Name: 在开发皮层网络功能钙成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: 学习使用钙敏感荧光指示剂测量发育中小鼠皮层脑片的网络活动。本方法通过时间序列多光子成像技术记录神经元和星形胶质细胞的同步自发活动，为研究发育中神经网络的动态功能提供高分辨率的技术手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本实验室的工作由荷兰科学组织（NWO）（917.10.372）资助，项目负责人为 RMM。JD 隶属于欧盟第七框架计划 BrainTrain 项目（<a href="http://www.brain-train.nl">www.brain-train.nl</a>）。我们感谢 Pieter Laurens-Baljon 和 Sabine Schmitz（均来自阿姆斯特丹自由大学神经科学与认知研究所，CNCR）提供视频序列中使用的场电位多电极阵列波形图及神经元培养图像。

1. 制备水平内嗅皮层-海马脑切片
根据Canto、Wouterlood和Witter（2008）发表的《神经可塑性》ID 3812439中提供的该区域三维概览解剖图谱，制作内嗅皮层-海马脑切片。
<ol>
 <li>配制500ml切片液，用碳酰气（95%氧气，5%二氧化碳）充氧至少20分钟，然后将其中250ml冷冻至结冰。切片前几分钟，将制备好的切片冰与剩余250ml持续鼓泡的切片液混合并搅碎，用于解剖及切片室中的切片操作。</li>
 <li>配制200ml r-ACSF（恢复期人工脑脊液）以及至少500ml e-ACSF（实验用人工脑脊液）溶液。在组织制备前，需持续用碳酰气（95%氧气，5%二氧化碳）对两种溶液充氧至少20分钟。</li>
 <li>本方案适用于出生后第0天至最多3周龄的小鼠。根据当地伦理委员会的操作规程处死动物，并迅速将其脑组织在含有冰冻切片液的培养皿中取出（切片液配方见表1，含溶液与试剂）。</li>
 <li>将脑组织转移至浸有切片液的滤纸上，用锋利的剃刀片分离两个半球。将其中一个半球重新放回冰冻切片液中。</li>
 <li>去除另一半球的小脑部分。将脑组织翻转至中线面朝下，从顶部以略微向头端倾斜的角度切除脑上部。</li>
 <li>将脑组织翻转至已切割的（背侧）表面，用棉签轻轻按压，将其倒置粘附于切片机的组织固定座上。</li>
 <li>在步骤1制备的冰冻切片液中，以低频率和低速度切割300 μm厚的脑片。在本实验条件下，我们使用赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）的振动切片机（Microm, HM 650V），设置参数为0.05 mm/s和36 Hz。</li>
 <li>每切出一片脑组织，应立即转移至含有充氧人工脑脊液（ACSF）（2.5 mM Mg2+，1.6 mM Ca2+；见表2）的切片储存槽（浸没式）中，于室温下保存。r-ACSF中较高的镁离子浓度可通过NMDA受体减少切片后神经元内钙离子的流入，根据我们的经验，这有助于获得更高质量的脑片用于后续实验。如有需要，可随后对第二个大脑半球进行切片。</li>
 <li>让脑片在上述条件下恢复1小时。</li>
</ol>
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">切片溶液（单位：mM）– 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>110</td>
 <td>氯化胆碱</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25</td>
 <td>NaHCO3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>11.6</td>
 <td>11.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10</td>
 <td>D-葡萄糖</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>7</td>
 <td>MgCl2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3.1</td>
 <td>丙酮酸钠</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.5</td>
 <td>KCl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.25</td>
 <td>NaH2PO4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5</td>
 <td>CaCl2</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. 切片溶液配方。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">ACSF（单位：mM）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>125</td>
 <td>NaCl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>26</td>
 <td>NaHCO3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10</td>
 <td>D-glucose</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>KCl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.5/1.5</td>
 <td>MgCl2（恢复/实验）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.6</td>
 <td>CaCl2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.25</td>
 <td>NaH2PO4</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表2. 恢复液（r-ACSF）和实验用液（e-ACSF）的配制配方。
2. 染色室的制备
为了使细胞负载钙依赖性指示剂或细胞特异性标记物，需要将脑片转移至染色用孵育 chamber 中。尽管有商用的孵育 chamber 可供选择，但使用常规实验室设备即可轻松组装，成本极低。此类孵育 chamber 的关键特性包括：脑片需维持在 30 至 35°C 的温度范围内，在持续供氧的培养基中孵育，并且整个 chamber 需避光。
<ol>
 <li>使用加热的金属棒，在两个一次性聚苯乙烯培养皿（直径分别为35 mm和100 mm）的侧壁上各打一个小孔，孔径略大于硅胶管（直径约1.5 mm）的直径，以便硅胶管刚好能穿过。</li>
 <li>将硅胶管从较小培养皿的孔中穿入，并在小培养皿内壁形成一个环状结构。</li>
 <li>使用速干胶将硅胶管的开口端密封，并将管的其余部分粘附固定在培养皿的内壁上。</li>
