调查在DSS诱导的鸡传染性法氏囊病模型的肠道炎症

该程序的总体目标是通过确定响应炎症而产生的骨髓过氧化物酶活性和促炎细胞因子的数量来评估硫酸右旋琼钠诱导的肠道免疫反应。首先，通过将 DSS SALT 溶液引入饮用水中，在小鼠中诱导 DSS 结肠炎。接下来，通过宏观评分评估结肠炎的疾病严重程度，并切除结肠以进行进一步分析。

然后将解剖的结肠切成三部分，用于组织学、细胞因子定量和 NPO 活性。最后，将结肠组织匀浆，并使用上清液测定 MPO 活性。最终，可以通过使用分光光度计收集的吸光度数据来确定 MPO 活性的变化。

该方法可以提供对各种炎症性肠病模型的慢性信息的见解，例如 DSS 和 TNBS 诱导的结肠炎。此外，您可以在其他器官（如肺和肝脏）中使用此方法 在开始手术之前。用 DSS 溶液替换每个小鼠笼中的饮用水以诱导炎症。

给对照小鼠高压灭菌饮用水，不含 DSS。然后在实验当天，按照之前 Whitham Williams 和 Williams 的 JoVE 文章中演示的那样解剖结肠。用一对弯曲的镊子小心地将粪便从整个结肠中挤出，用无菌 PBS 冲洗组织，将其收集到称重纸中。

使用一对镊子按压粪便以确定其稠度以确定粪便中血液的评分，从而评估粪便。记下粪便的颜色，并使用血液cult试验进一步验证评估，该试验包括将粪便涂抹在血液cult纸上，添加显影剂，然后记下蓝色表示粪便血液检测呈阳性。然后使用此表确定每个条件的值。

接下来，在保持结肠的近端到远端方向的同时，将结肠切成三个相等的部分。然后从结肠的近端和中结肠切片中取出样品片段，并将样品放入单独的 1.5 毫升 eph 管中。为了评估结肠炎严重程度的组织学损伤，请使用结肠最远的组织切片并切下半至一厘米长的小片段。

将片段放入组织盒中，并将盒浸入缓冲的 10% 福尔马林溶液中。然后在制备组织片段的石蜡包埋横截面后，用血红素 eoin 对切片进行染色，以便盲法观察者进行评分。最后，将近端和中结肠切片的样品冷冻在液氮中，并储存至零下 70 摄氏度使用。

从零下 70 摄氏度的储存中取出结肠样本后，将它们放在冰上。然后使用弯曲的镊子去除任何可见的粪便或脂肪，并将它们放入适合在均质器中使用的单独的两毫升管中。然后确定并记录每个样品的重量。

接下来，向每个样品管中加入均质器珠子，然后根据刚刚测定的组织重量向试管中加入适量的 H tab 缓冲液，用组织匀浆器在 30 赫兹下解离片段 4 分钟。最后，将细胞溶液在 13， 400 倍 G 和 4 摄氏度下离心 6 分钟。将上清液收集到新管中，然后确保保留均质珠，丢弃所得沉淀。

然后可以将上清液储存在零下 70 度直至使用。通过将 7 微升先前制备的组织匀浆一式三份添加到 96 孔板中开始此步骤。然后将 50 微升稀释的过氧化氢加入新鲜制备的 OD Dion 碘中。

使用多通道移液器，向每个孔中加入 200 微升过氧化氢混合物。现在，使用分光光度计测量 550 纳米的吸光度，以 32 次间隔读取三个读数。然后使用吸光度数据、组织重量和缓冲液体积，计算匀浆中的 NPO 活性，如本样品计算所示。

在 DSS 治疗期间，疾病活动指数可用于评估和评价疾病的临床进展。与初始体重、稀便和粪便出血相比，用 DSS 治疗的动物表现出明显的体重减轻。比宏观系统更实质性，疾病活动指数越高。

在处死并检查在饮用水中给予 5% DSS 的小鼠的结肠 5 天后，基于结肠长度缩短、结肠出血、粪便出血、大便稠度松弛和直肠出血迹象的宏观评分，结肠炎的严重程度被确定为比仅用水处理的对照差约五倍，如这些数据所示DSS 处理的横截面结肠组织样本与 H 和 E 相同，其组织学评分高于水处理对照。在这里，在从仅接受水的对照动物收集的 h 和 e 染色横截面中星号指示的区域可以注意到正常结构和缺乏细胞浸润。现在将 A DSS 处理动物样品的 h 和 e 染色与上图进行比较。

这种动物的结肠表现出更多的组织学损伤，如磅征所示的更多的细胞浸润以及更多的杯状细胞耗竭和更大的扭曲。对 K crypt 架构的损坏，如星号所示。为了进一步表征 DSS 处理的小鼠疾病严重程度，可以从匀浆的结肠组织样本中评估炎症的替代标志物 NPO 活性。

正如预期的那样，DSS 处理的结肠比对照组具有更高的 NPO 活性。此外，DSS 诱导的结肠炎的严重程度与促炎细胞因子水平升高有关，例如 IL 1、β、IL 6 和 TNF α。在尝试此过程时，请务必记住 MPO 活动会随着时间的推移而减少。

因此，MPO 测定应该是确定肠道炎症严重程度时首先进行的测定之一。