Name: 高效的小鼠胚胎干细胞分化成运动神经元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学习高效分化小鼠胚胎干细胞为运动神经元的方法，通过添加Noggin、BFGF和FGF8等因子诱导分化，并利用免疫荧光技术验证特异性标志物表达。该方案可生成大量运动神经元，为研究脊髓性肌萎缩等运动神经元疾病提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本文献谨献给于2011年5月26日逝世的王文兰博士。我们感谢道格拉斯·A·克尔博士慷慨提供本研究所用的HBG3小鼠胚胎干细胞。本研究由Nemours基金会、美国国家研究资源中心（NCRR）INBRE项目下的一项资助（2 RR016472-10）以及NCRR的一项COBRE资助（5 P20 RR020173-05）支持，用于支持位于美国特拉华州威尔明顿市阿尔弗雷德·I·杜邦儿童医院的儿科研究中心。

1. 步骤1：小鼠胚胎干细胞（mES）培养（耗时：3天）
1. 原代小鼠胚胎成纤维细胞（PMEF）的铺板
<ol>
	<li>用明胶包被四个100-mm组织培养皿，以促进PMEF细胞的黏附。向每个培养皿中加入8 ml的0.1%明胶溶液（StemCell Technologies），于室温孵育30分钟。</li>
	<li>从培养皿中去除多余的明胶溶液，不要冲洗培养皿。</li>
	<li>将一管含有约5 × 106个丝裂霉素C失活的PMEF细胞（Millipore）用40 ml PMEF培养基（见表1中的配方）稀释后，接种至四个100-mm组织培养皿中。PMEF将作为mES细胞的饲养层。</li>
	<li>PMEF应至少在接种mES细胞培养物前一天进行接种。接种后的PMEF在一周内均可使用。</li>
</ol>
2. 培养小鼠胚胎干细胞
为了监测小鼠胚胎干细胞向运动神经元分化效率，我们使用了HBG3细胞系，这是一种来源于转基因小鼠的胚胎干细胞系，该转基因小鼠在运动神经元特异性启动子Hb9的调控下表达eGFP。
<ol>
	<li>在37 °C水浴中解冻1管HBG3小鼠胚胎干细胞（mES细胞，约1 × 107个，由约翰·霍普金斯大学Douglas Kerr博士提供）。将5 ml ES培养基（配方见表1）加入15 ml离心管中，以800 rpm离心5分钟，收集细胞。</li>
	<li>吸除上清液，将mES细胞重悬于20 ml含有新鲜添加的白血病抑制因子（LIF）的ES培养基中，LIF终浓度为10 ng/ml。注意：LIF应在使用当天添加，以维持mES细胞的未分化状态。</li>
	<li>从每皿PMEF培养皿中移除10 ml PMEF培养基，并向每皿中加入10 ml HBG3 mES细胞悬液。</li>
	<li>接种后24小时，mES细胞形成小的克隆集落，大小类似于图1B中箭头所示的克隆。接种后72小时，克隆体积增大，许多直径约为100 μm（图1B中箭头指示）。此时细胞已准备好进行分化。应每天更换培养基以维持细胞增殖。</li>
</ol>
2. 步骤2：神经诱导（用时：2天）
为了诱导小鼠胚胎干细胞（mES细胞）分化为运动神经元，需要将mES细胞从原代小鼠胚胎成纤维细胞（PMEF）中分离，并在悬浮环境中培养。使用明胶包被的培养瓶来分离PMEF与mES细胞。
<ol>
	<li>当小鼠胚胎干细胞（mES）集落准备进行神经诱导时（定义为分化第0天），在室温下用0.1%明胶（每瓶18 ml）包被2个T150培养瓶，孵育30分钟，随后去除多余明胶，并用1×PBS洗涤三次。注意：每100 mm培养皿的培养物需要一个经0.1%明胶包被的T150培养瓶，用于分离PMEF。</li>
	<li>小心吸去培养基，注意不要扰动松散附着的集落。加入10 ml PBS短暂冲洗，然后吸除，完成洗涤步骤。</li>
	<li>为分离mES细胞与PMEF，加入0.25%胰蛋白酶/EDTA（每皿3 ml，StemCell Technologies），在37 °C孵育3–5分钟，直至干细胞和PMEF从培养皿表面脱落。加入15 ml不含LIF的新鲜ES培养基，用移液器反复吹打细胞以分散集落（约15–20次）。随后将细胞悬液转移至一个0.1%明胶包被的T150培养瓶中，在37 °C孵育30分钟。孵育后，PMEF应贴附于明胶化表面，而ES细胞则保持悬浮状态。收集悬浮的mES细胞至50 ml离心管中。</li>
	<li>以800 rpm离心，弃上清，将细胞重悬于10 ml神经分化培养基中（配方见表1）。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，随后将约2 × 106个mES细胞接种至100 mm细菌培养皿或悬浮培养皿中。此类培养皿支持悬浮培养物的生长，并促进胚状体（EBs）的形成。</li>
	<li>在分化第1天，mES细胞形成可在光学显微镜下观察到的小型悬浮聚集体（EBs），任何残留的PMEF会贴附于培养皿表面。将悬浮细胞及培养基转移至15 ml离心管中，以低速（500 rpm）离心3分钟。小心吸除上清，向沉淀的EBs中加入10 ml新鲜神经分化培养基，然后将细胞接种至新的细菌培养皿中。此步骤除补充培养基外，还可去除前一步骤中残留的PMEF。</li>
	<li>在分化第2天，EBs已准备好诱导为运动神经元。</li>
</ol>
3. 步骤3：运动神经元特化（时间：5天）
<ol>
	<li>在分化第2天，轻轻摇晃培养皿，将培养基和拟胚体（EBs）转移至15 ml离心管中。让拟胚体自然沉降（约10分钟）或低速离心（500 rpm，3分钟）。</li>
	<li>小心吸除培养基，用10 ml运动神经元分化（MND）培养基重悬拟胚体（见表1中的配方）。将拟胚体接种至新的细菌培养皿中，并每天更换培养基，持续5天。</li>
	<li>在分化第7天，拟胚体直径应约为150 - 200 μm，并表现出强烈的GFP信号（图1C）。此时拟胚体已准备好进行解离，并接种到聚-DL-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的培养皿或盖玻片上。</li>
</ol>
4. 步骤4：聚-DL-鸟氨酸/层粘连蛋白包被盖玻片的制备（耗时：2天）
在拟胚体解离前两天（即分化第5天），准备经多聚-DL-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的盖玻片。
<ol>
	<li>将12 mm圆形盖玻片（Warner Instruments）放置于24孔板底部。将25 mg聚-DL-鸟氨酸（Sigma-Aldrich）溶于25 ml无菌双蒸水（d2H2O）中，配制成10倍储存液（1 mg/ml）。使用前，用d2H2O将聚-DL-鸟氨酸按1:10稀释，得到100 μg/ml的工作浓度溶液。每孔加入0.5 ml，4 °C孵育过夜。</li>
	<li>次日（分化第6天），吸除聚-DL-鸟氨酸溶液，将24孔板及盖玻片置于生物安全柜中自然晾干。用d2H2O冲洗孔板3次，再于室温下晾干1小时。</li>