 <li>用针头在小培养皿内部的硅胶管壁上等距打若干微孔。</li>
 <li>将较小的培养皿粘在较大的培养皿内部，使两者的开孔对齐；再将硅胶管的另一端穿过大培养皿侧壁的孔。</li>
 <li>对于界面型培养皿，取一个带半透膜的细胞培养插入式小室，使用加热的手术刀片将其顶部约1 cm部分切除，留下一个浅皿用于孵育过程中承载脑片。</li>
 <li>在大培养皿的盖子上打一个直径约0.5–1 cm的孔，以便通入碳氧混合气体（95% O2, 5% CO2）。</li>
 <li>取一个5或10 mL的塑料注射器，使用加热的手术刀片斜向切割，去除注射器末端，保留带有尖嘴的几厘米管段。使用速干胶将该管段的切割面粘附在培养皿盖上，覆盖住直径0.5–1 cm的通气孔。</li>
 <li>将硅胶管和管路连接头连接至注射器尖嘴；在进入培养皿底部的硅胶管上也安装另一个管路连接头。</li>
 <li>将两根管路连接至碳氧混合气体（95% O2, 5% CO2）的气体调节阀。将染色孵育装置置于加热板上，孵育温度维持在30–35°C。确保整个孵育过程中装置可避光。该染色孵育装置现已组装完毕，可用于脑片孵育。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/3550/3550methodologyfig1.jpg" alt="琼脂糖凝胶中缓冲系统的水平电泳示意图，DNA分离过程。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方法图1"> 
方法图1. 染色室的横截面图，显示切片孵育（上方）和钙敏感指示剂的应用（移液加入的绿色染料，下方）。
3. 切片染色
在操作荧光染料的任何过程中，为避免光漂白，应在低光照条件下操作，并在操作间隙将染料及染色组织置于黑暗环境中。
<ol>
 <li>将染色室置于加热板（35°C）上，连接碳氧混合气体供应，并从切片持有器中加入约1.5 ml的r-ACSF。</li>
 <li>将界面皿放入染色室内，并加入1 ml ACSF。</li>
 <li>确保染色室中有充足的碳氧混合气体供应，使ACSF保持缓慢而稳定的鼓泡状态。</li>
 <li>向一瓶50 μg Fura 2-AM中加入9 μl DMSO和1 μl Pluronic酸（20% DMSO储备液，Invitrogen），涡旋混合染料15分钟。</li>
 <li>将脑片转移至界面皿中，并用移液器将染料直接滴加到r-ACSF中覆盖海马和内嗅皮层目标区域的位置（如方法图1所示，见上文），使染料终浓度达到50 mM。</li>
 <li>盖上染色室盖子，根据动物年龄孵育20–40分钟（见表3）。</li>
 <li>将脑片重新转移回切片持有器中。</li>
</ol>
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>年龄（出生后天数）</td>
 <td>孵育时间（分钟）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&lt;p8</td>
 <td>20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p8-p9</td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p10-p11</td>
 <td>30</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p12-13</td>
 <td>35</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&gt;p13</td>
 <td>40</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表3. 不同年龄的孵育时间，由实验室经验确定。
4. 其他染料与陈旧组织
可能由于脑组织中髓鞘化程度增加，来自较年长啮齿类动物的脑片对Fura 2-AM酯的摄取能力显著降低。为了促进该染料的摄取，对于P13及更年长小鼠的脑组织，需使用Cremophor EL（Sigma）进行预孵育步骤11。Cremophor是一种非离子型表面活性剂，常作为辅料用于多种药物制剂中。若省略此步骤，我们发现皮层脑片中的细胞特异性标记效果极差且重复性不佳。
<ol>
 <li>将旧切片转移至一个浅的预孵育皿中，皿内含有3 ml加热至35°C的r-ACSF溶液和8 μl 0.5%的克列莫佛尔（cremophor，Sigma），孵育3分钟。</li>
 <li>将切片转移至界面皿中，并按照常规染色步骤操作（步骤4–7，见上文）。</li>
</ol>
在脑片制备过程中，钙染料可同时加载神经元和非神经元细胞。为了在神经网络中识别并区分这些细胞类型，可使用磺酰罗丹明101（SR101）对脑片中的星形胶质细胞进行标记。
使用 Sulforhodamine 101 对切片进行染色
按照之前的步骤1-3操作（第3节）。 
从-20°C保存条件下取1 μl浓度为10 mM的磺基罗丹明（Sigma）储备液，溶于999 μl r-ACSF中，配制成10 μM的溶液。将紫色染料像之前一样滴加到脑片上（步骤5-7），使脑片在染料溶液中孵育15分钟。
使用 FITC 番茄凝集素染料标记小胶质细胞和内皮细胞
按照之前的步骤1-3操作。 
取25 μl浓度为2 mg/ml的番茄凝集素（Lycopersicon esculentum lectin）FITC偶联物原液（L0401，Sigma），加入2.5 ml人工脑脊液（r-ACSF）中，使其终浓度为20 μg/ml。用移液器将染料加至脑片上（操作同步骤5-7），使脑片在该溶液中孵育45分钟。
需要注意的是，由于该染料与在光谱绿色范围发光的钙敏感指示剂（如 Fura 2-AM 或 Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1)）会发射波长重叠的光子，因此无法将二者联合使用。然而，其他钙指示剂染料（如 Calcium orange、Fura Red）可与适当的滤光片或 Texas-Red 标记的凝集素结合使用，从而与绿色光谱范围的钙指示剂染料联合应用。
5. 将切片固定到记录室
成像过程中，脑片需要在显微镜下保持稳定。通常使用金属网格压住组织，但这可能导致脑片表面受力不均，使得只有部分视野处于聚焦范围内。为避免这一问题，可使用聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）将脑片固定在记录 chamber 上。
<ol>
 <li>配制PEI溶液（将1 ml聚乙烯亚胺溶液加入250 ml硼酸缓冲液中（表4））。确保PEI完全溶解（搅拌过夜）。</li>
 <li>在记录槽中加入PEI溶液，使底部被液体覆盖，至少在放置脑片前一小时完成此步骤。</li>
 <li>用蒸馏水清洗记录槽，然后用孵育槽中的r-ACSF冲洗。</li>
 <li>将一片脑片转移至记录槽中。</li>
 <li>用移液器吸除r-ACSF，并用毛刷将脑片置于记录槽中央位置。</li>
 <li>用滤纸片吸除脑片周围的r-ACSF。为保证脑片稳定贴附，脑片周围应不再残留ACSF。</li>
 <li>根据记录槽的大小，用移液器滴加约0.5–1 ml ACSF至脑片上，使液体刚好覆盖脑片表面即可。</li>
