Name: 量化的活动顺调控元件外植体电穿孔 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学习利用外植体电穿孔技术在小鼠视网膜中量化顺式调控元件活性。该方法通过荧光报告基因检测基因表达水平，为研究视网膜发育中的基因调控机制提供可靠手段。

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作者谨此感谢 Karen Lawrence 在描述电穿孔室构建部分所提供的帮助。

1. 电穿孔室的构建
<ol>
 <li>订购一个微载玻片，BTX Model 453，带有3.2 mm间隙（Harvard Apparatus #45-0105）（图2A）。金属导轨应完全密封在载玻片底部。</li>
 <li>使用Dremel工具从塑料微量离心管架上切下一个手柄，并将其切割成5个尺寸相同的小矩形块，每个尺寸为：长0.8 cm，高0.6 cm，宽0.3 cm（图2B）。这些塑料块为可重复使用的间隔物，用于在微载玻片腔室内成型单个加样孔。</li>
 <li>将塑料间隔物均匀地插入微载玻片金属导轨之间。间隔物应紧密贴合（图2C）。</li>
 <li>剪去P200移液器吸头的尖端，将其安装到3 ml注射器上，并用100%硅橡胶水族密封胶填充注射器。将密封胶填充至塑料间隔物之间的间隙中。填充时务必从底部向上填充，以避免密封胶塞与微载玻片基底之间产生气泡。</li>
 <li>在塑料间隔物上方放置一根金属棒，并用文件夹夹子固定，使间隔物在密封胶干燥过程中保持原位（图2D-E）。让密封胶过夜干燥。</li>
 <li>取下文件夹夹子、金属棒和塑料间隔物（图2F）。使用手术刀片清除金属导轨顶部的密封胶残留。使用解剖显微镜检查微载玻片，确保硅胶坝底部无气泡存在。清除加样孔内可能形成的密封胶薄膜，使加样孔内部暴露干净的金属表面。向其中一个加样孔加入水，检查水是否渗漏至相邻的加样孔。对所有加样孔重复此步骤。</li>
 <li>完成后的微载玻片可放入塑料培养皿中，其金属电极柱应靠近培养皿侧壁的窗口位置（图2G）；电极最终将连接至这些金属电极柱上。</li>
</ol>
2. DNA 制备
<ol>
 <li>将质粒DNA加入冰上的1.5 mL微量离心管中，并用蒸馏水将体积补至150 μL。可将多种质粒混合用于共电穿孔（例如，实验用DsRed载体和对照GFP载体）。计算加入管中的DNA量时，需注意DNA溶液的最终体积为60 μL。通常每种载体的终浓度为0.5 μg/μL。</li>
 <li>加入15 μL 3 M醋酸钠（pH 5.2）和450 μL 100%乙醇，沉淀DNA。反复颠倒或轻弹离心管数次以混匀。</li>
 <li>在4°C、13,200 rpm条件下离心30分钟，使DNA沉淀。用70%乙醇洗涤沉淀，再于4°C、13,200 rpm离心15分钟。将沉淀在空气中干燥至半透明状，约7分钟，然后重悬于54 μL无菌水中。加入6 μL无菌10× PBS（pH 7.4），混匀。</li>
</ol>
3. 眼球采集
<ol>
 <li>使用70%乙醇对电穿孔室和所有器械进行灭菌。眼球采集和解剖无需在组织培养罩内进行，但需用乙醇对实验手套和操作台面进行消毒，并在整个操作过程中尽量保持无菌条件。</li>
 <li>准备含有解剖培养基（DMEM:F12按1:1比例混合，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，0.29 mg/ml L-谷氨酰胺，以及5 μg/ml胰岛素）的培养皿：两个35 mm培养皿，每皿加入3 ml培养基，另准备一个60 mm培养皿，加入6 ml培养基。此步骤应在组织培养罩内完成。</li>
 <li>用70%乙醇对新生（出生后第0天）小鼠幼崽的头部和颈部进行消毒。用剪刀迅速剪下头部，并将头颅转移至无菌的100 mm培养皿中。</li>
 <li>用小剪刀剪除头皮以暴露眼球。使用弯头镊子轻柔地将眼球从眼眶中取出，并放入含有解剖培养基的35 mm培养皿中。建议在低倍解剖显微镜下进行眼球摘除操作，以提高效率。</li>
 <li>重复步骤3.3和3.4，直至所有眼球采集完毕。解剖过程中将眼球置于室温下的解剖培养基中保存。每份DNA样品需要3–4只眼球。</li>
</ol>
4. 视网膜解剖
<ol>
 <li>使用70%乙醇对剃须刀片和无菌塑料移液管的包装外表面进行消毒。用刀片切掉移液管的尖端，使其能够吸取完整的眼球。不使用时，将移液管保存在原塑料包装中。</li>
 <li>将一个眼球从35 mm培养皿转移至60 mm培养皿中。在解剖显微镜高倍镜下，使用精细镊子清除眼球表面的组织，例如眼外肌和脂肪组织。随后，在视神经基部将其夹断以去除视神经。</li>
 <li>为分离视网膜，需在角膜缘处的巩膜上刺一个小孔。将两把镊子的其中一个尖端插入该孔中（方向与视网膜表面相切），并轻轻撕开巩膜和视网膜色素上皮（RPE）。在白化小鼠中，巩膜和RPE相对于视网膜组织呈现光泽外观，而视网膜组织则为均匀的哑光灰色。在有色小鼠中，RPE呈黑色。操作过程中保留晶状体原位不动。</li>
 <li>使用移液管将已解剖的视网膜转移至另一含有培养基的35 mm培养皿中。</li>
 <li>重复步骤4.2至4.4，直至所有眼球均完成解剖。</li>
 <li>将分离的视网膜置于37°C细胞培养孵育箱中保存，直至准备进行电穿孔操作。</li>
</ol>
5. 电穿孔的准备
<ol>
 <li>准备35 mm培养皿中的培养基。每份待电穿孔的DNA样品需要一个解剖培养基培养皿和一个培养培养基培养皿（解剖培养基加10% FBS）。相应地标记培养皿。</li>
 <li>使用P200移液器和无菌1×PBS清洗电穿孔培养皿中的各个腔室。每个腔室容量为60–100 μL。每个腔室清洗三次。</li>
 <li>用DNA样品填充腔室。未使用的腔室应加入60 μL 1×PBS。将电极连接至电穿孔培养皿。</li>