	<li>将1 mg小鼠层粘连蛋白（Millipore）溶于5 ml预冷的1×PBS中，配制成100倍储存液（200 μg/ml）。使用前，用预冷的1×PBS按1:100稀释（含层粘连蛋白2 μg/ml）。每孔加入0.5 ml，4 °C孵育过夜。接种细胞前，应吸除多余层粘连蛋白溶液，并用1×PBS冲洗孔板2次。盖玻片可保存于MND培养基中（0.5 ml/孔）。</li>
</ol>
5. 步骤 5：轴突伸长（时间：2 天）
<ol>
	<li>在分化第7天，将拟胚体收集至15 ml离心管中，静置使其沉降（约3分钟）。吸除培养基，用PBS重悬拟胚体。再次静置后吸除PBS。重复此步骤3次。向拟胚体中加入1 ml Accumax（Millipore），轻轻混匀，在室温下孵育5分钟。然后吸除覆盖在拟胚体表面的过量Accumax。</li>
	<li>为解离拟胚体，加入3 ml MND培养基。使用1 ml Eppendorf移液器（蓝色吸头）反复吹打20次以破碎拟胚体。室温孵育2分钟。将细胞悬液转移至带有细胞滤网帽的12x75 mm试管（BD Falcon）中，以获得单细胞悬液。对滤网上残留的细胞团块和细胞重复此解离步骤，以提高单细胞得率。最终单细胞悬液体积为6 ml。</li>
	<li>轻轻混匀该单细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。将细胞用MND培养基（添加10 ng/ml BDNF、GDNF、CNTF和NT-3）稀释至浓度为2×105 个细胞/ml。将细胞悬液（0.5 ml/孔）加入含有聚-DL-鸟氨酸/层粘连蛋白包被盖玻片（按上述方法预先制备）的24孔板中。分化后的细胞在培养2天后可延伸出较长的神经突（图1D）。</li>
</ol>
6. 代表性结果
图1A 展示了本实验方案的流程概要。在第1步中，将小鼠胚胎干细胞（mES细胞）培养在PMES饲养层上，并添加白血病抑制因子（LIF）以防止其自发分化。通常情况下，未分化的mES细胞集落呈圆形、致密，边缘清晰，彼此之间不相互接触。一般建议每2~3天以1:4的比例传代一次。然而，不同细胞系的生长速度各不相同，传代比例需根据经验确定。图1B 中的箭头指示了mES细胞在PMES饲养层上培养3天后的典型形态。这些集落较大（直径50-100 μm），但仍保持圆形且边界清晰。在此阶段，集落已准备好进行分化或传代培养。图1B 中的箭头头指示的是接种后24小时常见的小型mES细胞集落。接种4天后，mES细胞会过度生长，表现为细胞扁平化、边界模糊，提示其已开始分化。此类细胞不适合用于向神经元细胞的分化。
为了将小鼠胚胎干细胞（mES细胞）分化为运动神经元，需在悬浮条件下培养mES细胞以促进拟胚体（EB）的形成。在第2步中，将ES细胞转移至无饲养层的培养表面，以促进EB形成。在此步骤中，细胞在添加了Noggin、bFGF和FGF-8的神经分化培养基中孵育2天，以诱导其向神经谱系分化。在分化第1天，可在显微镜下观察到小型EB，它们应悬浮于培养基中。分化第1天也可能残留原始小鼠胚胎成纤维细胞（PMEF），必须将其去除。这些PMEF会贴附于细菌培养皿上，因此在将EB传代至新的细菌培养皿时可被清除。因此，在分化第2天，培养皿中应几乎看不到或完全无PMEF残留。在第3步中，持续将EB转移至新培养皿可确保彻底清除任何残留的PMEF。EB在添加了视黄酸（RA）和SAG的运动神经元分化（MND）培养基中继续培养5天，以诱导其分化为运动神经元。在培养过程中，EB持续增大，在分化第3~4天肉眼即可观察到。图1C展示了分化第7天EB的显微形态。与未分化的细胞不同，EB因表达绿色荧光蛋白（GFP）而呈现强烈荧光。这些EB已达到最佳分化状态，可进行解离。流式细胞术分析显示，解离后的EB中，有51% ± 0.8%的细胞分化为GFP阳性细胞5。在第5步中，将这些运动神经元在含有GDNF、CNTF、BDNF和NT3的条件下继续培养，可促进其长出较长的轴突突起。图1D展示了EB解离后接种2天时分化细胞的形态，可见从贴壁细胞胞体延伸出的长神经突。免疫荧光染色结果显示，GFP阳性细胞表达泛神经元标志物（神经丝蛋白中链）以及两种运动神经元特异性标志物（Islet-1和胆碱乙酰转移酶，图2）。
<img alt="显示ESC培养、诱导、伸长过程的显微镜图像的神经分化过程示意图。" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 小鼠胚胎干细胞（mES细胞）向运动神经元的分化过程（图片改编自Wu et al.5）。A) mES细胞向运动神经元分化的流程示意图。B) 未分化的mES细胞在成纤维细胞饲养层顶部形成圆形克隆，GFP表达较弱。C) 将mES细胞从饲养层分离后，在低黏附培养皿中培养以形成拟胚体（EBs）。在分化过程的前两天，细胞暴露于50 ng/ml Noggin、20 ng/ml bFGF和20 ng/ml FGF-8中；随后用1 μM视黄酸和1 μM sonic hedgehog激动剂SAG诱导分化5天。分化的mES细胞表现出强烈的GFP荧光。D) 经7天分化后，将拟胚体解离并接种于聚-DL-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的培养板上。分化后的细胞在培养2天后延伸出长长的神经突起。比例尺 = 200 μm。MN = 运动神经元。B、C和D为明场图像，B'、C'和D'为相应的荧光图像。
<img alt="神经元中GFP、ChAT、DAPI的荧光显微镜图像；细胞标记、蛋白质表达分析。" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 小鼠胚胎干细胞来源的运动神经元的表征。神经丝中分子链（NF-M，红色）、ChAT（红色）和Islet-1（红色）的免疫荧光染色与GFP（绿色）表达共定位。使用DAPI（蓝色）标记细胞核。比例尺 = 50 μm。

<ol><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li>
<li>Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+motoneurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).</li>
<li>Wichterle, H., Peljto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+to+spinal+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).</li>
<li>Kiris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies%2C+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li>
<li>Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+assessment+of+a+cell+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy.</a> BMC Neurosci. 12, 25(2011).</li>