 <li>将装有脑片的记录槽放入一个较大的、充满湿润碳合气（carbogen）的界面式孵育容器中，让脑片恢复至少一小时。</li>
</ol>
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">PEI 溶液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1ml</td>
 <td>聚乙烯亚胺溶液</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>溶于 250ml 硼酸缓冲液</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>40mM</td>
 <td>硼酸</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10mM</td>
 <td>十水合四硼酸钠</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表4. PEI溶液配方。
6. 成像
可使用单光子或双光子显微镜对钙依赖性指示剂染料进行成像。双光子成像仅激活兴趣区域焦平面体积内的指示剂染料，从而减少组织中的光散射。此外，它还能使光更好地穿透至组织切片的深层。
进行功能性钙成像时，我们使用Coherent公司提供的钛蓝宝石激光器，耦合至配备20倍物镜（数值孔径0.95）的Olympus显微镜，并结合LaVision Biotec公司的Trimscope系统。该Trimscope系统能够同时利用64束光束进行帧扫描，并配备滨松C9100 EM-CCD相机，以实现高速的帧扫描速率。
<ol>
 <li>将记录室置于显微镜下，并使用成像用e-ACSF（1.6 Ca2+/1.5 Mg2+ 比例（表2））建立稳定的灌流，加热至不低于30°C的更生理温度。</li>
 <li>使用白光照明聚焦到感兴趣区域（ROI）。避免将脑片暴露于光照的时间超过必要时长。</li>
 <li>根据您希望测量的组织和生物信号，选择合适的激发波长、成像视野、扫描频率、像素密度以及相应的软件设置。对于使用Fura 2-AM进行钙网络成像，我们通常选择820 nm的波长、250×250 μm的成像视野、1200 Hz的线扫描频率以及2×2 binning模式。这将获得约100 ms的帧时间，即约10 Hz的成像频率。</li>
 <li>使用连续扫描模式和选定的激光波长检查您的感兴趣区域是否处于焦点。调节焦距和激光强度，以避免图像像素饱和和荧光漂白。</li>
 <li>对您的感兴趣区域进行延时成像。我们通常采集两段各2000帧的延时视频。</li>
 <li>为进行细胞检测与识别，以1 μm的步进间距采集Z轴堆栈图像，围绕成像焦点平面在±20 μm范围内进行成像。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
使用双光子成像技术，在发育中的新皮层和内嗅皮层网络中，钙离子指示剂Fura 2-AM成功加载的结果如图1所示。部分染料仍以背景染色形式存在于组织中，但细胞胞体以及在某些情况下的近端树突清晰可见，并与周围的神经毡结构明显分离。如果加载不成功，则几乎观察不到细胞特异性的染色，而在脑片表面的死亡膜碎片上常可见到少量染料斑点的小簇状聚集。
在这些截图中，细胞网络在单个焦平面上清晰可见，可实现同时进行的细胞成像。使用金属琴架或脑片未能完全贴附于记录室时，可能导致成像的脑片表面不平整。
<img src="/files/ftp_upload/3550/3550fig1.jpg" alt="荧光显微镜；神经组织分析；绿色荧光标记；细胞分布。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1. Fura 2-AM 乙酯标记的发育中新皮层（A，左）和内嗅皮层（B，右）神经网络。 比例尺：100 μm。 
为了区分神经元与星形胶质细胞，在网络中可共同使用磺酰罗丹明101（sulforhodamine 101）与Fura 2-AM乙酯，从而实现不同细胞类型的分离。
<img src="/files/ftp_upload/3550/3550fig2.jpg" alt="荧光显微镜，结合信号图的神经活动成像，细胞反应分析。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2. 使用磺基罗丹明101标记星形胶质细胞。A Fura 2-AM酯与磺基罗丹明101的共标记。激发波长：820 nm。通过PMT收集图像，使用560/70 nm的二向色镜进行波长分离。B 来自神经元（上方）和星形胶质细胞（下方）的代表性荧光轨迹。标尺：60秒，ΔF 10（荧光任意单位）。
<img src="/files/ftp_upload/3550/3550fig3.jpg" alt="生物膜结构的显微镜图像；荧光方法；微生物网络分析；100 μm 比例尺。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3. 异硫氰酸荧光素标记的番茄凝集素（FITC-conjugated Lycopersicon esculentum lectin）染色。 小鼠发育中海马区（A）和浅层内嗅皮层（B）的小胶质细胞与内皮细胞标记。
钙离子指示剂染料用于同时读取发育中的大脑皮层和海马网络中多个细胞的活性。
图4. 海马和皮层网络中的动态钙瞬变。
视频 1：小鼠内嗅皮层在出生后第二周的 Fura 2-AM 乙酰甲酯负载。 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3550/3550movie1.avi">点击此处查看视频 1</a>
视频 2：出生后第一周小鼠海马组织中 Fura 2-AM 乙酸酯的负载。 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3550/3550movie2.avi">点击此处查看视频 2</a>
视频 3：出生后第一周小鼠皮层的 Fluo-4 负载。 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3550/3550movie3.avi">点击此处观看视频 3。</a>
对于Fura 2-AM乙酰甲酯而言，细胞激活过程中由去极化诱导的钙离子内流会导致染料荧光减弱。而对于Fluo-4等染料，则情况相反，细胞去极化表现为光子发射的增加。通常主要检测胞体内的钙瞬变，但在某些制备样本中，较大的近端树突内的活动也可观察到，如视频2所示。
网络活动的读出可通过商业软件或自主开发的软件脚本进行量化。在本实验室中，细胞鉴定及网络活动通过自主编写的Matlab（Mathworks）代码以半自动化的方式进行测量与分析。
<img src="/files/ftp_upload/3550/3550fig5.jpg" alt="神经活动分析；神经元定位、信号频率图、数据可视化示意图。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图"> 
图5. 来自发育中皮层网络的同步钙瞬变的代表性分析。 一个神经元的三维表示（A），用于从z轴层叠图像自动创建神经元掩模（B），以实现神经元的自动检测。钙瞬变的测量包括振幅、频率以及活跃细胞数量，这些参数可从单个神经元数据中读取（C）。不同轨迹之间的同步性可通过点阵图进行可视化（D）。