 <li>电穿孔仪设置如下：模式，LV；电压，30 V；脉冲时长，50 msec；脉冲次数，5次；间隔时间，950 msec；极性，单极。</li>
</ol>
6. 电穿孔
<ol>
 <li>使用精细镊子夹住视网膜的晶状体，并将其转移至电穿孔室中。每个电穿孔室最多可容纳 3–4 个鼠视网膜（图 3）。</li>
 <li>使用镊子将视网膜排列整齐，使晶状体紧靠连接正极的金属条。每次转移后，用无尘纸（Kimwipe）清洁镊子，以避免 DNA 从一个电穿孔室带入下一个电穿孔室。</li>
 <li>当所有视网膜排列完毕后，按下电穿孔仪上的“开始”按钮。连接负极的金属条上应有微小气泡产生。</li>
 <li>断开电极连接，并关闭电穿孔仪。</li>
 <li>使用镊子轻轻将视网膜从电穿孔室壁移开。</li>
 <li>使用无菌移液管将视网膜从电穿孔室转移至含有解剖培养基的 35 mm 培养皿中。</li>
 <li>每个电穿孔室用无菌 1× PBS 清洗三次，然后用无菌水冲洗。用 70% 乙醇喷洒培养皿进行消毒。</li>
</ol>
7. 将视网膜置于滤膜上进行培养
<ol>
 <li>使用移液管将视网膜转移至含有培养基的35 mm培养皿中。</li>
 <li>标记一个无菌6孔培养板的各孔，并向每孔加入3 ml培养基。</li>
 <li>使用无菌镊子将圆形Whatman Nuclepore滤膜（光面朝上）放置于各孔培养基表面。</li>
 <li>在解剖显微镜下，使用无菌移液管将视网膜转移至滤膜上，确保晶状体面朝下。若视网膜晶状体面朝上，可用移液管将其拾起并重新放置。每个滤膜上放置的视网膜数量不得超过4个，并确保每个视网膜周围的培养液滴彼此分离。请注意，本实验在晶状体完整的情况下进行视网膜培养，尽管其他方案建议在此步骤前去除晶状体9。</li>
 <li>将培养板置于37°C细胞培养箱（5% CO2）中，培养所需时间，通常为8天。根据我们的经验，在8天培养期间无需更换培养基，但若培养时间更长，则可能需要更换培养基。</li>
</ol>
8. 荧光标记视网膜外植体的收获与平铺制片
<ol>
 <li>用 4% 多聚甲醛 / 1× PBS 更换每孔中的培养基。若视网膜仍黏附在滤膜上，可用镊子将滤膜翻转，轻轻剥离视网膜。室温下用多聚甲醛固定 30 分钟。避光保存视网膜，以防止荧光淬灭。</li>
 <li>用1× PBS将视网膜冲洗两次，每次10分钟。</li>
 <li>使用一次性移液管将视网膜转移至载玻片上的少量 PBS 液滴中。在荧光解剖显微镜下，用镊子翻转视网膜，使其电穿孔面朝上（即，镜头朝下。</li>
 <li>在载玻片的四个角放置由破碎盖玻片制成的玻璃“支脚”（直径约1-2 mm的玻璃碎片），这些支脚可防止视网膜被压平。将一片完整的玻璃盖玻片覆盖在载玻片上，使其覆盖视网膜并 resting 在支脚上。如有必要，可用移液器在载玻片与盖玻片之间添加更多PBS。</li>
</ol>
9. 平铺样本中荧光的成像与定量
<ol>
 <li>使用配备单色相机的荧光体视显微镜，在4倍物镜下以红色和绿色通道对平铺的视网膜进行低倍成像。所有视网膜样本在相同荧光通道下的成像必须采用相同的曝光时间，以便比较荧光强度。确保任何图像中的像素均未饱和，否则将无法实现准确的定量分析。以灰度TIFF格式导出图像。</li>
 <li>打开一个视网膜的图像集（即..，在 ImageJ 软件中使用红色通道和绿色通道）<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>）。为本教程起见，绿色荧光通道（GFP蛋白）为对照构建体，在实验中所有视网膜样本中保持恒定；红色荧光通道（DsRed蛋白）为实验构建体，随每组视网膜样本而变化。图像应为灰度模式。</li>
 <li> 在 ImageJ 中，选择对照绿色图像，并设定一个直径为 100 单位的感兴趣圆区域（Analyze/Tools/ROI manager/More/Specify）。复制该圆区域（ROI manager/Add），共创建八个圆。移动圆 1-5，使其覆盖五个电穿孔均匀的区域，避开视网膜外缘及晶状体上方区域图 4A）。此外，选择视网膜/晶状体外的三个区域（圆圈6-8）以测量背景荧光。选择红色图像，在ROI管理器中取消勾选“显示全部”框，然后重新勾选该框，八个圆圈均应显示在红色图像上。在ROI管理器中取消选中所有圆圈坐标。</li>
 <li>选择红色图像后，记录所有感兴趣区域（ROI manager/Measure）的平均像素值；测量结果1-8将显示，其中1-5为红色视网膜测量值，6-8为红色背景测量值。选择绿色图像并记录其平均像素值；测量结果9-16将显示，其中9-13为绿色视网膜测量值，14-16为绿色背景测量值。将测量数据复制到Excel中进行分析（图 5).</li>
 <li>对红色和绿色通道的三个背景测量值分别取平均值。将红色通道中每个视网膜区域的五个测量值减去红色背景平均值；绿色通道同理操作。对于每个视网膜感兴趣区域，将红色通道扣除背景后的测量值除以绿色通道扣除背景后的测量值，以将实验用红色信号水平归一化至对照用绿色信号水平（图 5).</li>
 <li>测定给定 DsRed 构建体的所有归一化测量值的平均值和标准差例如，每个视网膜测量5次，共3个独立的视网膜）。为了对不同日期进行的电穿孔实验结果进行定量比较，每次电穿孔实验组中均需包含一个“标准”DsRed/GFP沉淀样本。通过将各实验的表达水平相对于该“标准”的表达量进行归一化处理，即可实现跨实验的相对表达量比较。</li>
</ol>
10. 代表性结果：
一次成功的电穿孔可在视网膜表面约1/4至1/3的区域内实现DNA构建体的表达（图4A）。由于杆状光感受器尤其能够被高效转导，该技术非常适合用于定量分析光感受器特异性启动子的活性（图4B）。我们此前已利用该方法定量分析了来自杆状细胞特异性基因座Rho和Gnat1的一系列启动子变异体10。研究发现，该方法可实现近300倍范围内的启动子活性定量。
