高效的小鼠胚胎干细胞分化成运动神经元

该程序的总体目标是将小鼠胚胎干细胞分化为运动神经元。首先培养小鼠，在原代小鼠胚胎成纤维细胞上培养胚胎干细胞，并补充白血病抑制因子。然后通过添加 noggin BFG F 和 FGF 8 通过与视黄酸和平滑激动剂孵育来增强正常化过程，诱导运动神经元规范，然后是轴突伸长和运动神经元成熟。

最后，使用免疫荧光显微镜检查表达强烈 GFP 荧光的分化 MES 细胞与当前现有方案相比，产生大量运动神经元促进了运动神经元疾病的研究。这种将小鼠胚胎干细胞分化为运动神经元的方法更有效。这种方法可以深入了解脊髓性肌萎缩症。

它也可以应用于其他运动神经元疾病，如肌萎缩侧索硬化症 用 8 毫升 0.1% 明胶溶液对原代胚胎小鼠成纤维细胞进行铺板，涂在四个 100 毫米的组织培养皿上。在室温下放置 30 分钟后，丢弃多余的液体。现在将一小瓶活化 PMEF 中的丝裂霉素 C 稀释到 40 毫升 PMEF 培养基板中，并放在四个板上，培养长达一周。

接下来，在 37 度水浴中解冻一小瓶 MES 细胞。在 15 mL 试管中用 5 mL E ES 培养基洗涤细胞。以 800 RPM 离心 5 分钟后。

吸出上清液，将 MES 细胞重悬于 20 毫升含有新鲜添加的白血病抑制因子的 ES 培养基中。继续从 PMEF 培养物中去除 10 毫升培养基，并替换为 10 毫升 HBG 三 ES 细胞悬液。监测 MES 细胞随时间的变化，从 24 小时的小集落到铺板后 72 小时直径约 100 微米的集落。

每天更换培养基以维持细胞增殖以诱导 MES 细胞。分化为运动神经元。小鼠胚胎干细胞必须首先从 PMEF 饲养层细胞中分离出来，然后在诱导当天在悬浮环境中培养。

对于每个 100 毫米 ES 培养物，准备一个涂有 0.1% 明胶的 T one 50 培养瓶。在室温下 30 分钟后，去除多余的明胶并用 PBS 洗涤 3 次。继续小心地从 ES 培养物中吸出培养基，确保不要去除松散附着的菌落。然后用 10 毫升 PBS 洗涤一次。

现在，要将 MES 细胞与 PMEF 分离，加入 3 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA，并孵育 3 至 5 分钟。在 37 摄氏度下，验证干细胞和 PMEF 是否已从板中分离。然后加入 15 mL 新鲜的 ES 培养基，通过移液破坏菌落。

将细胞悬液转移到准备好的明胶包被的 T one 50 培养瓶中，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，使 PFS 附着在糊化表面。现在在 50 毫升管中收获漂浮的 MES 细胞并通过离心沉淀。将细胞重悬于 10 mL 神经分化中。

使用血细胞计数器对培养基进行计数，然后分化接种到 100 mm 悬浮培养皿上。第一天，通过显微镜验证 MES 细胞已经形成称为胚胎体的小漂浮聚集体。由于任何残留的 PMEF 都附着在培养皿上，因此将 ES 悬浮细胞和培养基转移到 15 mL 试管中，然后以 500 RPM 离心 3 分钟。

为了收获胚胎体，从培养基中吸出，小心地加入 10 毫升新鲜神经分化物，将培养基加入沉淀的 ebs 中，然后将细胞接种在新的细菌培养皿培养物中分化 24 小时。第二天，旋转培养皿，将培养基和 EBS 转移到 15 mL 试管中。让 EBS 在重力作用下沉降，然后小心吸出培养基并复苏悬浮 EBS 和 10 毫升运动神经元分化。

在新细菌培养皿中培养基培养 EBS 分化 5 天。第七天，验证 EBS 的直径约为 150 至 200 微米，并在分化时表达强 GFP 信号。第五天，解离 EBS 前两天，将 12 毫米圆形盖玻片放在 24 孔板的底部。

然后加入 0.5 毫升每毫升 100 微克的聚 DL 鸟氨酸，并在 4 摄氏度下孵育过夜。吸出 poly DL 鸟氨酸风干板，并在组织培养罩中盖上玻片。用双蒸水冲洗板孔 3 次。

风干以涂覆盖玻片。在 5 毫升冰冷的 1 个 XPBS 中新鲜稀释每毫升 2 微克小鼠层粘连蛋白。每孔添加 0.5 毫升，并在 4 摄氏度下孵育过夜。

分化时用 PBS 洗涤两次。第 7 天，将 EBS 收集到 15 毫升试管中，并让 EBS 在重力作用下沉降。用 PBS 洗涤四次后，向 EBS 中加入 1 毫升 ACU max，轻轻混合并在室温下孵育 5 分钟，然后吸出覆盖 ebs 的过量 ACU max。

现在加入 3 mL MND 培养基，并使用 1 mL einor 微量移液器移液约 20 次分离 EBS，然后在室温下孵育 2 分钟，将细胞悬液通过细胞训练帽进入 12 x 75 mm 的试管中。用过滤器保留的剩余团块和细胞重复此解离步骤，以便在最终的 6 mL 单细胞悬液中富集单细胞的产量。轻轻混合单细胞悬液，并使用血细胞计数器对细胞进行计数，将细胞稀释到完全 MND 培养基中，密度为 2 倍 10 至 5 个细胞/毫升板。

制备的 24 孔板每孔 0.5 毫升细胞悬液，含有聚 DL 鸟氨酸层粘连蛋白包被的盖玻片。分化的细胞在两天后延伸长神经突。在培养中，HBG 3 是一种来源于表达 EGFP 的转基因小鼠的 ES 细胞系，在运动神经元特异性启动子 HB nine 的控制下，具有明确的分化方案。

MES 细胞可用于衍生运动神经元。未分化的 MES 细胞在 fiberblast 饲养层的顶部形成圆形集落。它们的 GFP 表达较弱。

这些 MES 细胞从饲养层分离，并在低附着培养皿上培养以形成胚胎体。分化的 MES 细胞在第 7 天后表达强烈的 GFP 荧光。将分化 EBS 解离并接种在多聚 DL 鸟氨酸层粘连蛋白包被板上。

分化的细胞在培养 2 天后从铺板细胞的细胞体中延伸出长神经突，MES 细胞来源的运动神经元可通过免疫荧光染色来表征。这些 GFP 阳性细胞表达泛神经元标志物神经丝和两个运动神经元特异性标志物。眼睑 1 和胆碱乙酰转移酶 DPI 一起对细胞核进行染色。

我们的两步分化方案提供了一种将 MES 细胞分化为脊髓运动神经元的有效方法。看完这个视频，您应该对如何有效地将小鼠胚胎干细胞分化为运动神经元有所了解。总之，请记住，高质量的小鼠胚胎干细胞是有效产生运动神经元的最关键参数。