<ol><li>Katz, L. C., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+and+the+construction+of+cortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity and the construction of cortical circuits.</a> Science. 274, 1133-1138 (1996).</li>
<li>Khazipov, R., Luhmann, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+patterns+of+electrical+activity+in+the+developing+cerebral+cortex+of+humans+and+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Early patterns of electrical activity in the developing cerebral cortex of humans and rodents.</a> Trends in Neurosciences. 29, 414-418 (2006).</li>
<li>Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity+in+early+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical activity in early neuronal development.</a> Nature. 444, 707-712 (2006).</li>
<li>Adelsberger, H., Garaschuk, O., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+calcium+waves+in+resting+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical calcium waves in resting newborn mice.</a> Nat. Neurosci. 8, 988-990 (2005).</li>
<li>Garaschuk, O., Linn, J., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+oscillatory+calcium+waves+in+the+immature+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale oscillatory calcium waves in the immature cortex.</a> Nat. Neurosci. 3, 452-459 (2000).</li>
<li>Lamblin, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroencephalography+of+the+premature+and+term+newborn.+Maturational+aspects+and+glossary%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophysiol.+Clin%22%5BJournal%5D)">Electroencephalography of the premature and term newborn. Maturational aspects and glossary.</a> Neurophysiol. Clin. 29, 123-219 (1999).</li>
<li>Rakic, P., Komuro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+receptor%2Fchannel+activity+in+neuronal+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The role of receptor/channel activity in neuronal cell migration.</a> J. Neurobiol. 26, 299-315 (1995).</li>
<li>Spitzer, N. C., Root, C. M., Borodinsky, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+neuronal+differentiation%3A+patterns+of+Ca2%2B+spikes+specify+transmitter+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Orchestrating neuronal differentiation: patterns of Ca2+ spikes specify transmitter choice.</a> Trends. Neurosci. 27, 415-421 (2004).</li>
<li>Canto, C. B., Wouterlood, F. G., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+the+anatomical+organization+of+the+entorhinal+cortex+tell+us%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Plast%22%5BJournal%5D)">What does the anatomical organization of the entorhinal cortex tell us.</a> Neural. Plast. , 381243-381243 (2008).</li>
<li>Bureau, I., Shepherd, G. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+development+of+functional+and+anatomical+columns+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Precise development of functional and anatomical columns in the neocortex.</a> Neuron. 42, 789-801 (2004).</li>
<li>Ikegaya, Y., Le Bon-Jego, M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+imaging+of+cortical+network+activity+with+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Large-scale imaging of cortical network activity with calcium indicators.</a> Neuroscience research. 52, 132-138 (2005).</li>
</ol>