图5是单个电穿孔视网膜的示例数据集。在此特定示例中，实验载体pNrl(1.1kb)-DsRed在红色通道中检测，对照载体pNrl(3.2kb)-GFP在绿色通道中检测。针对pNrl(1.1kb)-DsRed载体的完整数据集应包含以该方式测量的6–9个视网膜，标准差将基于所有“DsRed归一化至GFP”的数值进行计算。若将pNrl(1.1kb)-DsRed的表达水平与例如pNrl(0.8kb)-DsRed进行比较，则两种载体均需与相同的GFP对照共同电穿孔例如，pNrl(3.2 kb)-GFP）并在相同的曝光时间下成像。如果每天均进行标准的DsRed/GFP电转染，则可以合并不同日期收集的数据例如，pNrl(3.2kb)-dsRed + pNrl(3.2kB)-GFP)。对于每个实验构建体，标准化后的DsRed水平将进一步相对于“标准”样本（pNrl(3.2kb)-dsRed）的标准化DsRed水平进行归一化处理。 
本文所述技术主要用于定量分析光感受器顺式调控元件（CREs）的活性10,13细胞类型特异性 顺式- 调控活性也可以在较少见的视网膜细胞类型（如双极细胞）中进行量化14，但这通常要求在垂直切片而非平铺制备样本中选择待定量的目标区域。对于在多种细胞类型（如光感受器和双极细胞）中驱动表达的CREs而言，情况同样如此。其余实验步骤基本相同。
<img src="/files/ftp_upload/2821/2821fig1.jpg" alt="基因编辑过程示意图、DNA电泳装置、启动子活性图、荧光结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. 视网膜外植体电穿孔操作流程概览。首先，从出生后第0天的小鼠幼崽中分离完整眼球，并解剖获取视网膜（P1）。其次，将视网膜置于含有DNA的电穿孔室中进行电穿孔处理（P2）。第三步，将视网膜外植体转移至滤膜上，并在培养条件下孵育八天（P3）。第四步，对外植体进行固定、切片载片并成像，使用ImageJ软件测量荧光强度（P4）。第五步，将ImageJ获取的数据导入电子表格程序进行处理，以定量分析不同启动子的活性差异（P5）。
<img src="/files/ftp_upload/2821/2821fig2.jpg" alt="毛细管电泳装置过程；利用凝胶进行蛋白质分离；实验示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 电穿孔皿的构建。A) 来自 Harvard Apparatus 的未改装微载玻片室，BTX 型号 453（目录号 #45-0105）。B) 使用 Dremel 工具将塑料试管架的手柄切下，并将其切割成矩形间隔块，尺寸如下：长 0.8 cm，高 0.6 cm，宽 0.3 cm。C) 将塑料间隔块等间距地安装到微载玻片室内。在间隔块之间的缝隙中注入水族箱密封胶（图中未显示）。D) 将金属条放置在间隔块上方。E) 使用文件夹夹子将金属条和间隔块固定在载玻片上，以确保在密封胶过夜固化期间所有部件保持原位。F) 移除间隔块，并测试加样孔是否不漏水。G) 制备完成的载玻片可放入塑料皿中，金属条位于皿侧面窗口的附近。
<img src="/files/ftp_upload/2821/2821fig3.jpg" alt="电泳；DNA分离示意图；显示电极、用于分子分析的凝胶介质。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
 图3. 含视网膜的电穿孔皿示意图。每个腔室中充满DNA溶液（每次最多可使用五种不同的溶液）。将视网膜置于腔室内，并调整方向，使晶状体倾斜靠在连接正极的金属条上；每个腔室可容纳三到四个视网膜。通电后，带负电荷的DNA分子将在电流作用下进入视网膜细胞。
<img src="/files/ftp_upload/2821/2821fig4.jpg" alt="使用dsRed和GFP荧光进行视网膜细胞基因表达分析；显微镜图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
 图4. A) 使用ImageJ软件测量视网膜平铺标本中的荧光强度。在ImageJ软件中打开DsRed（实验组）和GFP（对照组）通道的灰度平铺图像；请注意，这些图像仅为示意目的而着色。在均匀电穿孔的区域上放置五个测量圆圈（1至5），避开边缘和晶状体区域（虚线所示）。在视网膜外区域放置三个测量圆圈（6至8），用于测定背景荧光水平。B) 高倍镜下电穿孔视网膜外植体的横截面图像。该外植体于出生后第8天固定，4°C下在30%蔗糖/1X PBS中过夜冷冻保护，包埋于OCT包埋剂中，并切为12μm厚的冷冻切片。荧光表达载体pNrl(1.1kb)-DsRed和pNrl(3.2kb)-GFP在视网膜外核层（ONL）的光感受器细胞中表达。INL，内核层；GCL，节细胞层。
<img src="/files/ftp_upload/2821/2821fig5.jpg" alt="用于实验分析的视网膜与背景测量表，经dsRed与GFP归一化处理。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
 图 5. 使用 Excel 处理荧光数据。在步骤 1 中，将每个测量圆的平均像素值复制到电子表格中（单元格 B3-B12、F3-F5、H3-H5）。测量值 #1-5 为 DsRed 视网膜信号值，#6-8 为 DsRed 背景值；测量值 #9-13 为 GFP 视网膜信号值，#14-16 为 GFP 背景值。注意，测量值 #1 与 #9 对应同一个测量圆，#2 与 #10 同样对应，依此类推。在步骤 2 中，计算 DsRed 和 GFP 通道的平均背景值（单元格 F6、H6）。在步骤 3 中，从每个视网膜测量值中减去平均背景值（单元格 C3-C12）。在步骤 4 中，将每个减去背景后的 DsRed 测量值归一化至其对应的 GFP 测量值（单元格 D3-D7）。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

