遗传筛选隔离弓形虫宿主细胞的出口突变

该视频演示了一种新的表型筛选方法，用于分离具有温度敏感出口表型的突变体。诱变剂和寄生虫应用于弓形虫感染的人包皮成纤维细胞的培养物。在两个小时内，去除非侵入性寄生虫，并将培养瓶转移到 40 摄氏度以诱导表型发育。

26 小时后，液泡中含有 8 到 16 种寄生虫。接下来，用出口诱导化合物刺激细胞。出口有缺陷的突变寄生虫将保留在细胞内，而野生型寄生虫将出口到培养基中。

通过洗涤去除野生型寄生虫，并将剩余细胞再次在 35 摄氏度下孵育以富集突变种群。最后，验证突变表型，并通过限制稀释从富集的群体中分离单个寄生虫克隆。与现有方法（如生物吸入方法）相比，该技术的主要优点是出口突变体的特异性富集要有效得多。

当我们从一组具有生长缺陷的突变体中识别出一个出口突变体时，我们首先获得了这种方法的 ID。使用该突变体，我们通过与野生型寄生虫以不同比例混合来优化筛选程序。演示该程序的是 Bradley Coleman，他是我膝盖的博士后。

该程序使用高度诱变的化合物和液体以及传染性寄生虫。弓形虫甘地 使用适当的防护装备，包括实验室外套、双层手套和生物安全柜是必不可少的。产生的任何液体废物应单独收集以进行适当处理。

首先在 ed one 培养基中用 1 毫升新鲜裂解的 tachy Lloyds 接种汇合的人包皮成纤维细胞或 HFF 细胞。然后将培养瓶放入加湿的 37 摄氏度、含 5% CO2 的培养箱中 18 至 25 小时。第二天，用 10 毫升 0.1% 胎牛血清培养基替换培养基，在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。

孵育后，每个培养瓶添加 0、12.5、25、50 或 100 微升 ENU 诱变剂。工作稀释度分别为 1.25、2.55 和 10 毫摩尔。向每个培养瓶中加入最多 100 μL 的 DMSO。

在 37 摄氏度的培养箱中孵育 4 小时。用 10 毫升冷 PB S3 冲洗单层细胞 10 秒。加入 5 毫升 PBS 并使用细胞刮刀松开单层。

然后使用重型剪刀剪掉针帽的末端，以免针头暴露在外。接下来，将细胞转移到注射器中，并通过 26.5 号针头。为了从成纤维细胞中物理去除寄生虫，多次针头通过将提高从宿主细胞中释放寄生虫的效率。

将 3.0 微米聚碳酸酯过滤器连接到注射器上。将针头穿过细胞装入注射器中，然后将它们通过过滤器推入寄生虫处的管管中，放在血细胞计数器上进行计数。该程序最困难的一个方面是区分寄生虫和碎屑。

为了确保成功，在计数之前让寄生虫稳定下来很重要。让寄生虫稳定 5 分钟后，数一数。一旦确定了弓形虫的浓度，在 ED 中将它们稀释至每毫升 3， 333 个寄生虫，1 次为 10 毫升。

需要 33， 333 个寄生虫。向 HFF 细胞六孔板的第一个孔中加入 3 毫升，以接种 10， 000 个寄生虫。然后通过将 300 微升从一个孔转移到另一个孔，在接下来的三个孔中将寄生虫连续稀释 10 倍。

将板在 37 摄氏度的培养箱中保持原样 7 天。然后，一周后，吸出培养基，并向每个孔中加入 3 毫升 100% 乙醇 15 分钟，固定细胞。去除乙醇后，向每个孔中加入 3 ml 结晶紫溶液 15 分钟，对细胞进行染色。

最后，用 3 mL PBS 冲洗每个孔 1 分钟。板干燥后，计数斑块并选择实现 30% 暴露寄生虫存活所需的诱变剂浓度。历史上使用 70% 杀伤的剂量，每个基因组诱导的点突变少于 100 个。

该过程的下一步是富集种群中的出口突变体。一旦种群扩大，将 120， 000 个新鲜躺下的寄生虫添加到 10 毫升的汇合 HFF 细胞中。ED 1 在 35 摄氏度下孵育 2 小时。

这将通过限制入侵时间来同步种群。孵育后，吸出培养基并冲洗细胞 10 秒 加入 10 毫升冷 PBS，加入 10 毫升。ED 一种培养基，补充 25 毫克/毫升硫酸葡聚糖。

这将使寄生虫上的聚糖结合表面蛋白饱和，以便它们可以重新连接和重新连接宿主细胞。将培养瓶置于 40 摄氏度的加湿培养箱中，含 5% CO2 孵育 26 小时。在此期间，正常折叠的蛋白质将被错误折叠的温度敏感蛋白取代。

第二天，将所选的出口诱导剂在含有 10 mL 的 15 mL 试管中稀释至工作浓度。H-B-S-S-C 补充每毫升 25 毫克葡聚糖硫酸盐。将其置于水浴中，预热溶液 30 分钟。