LaVision Biotec GmBH（德国比勒费尔德）赞助了本文稿件的投稿费用。

本文展示的方法提供了适用于小鼠和大鼠脑中发育期皮层及海马网络内可识别细胞的网络动态钙成像的合适方案。这些方法具有最佳的空间分辨率，可同时可视化局部细胞胞体网络，用于检测阈上活动。根据CCD相机的帧采集设置，可调整网络活动的时间分辨率，以优化发育神经系统中常见的长时间阈上事件的信噪比测量。这些方案不仅限于海马和皮层网络，还可标记整个发育中神经系统的细胞。该方法的局限性在于仅能记录阈上活动。

<table><tbody><tr><td>溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22,350-6</td><td></td></tr><tr><td>氯化胆碱</td><td>Sigma</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>克雷莫佛尔</td><td>Fluka</td><td>27963</td><td>Cremophor EL&amp;reg;</td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1221</td><td>特殊包装</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fluka</td><td>63072</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31437</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>默克</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>泊洛沙姆&amp;reg; F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td>DMSO 中的 20% 溶液</td></tr><tr><td>抗坏血酸钠</td><td>Sigma</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>番茄（Lycopersicon esculentum）凝集素</td><td>Sigma</td><td>L0401</td><td></td></tr><tr><td>磺酰罗丹明101酸氯化物</td><td>Sigma</td><td>S3388</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺溶液</td><td>Fluka</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>十水合四硼酸钠</td><td>Sigma</td><td>B3545</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>染色缸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器（5 或 10 ml）</td><td>Terumo</td><td></td><td>带鲁尔锁</td></tr><tr><td>6孔板用细胞培养小室，8.0 &amp;micro;m，透明PET膜&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>353093</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（35 和 100 mm）</td><td></td><td></td><td>一次性，聚苯乙烯</td></tr><tr><td>管路和连接件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超级胶水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>支架与腔室</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>切片孵育槽</td><td></td><td></td><td>浸没的</td></tr><tr><td>染色缸</td><td></td><td></td><td>界面室</td></tr><tr><td>记录室</td><td></td><td></td><td>例如，MEA 探针</td></tr><tr><td>成像装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>钛宝石激光器（Chameleon）</td><td>相干的</td><td></td><td></td></tr><tr><td>修剪范围</td><td>LaVision</td><td></td><td>64 束</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>高数值孔径镜头</td></tr></tbody></table>

发育中皮层网络的功能性钙成像

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

发育中神经系统的活动具有一个典型特征，即自发的、同步化的网络活动。这种同步化活动已在完整的脊髓、脑干、视网膜、大脑皮层以及离体神经元培养体系中被观察到。在自发活动期间，神经元发生去极化，产生单个或成簇的动作电位，从而激活多种离子通道。去极化会激活树突和树突棘上的电压门控钙通道，介导钙离子内流。利用场电极可在局部神经元网络中记录到高度同步的电活动。该技术具有较高的时间采样率，但由于单个电极整合了多个神经元的信号，空间分辨率较低。通过在单个神经元上进行膜片钳电生理记录，可实现对神经元活动的单细胞分辨率测量。然而，该方法在同时记录网络中多个神经元活动方面存在局限，通常仅能同时记录一到两个神经元。利用钙离子依赖性荧光指示剂染料，使得在细胞网络范围内测量同步活动成为可能。该技术兼具高空间分辨率和足够的时间采样能力，可用于记录发育中神经网络的自发活动。
在产前和出生后早期发育过程中，新形成的皮层和海马网络的一个关键特征是出现自发的、同步的神经元活动（Katz &amp; Shatz, 1996；Khaziphov &amp; Luhmann, 2006）。这种相关的网络活动被认为对发育中的神经系统形成功能性神经环路至关重要（Spitzer, 2006）。在灵长类和啮齿类动物的大脑中，产前和产后均可在体内和体外观察到早期的电活动和钙网络波动（Adelsberger 等, 2005；Garaschuk 等, 2000；Lamblin 等, 1999）。这些早期活动模式已知可调控多种发育过程，包括神经元分化、突触形成以及可塑性（Rakic &amp; Komuro, 1995；Spitzer 等, 2004），对于皮层环路的正常发育与成熟具有关键意义。
在本 JoVE 视频中，我们演示了用于成像发育中皮层网络自发活动的方法。钙离子敏感性指示剂（如 Fura 2-AM 酯）可扩散穿过细胞膜，细胞内酯酶活性将 AM 酯裂解，生成细胞膜不通透性的指示剂染料形式。该不通透性指示剂含有羧酸基团，可在细胞内检测并结合钙离子。当钙离子敏感性染料与钙结合时，其荧光会发生短暂改变。通过单光子或多光子成像技术，可检测染料发射光子的变化，从而反映细胞内钙离子浓度的改变。此外，这些依赖钙离子的指示剂还可与其他荧光标记物联合使用，以研究活跃网络中的细胞类型。