外植体电穿孔是一种用于量化小鼠视网膜发育过程中cis-顺式调控活性的简便方法。与通过小鼠转基因技术进行cis-顺式调控分析相比，电穿孔成本显著更低，仅需新生小鼠仔鼠、DNA、解剖器械以及电穿孔和组织培养设备。此外，该方法耗时也大大缩短：一次实验仅需数小时的准备时间、约八天的培养周期，以及实验结束后的数小时用于成像和数据分析。与基于细胞培养的cis-顺式调控分析相比，外植体电穿孔更具优势，因其使用的是真实的视网膜组织。视网膜在外植体培养中发育基本正常，可形成三个明确的细胞层（外核层、内核层和神经节细胞层），尽管光感受器细胞未能形成外节段。
另一个优点是，外植体电穿孔具有高度可重复性。相同的构建体在不同视网膜中进行电穿孔，即使在不同日期操作，通常也能产生相同的相对表达水平。此外，由于电穿孔导入的质粒被认为以附加体形式存在于细胞核中，而不会整合到染色体中，因此似乎不受困绕基因整合实验的整合位点效应的影响。 顺式-在转基因小鼠中进行的调控分析。
外植体电穿孔技术确实存在若干局限性。首先，只有仍处于细胞周期中的细胞才能通过电穿孔实现高效的转导15在P0阶段，该方法主要靶向视网膜中的视杆细胞及其他晚期出生的视网膜细胞类型（双极细胞、无长突细胞、Müller胶质细胞）。已有文献报道，通过P0电穿孔可实现对视锥光感受器的转染。16 但效率似乎较低。第二个局限性在于，外植体培养超过两周会导致视网膜逐渐发生形态异常，因此不建议进行。然而，如果需要在较晚时间点进行启动子定量，则 体内 电穿孔9 可在所需时间点进行视网膜解剖，随后将解剖所得视网膜平铺并按第9节所述进行定量分析。第三个局限性在于，该检测方法仅具有中等通量。与基于细胞培养的检测方法可在单次实验中检测数百个构建体不同，本方案所述技术每个构建体至少需要一只完整的小鼠视网膜。因此，每天可合理电穿孔的构建体数量仅为数十个。
使用本方法对启动子活性进行定量时，另一个需要注意的问题是，DsRed的荧光可能会“渗漏”到GFP检测通道中，尤其是在检测非常强的启动子时。其原因是DsRed的发射光谱与GFP的部分发射光谱存在重叠。为避免这一问题，应使用经过优化的发射滤光片，以最大程度减少DsRed与GFP之间的光谱重叠。当无法获得此类优化滤光片组时，另一种可能的解决方案是使用蓝移的荧光蛋白（例如，以BFP或CFP替代GFP。