从寄生虫感染的培养瓶中吸出培养基，并加入预热的出口诱导剂溶液。如随附文件所示，在 37 摄氏度下孵育。接下来，吸出培养基并冲洗 10 秒钟。

用 10 毫升冷 PBS，加入 10 毫升 ED 1，每毫升补充 25 毫克、硫酸葡聚糖和 50 微摩尔吡啶 DIO 氨基甲酸酯，然后在 35 摄氏度下孵育 5 小时。孵化后。吸出培养基，用 PBS 冲洗 10 秒钟。

然后加入 10 毫升。EED 1 培养基，将培养瓶放回 35 摄氏度培养箱中。每天摇晃以驱散出口寄生虫。

继续孵育，直到寄生虫破坏单层。富集筛选后约 7 天，种群繁殖一次传代。然后通过出口测定确认表型。

将 20， 000 个寄生虫接种到 24 孔板的每个孔中，该板含有在盖玻片上生长的汇合 HFF 细胞，在 35 摄氏度的培养箱中孵育 8 小时，以允许在允许的温度下侵入培养基中的所有寄生虫。然后，将板转移到 40 摄氏度的培养箱中 24 小时以诱导表型，并在用 1 毫升 PBS 洗涤每个孔 10 秒后生长含有 8 至 24 种寄生虫的 oles。在室温下，加入 1 毫升出口诱导剂预热并在 H-B-S-S-C 中稀释孵育随附书面方案中描述的时间。

吸出培养基，向每个孔中加入 1 毫升 100% 甲醇进行固定，并在室温下孵育 15 分钟。然后用一毫升室温 PBS 洗涤：洗涤和封固载玻片后，使用具有 40 至 60 x 物镜的显微镜计算 S 出口与细胞内液泡的百分比。在验证了富集的出口突变体群体的表型后，克隆多克隆群体以获得单个寄生虫克隆。

在测定寄生虫浓度后，在 ED 中稀释至每毫升 500 个寄生虫，在含有汇合单层 HFF 细胞的 3 84 孔板中加入一种培养基。用每孔 40 微升 ed 替换培养基，一种使用多通道移液器的培养基。四个多克隆群体表示为红色、蓝色、黄色和绿色。

在此图中，可以在板上克隆以获得该移液器。每孔 40 微升稀释的突变体 1 进入 C3 至 C 12 孔，突变体 2 进入孔 C 13 至 C 22，突变体 3 进入孔 H 3 至 H 12，突变体 4 进入孔 H 13 至 H 22。每个孔中的总体积现在应为 80 微升。

然后使用多通道移液器，上下移液 5 次，将 40 微升转移到起始行下方的行中。通过第 H 行突变体 1 和 2 或第 N 行突变体 3 和 4 继续这些两倍连续稀释。丢弃最后一行中多余的 40 微升。

在 35 摄氏度的培养箱中孵育 7 到 10 天，不要干扰板。下周，在具有 10 至 20 倍物镜的倒置显微镜上检查孔中是否存在单层孔状的单个斑块。每个突变体用单个噬菌斑挑选四个孔，并将寄生虫转移到与 HFF 细胞汇合并填充 5 毫升的 T 12.5 组织培养瓶中。

ED 一种培养基在 35 摄氏度的培养箱中培养寄生虫。每天摇动培养瓶以驱散细胞外寄生虫。这通常需要 7 天时间。

使用各种 EMS 诱变剂浓度和每孔不同数量的寄生虫在六孔板中进行噬菌斑测定。如本视频所示，此处显示的孔上的白点是 EMS 处理板上 HFF 单层中形成的寄生虫斑块。这些噬菌斑测定的结果用于生成暴露于增加剂量的 EMS 和 ENU 的寄生虫的存活曲线。

然后选择诱导 70% 杀伤的剂量进行诱变实验。在不同的实验中，通过流式细胞术评估富集后群体中出口突变表型的百分比，如下所示。当出口突变体与野生型寄生虫起始比率为 10， 000 分之一时，通过富集实现了 80% 的纯度。

然而，当起始比率为 100， 000 个寄生虫中 1 个时，分离的种群仅占 1% 到 2%这些数据表明，筛选的富集能力是 1000 倍。在第三个实验中，钙离子 4 A 2 3 1 8 7 诱导出口。在这些图像中，箭头标记了四种不同的 VAEs，其中包含 4 到 8 种在对照中表达 YFP 的寄生虫。

然而，箭头标记了四组分散的寄生虫，反映了四个独立的出口 VA。因此，突变型与野生型表型的比率可以很容易地通过计数来确定 遵循此程序。可以执行其他方法，如宇宙互补或全基因组测序，以确定致病突变，从而确定感兴趣的基因。

观看此视频后，您应该对如何滴定感兴趣的诱变剂、诱变弓形虫寄生虫种群以及从该诱变剂种群中分离单个温度敏感的出口突变体有很好的了解。不要忘记，使用 param 耐甲胺弓形虫寄生虫可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如护目镜。