利用钙离子敏感型指示剂染料的AM酯形式，可检测发育中神经元网络的自发活动。通过单光子或双光子成像技术，可观察到指示剂荧光的瞬时变化，从而反映细胞内钙离子浓度的改变，指示神经元的激活状态。该方案可适用于多种依赖发育阶段的神经元网络研究。 体外.

发育中神经系统的活动具有一个典型特征，即自发的、同步化的网络活动。同步化活动已在……中被观察到

本视频的总体目标是演示如何利用钙离子敏感型荧光指示剂，测量发育中皮层脑片的神经网络活动。DY脑片取自幼鼠发育中的肠皮层。神经元和星形胶质细胞均被加载了钙离子依赖性标记物。钙依赖性染料荧光的变化反映了细胞活动的变化。可使用特异性标记染料对非神经元细胞（包括星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞）进行染色。通过延时多光子成像记录皮层网络活动，并通过对感兴趣区域进行三维图像堆栈扫描来识别网络中的细胞。随后可分析多个细胞的细胞荧光变化，以读取发育中皮层网络的活动情况。发育中神经系统的典型活动模式是自发性同步网络活动。这种同步活动已在多种不同的发育中神经元区域中观察到，包括完整的脊髓皮层以及解离的神经元培养物。在自发活动期间，神经元去极化并产生单个动作电位或动作电位簇，激活包括电压门控钙通道在内的多种离子通道，导致钙离子内流。利用场电极或多电极阵列已可从局部神经网络中检测到高度同步的活动。这些方法能够实现较高的时间采样率，但由于对细胞活动进行的是整合性记录，因此空间分辨率较低。通过单细胞膜片钳电生理技术记录单个神经元的放电频率，可以实现对神经活动的单细胞分辨率观测。然而，从神经网络中进行测量的能力受限于同时记录的神经元数量，通常仅为一到两个神经元。利用钙依赖性荧光指示剂染料，现已能够测量细胞网络中同步发生的活动。该技术兼具高空间分辨率和足够的时间采样能力，可用于记录发育中神经网络的自发活动。荧光钙离子敏感探针（如URA 2:00 AM乙酰氧基甲酯）含有能够结合钙离子的羧酸基团。这些荧光染料可通过单光子或双光子显微镜在特定波长的光照下被激活。当钙离子与染料结合时，其发射的光子数量会发生短暂改变。光子数量或荧光的这一变化被报告为ΔFF信号，对应于神经元内钙水平的变化。对钙敏感指示剂变化的测量是评估发育中细胞网络活动模式的一种有用读出方法。您好，我是Rianna Morty，我是Julie Abbots。我们来自阿姆斯特丹大学的解释性神经生理学系。我们一直采用钙成像技术，结合多焦点成像和钙敏感探针，研究小鼠大脑皮层发育过程中组织的功能活动。本短片的目的是展示如何利用这些方法来检测神经系统发育网络中的自发性活动和诱发性活动模式。快速从小鼠颅骨中取出脑组织，以减少对神经环路的损伤。在冰冻的切片溶液中解剖分离脑组织。该切片溶液中含有氯化胆碱，以替代常用于神经元记录的任氏液（aCSF）中的钠离子。在这些实验中，我们正在制备发育中 小鼠 脑的肠皮层脑片。在培养皿上放置一张滤纸，并用几毫升 A TSF 润湿。将脑组织转移到滤纸上。使用单刃剃须刀片将半球切开。分离两个半球，将其中一个与剩余的半球放回冰冷的切片溶液中。用剃刀去除小脑。将一侧半球翻转至其内侧面向上，从背侧表面切入，刀片略朝向头端倾斜，切口深度约为一毫米。将脑组织翻转过来。 使用棉签和金属解剖刀切取其新鲜切面。将脑组织转移至金属切块板上。用棉签轻轻将脑组织从解剖刀上推至粘附表面。对于幼年组织，脑组织切片厚度为300微米，切割速度和刀片频率通常比成熟组织更慢。切片完成后，使用玻璃移液管将每一片切片转移至孵育室中，孵育室内含有室温的含氧人工脑脊液（A TSF）。该A CSF溶液中的镁钙浓度比高于常规A CSF溶液。用于记录的脑片需放置一小时以恢复。为了用钙依赖性指示剂或细胞特异性标记物对细胞进行染色，需要将脑片转移至染色用孵育 chamber。尽管有商用的孵育 chamber，但使用常规实验室设备即可轻松组装，成本极低。要制作一个染色孵育盒，您需要以下基本实验设备：两个塑料培养皿、一个10毫升注射器、一段硅胶管、一个带有半透膜的细胞培养小室、速干胶、三个小型管路连接头以及一根细针。取较大的培养皿，用加热的金属棒在其侧壁上烫出一个小孔。取较小的培养皿，打一个直径相近且足够让硅胶管穿过的孔。将一段硅胶管穿过小培养皿上的孔，并在皿内形成一个环。使用超级胶水密封管子的开口端，然后将剩余的管子粘贴到小培养皿的内壁上。将小培养皿置于大培养皿中央并用胶固定。取硅胶管剩余的一端，从培养皿侧壁的小孔中穿过。用细针在培养皿内的硅胶管上刺出若干小孔。以均匀间隔打孔，以实现均匀的气体交换。使用加热的手术刀取一个带半透膜的细胞培养小室，切去小室顶部约一厘米的部分，留下一个浅皿，用于在孵育期间承载组织切片。将浅碟置于大碟中央，周围用多孔硅胶管包围。在大碟盖子上打一个直径约0.5至1厘米的孔。使用加热的手术刀取一个10毫升的塑料注射器。