<table><tbody><tr><td>电穿孔培养皿，Microslide 453</td><td>BTX Technologies</td><td>45-0105</td><td>参见方案第1节中的修改说明</td></tr><tr><td>100%硅橡胶水族箱胶粘剂</td><td>Perfecto Manufacturing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料微量离心管架</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-541</td><td>仅使用管架手柄部分</td></tr><tr><td>Dremel 工具</td><td></td><td></td><td>用于切下塑料管架的手柄</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11765</td><td></td></tr><tr><td>L-Glu/pen/strep</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>100倍浓度</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6634</td><td>配制1000倍储存液时，用5 mM HCl溶解至5 mg/mL，过滤除菌</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 方波电穿孔仪</td><td>BTX Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore 滤膜</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>110606</td><td>25 mm，0.2&amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>组织培养孵箱</td><td></td><td></td><td>37&amp;#x00B0;C，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片 #1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544E</td><td>厚度0.16 mm</td></tr><tr><td>配备相机的荧光倒置显微镜</td><td></td><td></td><td>相机应为单色相机（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，Hamamatsu ORCA-ER 相机）</td></tr><tr><td>用于倒置显微镜的EGFP/DsRed滤光片组</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>86007</td><td>该滤光片组可最大程度减少红色与绿色通道间的串色</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

