在开发皮层网络功能钙成像

这部电影的总体目标是演示如何使用钙敏感荧光指示剂测量发育中的皮层脑切片的网络活动。DY 脑切片由年轻小鼠发育中的肠皮层制成。神经元和星形胶质细胞都带有钙依赖性标志物。

钙依赖性染料的荧光变化反映了细胞活性的变化。非神经元细胞，包括星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞，可以使用特异性标记染料进行染色。使用延时摄影记录皮层网络活动 通过在感兴趣区域制作 3D 图像堆栈，在网络内检测多光子成像单元。

然后可以分析多个细胞的细胞荧光变化，以读出发育中的皮层网络的活动。发育中的神经系统中一个标志性的活动模式是自发的同步网络活动。在许多不同的发育神经元区域观察到同步活动，包括完整的脊髓皮层和自发活动期间解离的神经元培养制剂神经元，去极化为火，单个尖峰或动作电位爆发激活许多铁通道，包括导致钙内流的电压门控钙通道。

已使用场电极或多电极阵列从本地网络测量了高度同步的活动。这些方法可实现高时间采样率，但由于单元活动的集成读出，因此空间分辨率较低。使用单个神经元的膜片钳电生理学来测量放电速率，可以实现神经活动的单细胞分辨率。

然而，从网络进行测量的能力仅限于同时修补的神经元数量，通常只有一个或两个神经元。使用钙依赖性荧光指示剂染料能够测量整个细胞网络的同步活性。该技术提供了高空间分辨率和足够的时间采样来记录发展中的网络的自发活动。

荧光钙敏感指示剂（如 URA 2：00 AM 酯）含有能够结合钙矿的羧酸基团。这些荧光染料使用单光子或双光子显微镜由特定光波长激活。染料发射的光子数在钙结合时瞬时改变。

光子数或荧光的这种变化被报告为 delta FF 信号，对应于神经元内钙水平的变化。钙敏感指标变化的测量是发育细胞中网络活动模式的有用读数测量。大家好，我是 Rianna Morty，我叫 Julie Abbots。

我们来自解释性神经生理学系和阿姆斯特丹大学。我们一直在使用钙成像来研究小鼠皮层发育组织中的功能活动，使用多焦点成像中的钙敏感指标。这部短片的目的是展示如何使用这些方法来测量神经系统中发展网络中的自发和诱发活动模式。

从年轻老鼠的头骨中迅速取出大脑，以减少对神经回路的损伤。在冰冷的切片溶液中解剖大脑。切片溶液含有氯化椰碱，而不是 A TSF 中常用的钠，用于神经元记录。

在这些实验中，我们正在从发育中的小鼠大脑的肠内皮层制作脑切片。将一张滤纸放在油盘上，用几毫升 A TSF 润湿。将大脑转移到滤纸上。

使用单刃剃须刀片将半球一分为二。将两个半球分开。将一个与剩余的半球一起放回冰片溶液中。

用剃须刀片去除小脑。将一个半球翻转到其中线上，从背表面切开大约一毫米，刀片向喙端略微倾斜。把大脑翻过来。

它最近使用棉鸟和金属刮刀切割的表面。将大脑转移到金属切割块上。用棉鸟轻轻地将大脑从抹刀上推到胶合的表面上。

为年轻的组织切割 300 微米的大脑切片，切割速度和刀片频率通常比用于更成熟组织的刀片频率慢。切割后，使用玻璃移液器转移每个切片，将切片转移到室温下含有含氧 A TSF 的保温室中。A CSF 含有比 A CSF 溶液更高的镁与钙的比例。

用于录制切片时，将放置 1 小时以恢复。为了用钙依赖性指示剂或细胞特异性标记物加载细胞，需要将切片转移到腔室进行染色程序。虽然有商业腔室，但可以很容易地用标准实验室设备组装而成，成本非常低。

要制作染色室，您需要以下基本实验室设备、两个塑料培养皿、一个 10 毫升注射器、一段硅胶管、一个带有半透膜强力胶的细胞培养插件、三个小管接头和一个细针头。取大培养皿，用加热棒在侧壁上打一个小孔。取小培养皿，做一个直径相似的孔，直径足够大，以便硅胶管通过。

将一段硅管穿过孔，在小培养皿内形成一个环。使用强力胶密封管路的开口端。然后将管子的其余部分粘在小培养皿的内壁上。

将小培养皿放入大培养皿的中心并粘合到位。取出硅胶管的另一端，将其穿过培养皿侧壁上的小孔。取一根细针，在培养皿内的硅胶管上打小孔。

以均匀间隔打孔，以实现均匀的气孔融合。使用加热的手术刀用半透膜充分吸收细胞培养物。切掉孔的顶部 1 厘米，留下一个浅盘在孵育过程中容纳切片。

将浅培养皿放在小培养皿的中央，周围环绕着多孔硅胶管。在大盘子的盖子上挖一个直径大约半到一厘米的孔。使用加热的手术刀取 10 毫升塑料注射器。

做一个斜切以去除注射器的末端。将强力胶涂在注射器管的切割面上。将其直接贴在大培养皿盖上的孔上。

将管路连接器连接到注射器尖端的末端。将浅培养皿放在小培养皿的中央，确保多孔气体管位于培养皿周围。然后将该管连接到碳素气体供应以给切片充氧。

在孵育过程中，更换大培养皿的盖子，该盖子也通过注射器尖端直接连接到气体供应。这将在孵育过程中为切片带来汽车和气体供应，以避免染料漂白。所有程序都在尽可能少的光线下进行，染料和切片都保存在黑暗中。

