每个孔中放置不超过四个视网膜，并将它们保存在单独的液滴中。将视网膜放入孔中后，将培养板移至 37 摄氏度的组织培养箱中，并生长所需的时间。通常 8 天 Here is successful 电穿孔导致 DNA 构建体在视网膜表面的四分之一到三分之一处表达。
通过将表达 CRE 构建体的均匀电穿孔区域与视网膜外的区域进行比较，然后归一化以控制 GFP 表达来量化荧光水平。特别是杆状光感受器被有效地转导显示。以下是电穿孔的结果，其中两个杆特异性启动子驱动 GFP 和 DS red 在外核层的表达。
通过将两种表达模式与 DPI 染色叠加，此处以蓝色显示，光受体特异性表达是显而易见的。在 interclear 层或神经节细胞层中均未观察到表达。观看此视频后，您应该对如何解剖小鼠视网膜外植体的电和培养以量化视网膜囊肿调节元件的活性有一个很好的了解。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本协议描述了一种通过离体电穿孔法来量化活体小鼠视网膜中顺式调控元件活性的方法。它详细说明了DNA制备、视网膜解剖、电穿孔和随后的分析过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 电生理学
背景
- 顺式调控元件在基因表达中起着关键作用。
- 了解它们在视网膜细胞中的活性可以提供对视觉过程的洞察。
- 本协议利用电穿孔将DNA构建体引入视网膜组织。
- 荧光报告基因允许可视化基因表达水平。
研究目的
- 量化小鼠视网膜中荧光转录报告基因的表达水平。
- 展示电穿孔在将DNA传递到视网膜组织中的有效性。
- 分析光感受器细胞中特定启动子构建体的活性。
使用的方法
- 通过解剖分离新生小鼠视网膜组织。
- 用荧光DNA构建体对视网膜组织进行电穿孔。
- 培养电穿孔后的视网膜八天。
- 使用荧光分析来量化表达水平。
主要结果
- 成功的电穿孔导致了在视网膜表面的大部分区域表达。
- 通过比较电穿孔区域与对照区域来量化荧光水平。
- 视锥光感受器对DNA构建体的转导效率很高。
- 不同启动子的表达模式被可视化并分析。
结论
- 本协议提供了一种研究视网膜细胞基因调控的可靠方法。
- 电穿孔是将遗传物质传递到小鼠视网膜的有效技术。
- 结果有助于理解顺式调控元件在视网膜发育中的作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying cis-regulatory element activity in living retinal tissue enables mechanistic de-risking of transcriptional targets in neuroscience drug discovery. This approach provides quantitative, spatiotemporally resolved data that supports target validation and phenotypic screening in disease-relevant systems. By reducing reliance on non-quantitative transgenesis, it improves predictive confidence in early discovery decisions for retinal and neurodegenerative pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses by measuring enhancer/promoter activity in native retinal tissue.
- Operational Value: Provides quantitative readouts that clarify dose-response relationships of cis-regulatory elements.
- Predictive Value: Supports target de-risking by linking regulatory variation to gene expression in photoreceptors.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates normalized fluorescence data suitable for high-content screening of regulatory variants.
- Operational Value: Uses co-electroporated loading controls to normalize for transfection efficiency, improving assay reproducibility.
- Scalability: Enables side-by-side comparison of multiple promoter constructs in explanted tissue.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Measures activity of photoreceptor-specific cis-elements in a disease-relevant postnatal retinal model.
- Mechanistic Continuity: Bridges in vitro reporter assays with in vivo-like tissue context for target validation.
- Risk Mitigation: Reduces false positives by validating regulatory function in intact retinal explants.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits between target hypothesis generation and lead optimization, providing quantitative regulatory activity data to inform compound screening campaigns.
- Discovery Biology: Tests transcriptional regulatory hypotheses in postnatal mouse retina, a model of rod photoreceptor development.
- Screening: Produces fluorescence-based readouts enabling comparison of enhancer/promoter strength across constructs.
- Analytics: Delivers normalized quantitative output via fluorescence intensity ratios, supporting statistical comparison of regulatory activity.
- Translational Research: Uses rodent retina to model human photoreceptor gene regulation relevant to inherited retinal diseases.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for quantifying regulatory element activity across developmental timepoints or disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target mechanism by quantifying cis-regulatory function in native tissue.
- Operational Value: Standardizes assay conditions through explant culture and internal controls, reducing variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative insight into transcriptional regulation.
- Portfolio Impact: Enables prioritization of targets with validated regulatory drivers in photoreceptor pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal dissection, electroporation, and fluorescence microscopy.
- Dependent on sterile tissue culture facilities and electroporation equipment with chamber optimization.
- Needs standardization of DNA construct loading and incubation timing across experiments.
- Limited to postnatal retinal explants due to decreased electroporation efficiency in mature tissue.
- Relies on co-electroporated controls to normalize for variable transfection efficiency.