量化活性 顺式-利用外植体电穿孔技术研究小鼠视网膜中的调控元件

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

细胞基因网络中的转录因子通过结合到其靶基因的特定DNA序列，调控这些基因表达的空间-时间模式及表达水平 顺式-调控元件（CREs），短的（&tilde;300-600 bp）的基因组DNA片段，可位于其所调控基因的上游、下游或基因内含子内部。顺式调控元件（CREs）即增强子/启动子通常包含多个成簇的转录激活因子和抑制因子的结合位点1-3它们作为转录输入的逻辑整合器，以时空精确且定量准确的启动子活性形式产生统一的输出。大多数哺乳动物的研究 顺式迄今为止，对调控作用的研究主要依赖于小鼠转基因技术来检测顺式调控元件（CREs）的增强子功能4-5该技术耗时长、成本高，且由于插入位点效应，结果大多缺乏定量性。另一方面，已在组织培养系统中建立了用于哺乳动物CRE功能的定量检测方法。例如，双荧光素酶报告基因检测），但 体内 这些结果的相关性通常不确定。 
电穿孔为传统小鼠转基因技术提供了一个极佳的替代方案，因其能够实现对空间-时间及定量方面的评估 顺式-在活体哺乳动物组织中的调控活性。该技术在分析中尤为有用 顺式中枢神经系统中的调控作用，特别是在大脑皮层和视网膜中6-8小鼠视网膜电穿孔，无论是 体内 和 离体，已由 Matsuda 和 Cepko 开发并进行了详尽描述6-7,9我们最近开发了一种简单的方法，用于定量分析电穿孔小鼠视网膜中光感受器特异性顺式调控元件（CREs）的活性10由于通过电穿孔导入视网膜的DNA量在不同实验之间可能存在差异，因此所有实验中均需共电穿孔一个“上样对照”。在这方面，该技术与用于定量培养细胞中启动子活性的双荧光素酶检测非常相似。 
在检测光感受器cis调控活性时，通常在新生小鼠（出生后第0天，P0）进行电穿孔，因为此时是视杆细胞生成的高峰期11-12。一旦视网膜细胞类型退出有丝分裂进入终末分化状态，电穿孔效率会显著降低。由于新生小鼠视杆细胞生成速率较高，且视杆细胞占成年小鼠视网膜细胞总数的70%以上，因此在P0时期电穿孔转染的细胞大多数为视杆细胞。基于这一原因，视杆光感受器是通过电穿孔技术研究最为便捷的视网膜细胞类型。本文所描述的技术主要用于定量分析光感受器顺式调控元件（CREs）的活性。

本实验方案介绍了一种简单且经济的方法，通过离体电穿孔技术在活体小鼠视网膜中定量分析顺式调控元件（即增强子/启动子）的活性。文中详细描述了DNA制备、视网膜分离、电穿孔、视网膜离体培养以及固定后的分析与定量过程。