用来自切片架的大约一毫升半的 A TSF 填充染色室。将界面室放入其中，并填充另一毫升 A TSF。保持良好的氧气供应以保持组织健康和切片的良好负荷非常重要。

染色发生在 35 °C 左右，以便在染色室加热时促进染料被神经元吸收。为 fira 2：00 AM Ester 准备指示剂染料。将 9 微升 DMSO 和 1 微升昂酸加入 50 微克小瓶中。

DMSO 和酸。作为渗透剂，使染料能够通过脂质膜吸收。涡旋样品瓶 15 分钟，以确保染料完全溶解。

染色时，将每个切片转移到界面中。插入染色室。将染料直接抚摸到切片上方的感兴趣区域，关闭染色室的盖子。

将切片在黑暗中孵育 20 到 40 分钟，具体取决于所用 maus 的年龄。孵育后，将切片放回切片架中，以洗掉任何剩余的多余染料。钙成像的染色方案也可以适用于老年组织。

这需要额外的预孵育步骤。将旧切片转移到一个浅的预孵育皿中，其中装满了 3 毫升 CSF 和 8 微升克丽玛四溶液，以 0.5% 加热至 35 摄氏度，持续 3 分钟。然后将切片转移到界面中，插入染色室，并遵循正常的染色程序。

也可以对非神经元细胞（即星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞）的这些切片进行染色。硫瘤胃 1 0 1 可用于对星形胶质细胞进行硫胺染色。制作 10 微摩尔溶液，将紫色染料移液到切片中的感兴趣区域。

孵育 15 分钟。将切片转移回保存室以去除任何多余的染料。番茄凝集素的 FSE 偶联物可以对小胶质细胞和内皮细胞进行染色。

对于番茄凝集素，制备每毫升 20 微克的溶液。将染料涂抹在切片中感兴趣的区域。将切片孵育 45 分钟。

然后将切片再次移回保温室。在成像过程中，切片需要在显微镜下保持稳定。通常放置金属竖琴来压住组织，但它会不均匀地扭曲切片的表面，仅提供有限的聚焦视野，以便成像避免。

这些切片使用 POLYETHALINE 或 PEI 溶液粘在记录室上。PEI 是一种聚合物，用于增强细胞对表面的附着至少一小时。在将切片放入记录室之前，用几毫升的 PEI 溶液填充这些腔室以覆盖记录室的地板。

首先，用蒸馏水冲洗掉腔室中的 PEI，然后用 CSF 溶液转移至记录室中，去除多余的 A CSF 溶液。使用细画笔将切片放置在腔室的中间。

使用小块吸水滤纸进一步去除所有 A CSF。请注意确保切片的边缘周围不再有 A CSF。最后，将半毫升 A CSF 轻轻抚摸到切片上，不要将其从腔室中松开。

将腔室放入一个大的含氧界面容器中，并在黑暗中再放置一个小时。钙敏感指示剂染料的变化可以用单光子显微镜或双光子显微镜记录。我们使用钛蓝宝石激光器与奥林巴斯显微镜耦合，在我们的神经元网络中实现双光子成像。

此外，我们还利用了 L Vision 生物技术微调瞄准镜系统和 EM CCD 锤式 MATSU 相机来提高帧扫描率。将切片室置于显微镜下，具有含有 1.6 毫摩尔钙和 1.5 毫摩尔钙的含氧 A-T-S-F-A-T-S-F 的稳定流动。在设置中使用白光将镁加热到大约 30 摄氏度。

在切片中找到感兴趣区域并专注于表面。关掉灯并关闭记录柜门。降低背景光水平。

许多不同的商业或开放式软件包可用于记录和分析图像在我们的实验室中，我们使用 Lavis Biotech 的检测软件进行采集。要开始成像，请选择用于检测的 CCD 相机模式。设置与指示器相关的波长。

对于 fira 2：00 AM Ester，我们在 trim scope 软件中将激发设置为 820 纳米。选择 64 B 扫描模式。为您的感兴趣区域选择最佳大小的视野和像素分辨率。

如果图像采样需要，请选择合适的帧速率和像素旋转。打开激光快门，准备进行连续成像。使用连续成像模式。

调整增益和激光强度，并专注于要成像的神经元网络。停止扫描。选择帧速率和序列持续时间的延时设置。

延时成像后，以 1 微米的步长制作一个 Z 轴图像堆栈，标记上方 20 微米和下方 20 微米。该 Z 堆栈用于分析过程中的细胞检测。将录制的文件导出为 TIFF 图像堆栈。

总而言之，我们已经展示了使用钙指示剂来测量发育中的皮层中的同步自发网络活动。有关方法和试剂的更多详细信息，请参阅本影片随附的数据表，以便您在自己的实验室中设置该技术。