以一定角度剪切，切掉注射器末端。将瞬间胶涂抹在注射器管的切面上，直接粘合到大号培养皿盖的孔洞上。将管路连接器安装到注射器尖端的末端。将浅盘置于小型培养皿中央，确保多孔气体管路环绕浅盘放置。然后将此管路连接至碳氧混合气体供应装置，以对脑片进行氧合。孵育期间，盖上大培养皿的盖子，该盖子也通过针头直接连接至气体供应装置。这样可在孵育过程中向脑片持续供应碳酰气体，以防止染料褪色。所有操作均在尽可能避光的条件下进行，染料和脑片均需避光保存。从切片持有器中向染色室加入约1.5毫升A TSF。将界面室放入其中，并再加入1毫升A TSF。维持充足的氧气供应至关重要，以保持组织健康并确保切片的良好加载。染色过程在约35摄氏度下进行，以促进染料进入神经元，同时染色室正在升温。准备用于fira 2:00 AM Ester的指示剂染料。在一支50微克的试剂瓶中加入九微升DMSO和一微升onic acid。DMSO 和油酸。作为渗透剂，使染料能够通过脂质膜。涡旋小瓶15分钟，以确保染料完全溶解。染色时，将每个切片转移至界面处，放入染色盒中。将染料直接滴加到切片上方的目标区域，盖上染色盒的盖子。根据所使用小鼠的年龄，将脑片在避光条件下孵育20至40分钟。孵育结束后，将脑片转移回切片储存槽中，以洗去残留的过量染料。钙成像的染色方案也可适用于较年老的组织。这需要额外的预孵育步骤。将旧切片转移至一个浅的预孵育皿中，皿内含有3 mL人工脑脊液和8 µL浓度为0.5%的Crema四溶液，在35°C下加热3分钟。然后将切片转移至界面，插入染色室，并按照常规染色程序进行操作。也可以对这些切片中的非神经元细胞进行染色，即星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞。可使用硫黄素 1 0 1 对星形胶质细胞进行硫黄素染色。配制 10 µM 的溶液，将紫色染料滴加到切片中目标区域上。孵育15分钟。将切片转移回孵育室，以去除多余的染料。番茄凝集素的FSE偶联物可对小胶质细胞和内皮细胞进行染色。对于番茄凝集素，配制浓度为20微克/毫升的溶液。将染料滴加至切片中目标区域。将切片置于室温下孵育45分钟。然后再次将切片转移回孵育室。成像过程中，切片需要在显微镜下保持稳定。通常使用金属固定网压住组织，但这种方法可能不均匀地扭曲切片表面，导致只有有限的视野范围处于聚焦状态，应尽量避免。使用聚乙烯或PEI溶液将这些切片固定在记录室中。PEI是一种聚合物，可增强细胞在表面上的贴附，作用时间至少为一小时。在将切片放入记录室之前，先向记录室中加入几毫升PEI溶液，以覆盖室底。首先，用蒸馏水冲洗掉腔室中的PEI，随后用CSF溶液冲洗。将一片组织转移至记录腔室中，并去除多余的CSF溶液。使用精细的画笔将组织片置于腔室中央位置。使用小块的吸水滤纸吸除切片周围残留的所有人工脑脊液（A CSF）。注意确保切片边缘无任何人工脑脊液残留。最后，将半毫升人工脑脊液（A CSF）轻柔地滴加到切片上，注意不要使切片从孵育 chamber 中松动。将室置于大型充氧的界面容器中，并在暗处再放置一小时。可使用单光子或双光子显微镜记录钙敏感指示剂染料的变化。我们采用与奥林巴斯显微镜耦合的钛蓝宝石激光器，以实现神经网络中的双光子成像。此外，我们使用 L Vision Biotech 的切片显微系统，配备 EM CCD Hammer MATSU 相机，以提高帧扫描速率。将脑片置于显微镜下的切片室中，持续灌流含 1.6 毫摩尔钙和 1.5 毫摩尔镁的氧合 A-T-S-F-A-T-S-F 溶液。在装置中利用白光将溶液加热至约 30°C。在切片中定位目标区域，并聚焦于表面。关闭光源并关上记录柜门，以降低背景光水平。目前有多种不同的商业或开源软件包可用于图像的采集与分析。在本实验室中，我们使用 Lavis Biotech 提供的 inspector 软件进行图像采集。开始成像时，选择用于检测的 CCD 相机模式，并设置与您的指示剂相对应的波长。对于 fira 2:00 AM Ester，我们在 trim scope 软件中将激发波长设置为 820 纳米。选择 64 B 扫描模式。为您的感兴趣区域选择最佳的视野尺寸和像素分辨率。根据图像采样需求选择合适的帧率和是否启用像素旋转。打开激光快门，准备进行连续成像。使用连续成像模式。调节增益和激光强度，并聚焦到需要成像的神经网络。停止扫描。选择延时成像的帧率和序列持续时间设置。完成延时成像后，以1微米为步长，采集目标位置上方20微米至下方20微米范围内的Z轴层扫图像。该Z轴层扫图像用于分析过程中的细胞检测。将记录的文件导出为TIFF图像序列。总之，我们展示了利用钙离子指示剂来测量发育中皮层的同步自发性网络活动。有关该方法和试剂的更多细节，可在随本视频提供的数据表中找到，以帮助您在自己的实验室中建立该技术。