细胞基因网络中的转录因子通过结合到其靶基因的特定序列，调控这些基因表达的空间-时间模式和表达水平。

本实验的总体目标是通过电穿孔法将带有荧光转录报告基因的小鼠视网膜植入物导入，并定量其表达水平。该过程首先通过解剖分离新生小鼠的视网膜组织；第二步是利用携带荧光标记的DNA报告基因构建体对视网膜进行电穿孔处理。该实验步骤的第三步是将电穿孔后的视网膜作为移植组织培养八天。最后一步是收获视网膜外植体并定量分析荧光报告基因的表达水平。最终，可通过视网膜外植体电穿孔结合定量数据分析，获得显示不同启动子报告基因构建体在发育中 小鼠视网膜中相对表达水平的结果。我叫 Joe Corbo，是圣路易斯华盛顿大学医学院病理学与免疫学系的一名教职人员。今天我们将展示一个视频实验方案，演示将 X explan 电穿孔技术应用于新生小鼠视网膜，以定量分析光感受器特异性顺式调控元件（CYS regulatory elements）的活性。本实验方案将由我实验室的一名研究生 Cindy Montana 进行演示。首先，用 70% 乙醇对电穿孔腔室及所有器械进行灭菌，为眼球采集做好准备。用乙醇对双手手套和实验台面进行消毒，并在整个操作过程中保持无菌条件。接下来，在组织培养超净台内，用移液器将六毫升解剖培养基加入一个无菌的60毫米培养皿中，再将三毫升培养基分别加入两个无菌的35毫米培养皿中。回到实验台后，用70%乙醇对新生小鼠幼崽的头部和颈部进行消毒。使用剪刀快速剪下头部后，将头部转移至无菌的100毫米培养皿中，在解剖显微镜下用小剪刀剪除头皮以暴露眼睛。用弯头镊子轻轻将眼球从眼眶中取出，然后放入含有解剖培养基的35毫米培养皿中。继续收集眼球，使每份待电穿孔的DNA样品对应3至4个眼球，并在操作完成前将眼球和解剖培养基保持在室温条件下。用70%乙醇对剃须刀片和无菌塑料移液管的包装进行消毒，然后用刀片将移液管尖端切去足够高度，以便能够吸取整个眼球。在解剖显微镜下高倍镜视野中，使用扩大的移液管将一个眼球从35毫米培养皿转移至60毫米培养皿。用精细镊子去除眼球表面的组织，例如眼外肌和脂肪。然后在视神经根部将其夹断以移除视神经。为了分离视网膜，可在巩膜的角膜缘处刺一个小孔，巩膜和视网膜色素上皮相对于呈哑光灰色的视网膜组织显得有光泽。将两对镊子的各一个尖端插入该孔中，并轻轻撕开巩膜和视网膜色素上皮（RPE）。务必保持晶状体原位。使用加宽的移液管将分离出的视网膜转移至第二个含有培养基的35毫米培养皿中。收集所有视网膜，并将其置于37°C的组织培养孵育箱中保存。在组织培养罩内进行电穿孔操作之前，针对每种需要电穿孔的DNA Eloqua，准备一个无菌的35毫米培养皿并加入解剖液，另取一个培养皿加入培养液。使用P200移液器，用无菌1×PBS将电穿孔培养皿中的腔室冲洗3次。向腔室中加入60 µL的DNA分装液，将未使用的腔室加入60 µL的1×PBS填满。将电极连接到电穿孔培养皿上，并在电穿孔仪上设置适当的参数。用精细镊子夹住视网膜的晶状体部位，将其转移至电穿孔腔室中，每个腔室内可放置最多四个视网膜。将视网膜排列好，使晶状体紧靠连接正极的金属条。每次在不同电穿孔腔之间操作时，用镊子擦拭干净，以避免DNA从一个腔室带到下一个腔室。当所有视网膜均排列完毕后，按下电穿孔仪的启动按钮。在连接负极的金属棒上应形成微小气泡。使用镊子断开电极并关闭电泳仪。轻轻将视网膜从室壁移开。将视网膜从孵育 chamber 转移至含有解剖液的 35 毫米培养皿中。使用无菌移液管，将视网膜从解剖液转移至含有培养液的 35 毫米培养皿中。标记无菌六孔培养板的各孔，并向每孔加入 3 毫升培养液。使用无菌镊子将圆形沃特曼（Watman）核滤膜轻轻放置于每个孔中培养基的液面上，滤膜光面朝上。在解剖显微镜辅助下，用无菌移液管将一片视网膜转移至滤膜上，确保其透镜面朝下。若视网膜着落时透镜面朝上，应将其重新吸入移液管中并再次尝试。每个孔中放置的视网膜不超过四个，并将其置于独立的液滴中。视网膜放置于孔中后，将培养板转移至37°C组织培养孵育箱中，培养所需时间。通常培养八天后，成功的电穿孔可在视网膜表面四分之一至三分之一范围内观察到DNA构建体的表达。通过比较均匀电穿孔区域（表达CRE构建体）与视网膜外区域的荧光水平，并归一化至对照GFP表达，来定量荧光水平。特别是视杆光感受器被高效转导，如图所示。以下是电穿孔实验的结果，其中两个视杆细胞特异性启动子驱动GFP和DS红在外界核层中的表达。通过将这两种表达模式与此处以蓝色显示的 DPI 染色结果叠加，可以明显看出光感受器特异性表达。在透明层或神经节细胞层中均未观察到表达。观看本视频后，您应能够清楚了解如何分离、电转并培养小鼠视网膜外植体，以定量分析视网膜囊性调节元件的活性。感谢观看，祝您的实验顺利。