<li>McMahon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin-mediated+antagonism+of+BMP+signaling+is+required+for+growth+and+patterning+of+the+neural+tube+and+somite%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite.</a> Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).</li>
<li>Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+posterior+neural+tissue+is+induced+by+FGF+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo.</a> Development. 125, 473-484 (1998).</li>
<li>Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+truncated+FGF+receptor+blocks+neural+induction+by+endogenous+Xenopus+inducers%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers.</a> Development. 122, 869-880 (1996).</li>
<li>Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purmorphamine+activates+the+Hedgehog+pathway+by+targeting+Smoothened%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened.</a> Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).</li>
<li>Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+FGF8+signaling+from+the+midbrain-hindbrain+junction+regulates+growth+and+polarity+in+the+developing+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain.</a> Development. 124, 959-969 (1997).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

mES细胞的质量是高效生成运动神经元最关键的参数。必须将mES细胞培养在PMEF上以防止其自发分化。添加LIF有助于维持mES细胞的未分化状态。由于mES细胞每12-15小时分裂一次，培养基会迅速耗尽，必须每天更换。
高效激活Shh通路是诱导运动神经元特化所需的关键参数。Shh蛋白（R&amp;D System）以及Shh信号通路激动剂，如Hh激动剂HhAg1.3（Curis, Inc.）、purmorphamine（Calbiochem）和SAG（EMD Chemicals），均已被用于促进运动神经元的形成1-3,10,11。我们发现，在诱导细胞向运动神经元表型分化方面，SAG比purmorphamine更有效5。使用1–2.5 μM purmorphamine联合1 μM RA时，分化效率从未超过20%。然而，在我们实验中，1 μM RA与1 μM SAG联用，在未进行神经诱导步骤的实验流程中即可达到约25%的分化效率。
为了进一步提高分化效率，我们在运动神经元特化步骤之前增加了...

<table><tbody><tr><td>PMEF </td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-H</td><td>N.A.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td>N.A.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td>10%</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>1%</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15240-063</td><td>1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>干细胞技术公司</td><td>36250</td><td>N.A.</td></tr><tr><td>胚胎干细胞合格胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>16141-079</td><td>15%</td></tr><tr><td>GlutaMax-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>1%</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1%</td></tr><tr><td>核苷</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-008-D</td><td>1%</td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-007-E</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-AB2-C</td><td>1%</td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>LIF2010</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>干细胞技术公司</td><td>36250</td><td>N.A.</td></tr><tr><td>ES Cult FBS</td><td>干细胞技术公司</td><td>06905</td><td>15%</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1%</td></tr><tr><td>单硫代甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-6145</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Invitrogen</td><td>PHC1506</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF-8</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0274</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0024</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>ES-Cult 基础培养基-A</td><td>干细胞技术公司</td><td>5801</td><td>N.A.