functional-calcium-imaging-in-developing-cortical-networks

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在开发皮层网络功能钙成像

为了理解新皮层中微环路的网络动态，必须同时记录大量神经元的活动。在体双光子钙成像技术是目前唯一能够以单细胞分辨率记录密集神经元群体活动的方法。...

活体小鼠第2/3层双光子钙成像

钙信号在基因表达、细胞存活和分化等多种细胞过程中发挥关键作用。本文演示如何使用Fura-2...

使用Fura-2 AM对皮层神经元进行钙成像

本文描述了一种将钙离子指示剂染料加载至脑室下区（SVZ）细胞以记录钙活性的方法。出生后的脑室下区包含紧密排列的细胞，如神经前体细胞和成神经细胞。与浴式加载不同，我们通过压力将染料直接注入组织内部，从而实现更佳的染料扩散效果。...

制备用于钙成像的急性侧脑室下区脑片

来源：Bannai, H., et. al., 利用膜靶向Ca2+指示剂解析培养细胞中的局部Ca2+信号。 J. Vis. Exp.

星形胶质细胞区室特异性动态的自发钙成像

本文介绍了一种在自由活动的小鼠中，跨多个皮层以细胞分辨率进行大规模 Ca2+...

自由活动小鼠中使用棱镜探针和微型荧光显微镜进行多层皮层 Ca2+ 成像

我们描述了一种通过双侧初级躯体感觉皮层（S1）上方的双光窗记录神经元活动的实验方法 Thy1- 使用双光子（2P）显微镜的GCaMP6s转基因小鼠 体内.

使用 Thy1-GCaMP6s 转基因小鼠对初级躯体感觉皮层中的神经活动进行成像

我们介绍一种结合全细胞膜片钳记录与双光子成像的方法，用于在急性脑片中的神经元树突内记录 Ca2+...

脑片中神经元树突的双光子钙成像

我们提出了一项分为两个部分的实验方案，该方案结合了荧光钙成像与原位杂交技术，使实验人员能够在单细胞水平上将钙活动模式与基因表达谱相关联。...

荧光钙成像与后续原位杂交用于神经前体细胞表征 Xenopus laevis

细胞钙成像是一种多功能方法，可用于研究培养物中混合细胞群体甚至清醒动物个体细胞的动态信号传导，该方法基于钙通透性通道/受体的表达，从而产生独特的功能特征。...

利用钙成像技术可视化神经元-胶质细胞环路中的动态变化

发育过程中，新皮层的初级感觉区表现出独特的自发性活动。本文介绍了如何在新生小鼠中可视化单个神经元活动及初级感觉区，以分析特定脑区的同步活动 体内.

活体单神经元分辨率下新生小鼠感觉皮层自发活动的可视化

学习使用钙敏感荧光指示剂测量发育中小鼠皮层脑片的网络活动。本方法通过时间序列多光子成像技术记录神经元和星形胶质细胞的同步自发活动，为研究发育中神经网络的动态功能提供高分辨率的技术手段。

发育中皮层网络的功能性钙成像

探索更多视频