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量化的活动顺</em在小鼠视网膜>调控元件外植体电穿孔

本文介绍了通过胎内（in utero）和离体（ex...

in utero 和 ex vivo 电穿孔法用于小鼠视网膜神经节细胞中的基因表达

我们展示了一种 体内 电穿孔转染方案，用于在多种出生后年龄段的小鼠中转染单个或少量成簇的视网膜神经节细胞（RGCs）及其他视网膜细胞类型。该方法实现了对出生后RGCs的标记与遗传操作 体内...

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一种将质粒DNA导入小鼠视网膜细胞以开展功能获得或功能缺失研究的方法 体内...

体内 电穿孔转染发育中小鼠视网膜

本文描述了从小鼠完整视网膜中荧光标记的神经元群体记录单个细胞的方法。通过使用双光子红外激发，对转基因标记的细胞进行膜片钳记录，以研究其光反应、感受野特性及形态学特征。...

完整视网膜中表达GFP的细胞群体的电生理特征分析

本文介绍了一种在成年斑马鱼视网膜中条件性敲低目标蛋白表达的方法，该方法包括将反义吗啉环寡核苷酸（morpholinos）玻璃体内注射并电穿孔导入视网膜。该方法可使目标蛋白表达在数天内被敲低，从而可用于研究该蛋白在再生或完整视网膜中的功能。...

体内电穿孔法将吗啉代寡核苷酸导入成年斑马鱼视网膜

本视频的总体目标是展示如何在汉普格尔和哈密尔顿22-23期（约胚胎发育第4天，E4）对鸡胚视网膜进行靶向视网膜注射以及in...

在卵内 鸡胚视网膜电穿孔技术

体外电穿孔转染中期小鼠胚胎菱脑唇下部

本文详细描述了一种在小鼠胚胎发育第14.5天（E14.5）对大脑皮层和海马体进行子宫内电穿孔的实验方案。我们还证明，该方法是研究这两个脑区中树突和树突棘的有力工具。...

利用可视化与遗传学操作技术研究小鼠大脑皮层和海马中的树突及树突棘 在子宫内 电穿孔

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用于原代细胞培养研究的鸡视网膜高效基因转导：一种 体外培养 电穿孔法

本实验方案描述了一种从鸡胚中分离、实验性操作及培养完整视网膜外植体的方法。当需要高成功率、高效性和可重复性以检测用于电穿孔和/或试剂物质的质粒效果时，此类外植体培养具有重要应用价值。 即，...

鸡胚全视网膜外植体用于电穿孔及化学试剂处理

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利用 Tol2 转座子介导的 人工 microRNA 转基因表达在鸡胚视网膜中进行功能缺失研究

学习利用外植体电穿孔技术在小鼠视网膜中量化顺式调控元件活性。该方法通过荧光报告基因检测基因表达水平，为研究视网膜发育中的基因调控机制提供可靠手段。

量化活性顺式-利用外植体电穿孔技术研究小鼠视网膜中的调控元件

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