</td></tr><tr><td>无血清替代物</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>10%</td></tr><tr><td>N-2 添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>1%</td></tr><tr><td>ITS Supplement-B</td><td>干细胞技术公司</td><td>07155</td><td>1% </td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>干细胞技术公司</td><td>07157</td><td>1%</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-AB2-C</td><td>1%</td></tr><tr><td>GlutaMax-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>1%</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-8270</td><td>0.15% 溶于 d&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>干细胞技术公司</td><td>07159</td><td>5 &amp;#x03BC;g/ml </td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>20 &amp;#x03BC;g/ml 溶于 d&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-007-E</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-2625</td><td>1 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>SAG</td><td>EMD Millipore</td><td>566660</td><td>1 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>ES-Cult 基础培养基-A</td><td>干细胞技术公司</td><td>5801</td><td>N.A.</td></tr><tr><td>无血清替代物</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>10%</td></tr><tr><td>N-2 添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>1%</td></tr><tr><td>ITS Supplement-B</td><td>干细胞技术公司</td><td>07155</td><td>1% </td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>干细胞技术公司</td><td>07157</td><td>1%</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-AB2-C</td><td>1%</td></tr><tr><td>GlutaMax-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>1%</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-8270</td><td>0.15% 溶于 d&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>干细胞技术公司</td><td>07159</td><td>5 &amp;#x03BC;g/ml </td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>20 &amp;#x03BC;g/ml 溶于 d&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-007-E</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>248-BD-005/CF</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>CNTF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>257-NY-010/CF</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>212-GD-010/CF</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>NT-3</td><td>R&amp;D Systems</td><td>267-N3-005/CF</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td colspan="4">N.A. = 不适用</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 1.&lt;/strong&gt; 小鼠胚胎干细胞培养或分化用 PMEF 及培养基</td></tr><tr><td>0.1% 明胶</td><td>干细胞技术公司</td><td>07903</td><td>N.A.</td></tr><tr><td>聚-DL-鸟氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0421</td><td>0.1 mg/ml 溶于 d&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>小鼠层粘连蛋白</td><td>EMD Millipore</td><td>CC095</td><td>2 &amp;#x03BC;g/ml 溶于 PBS</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>干细胞技术公司</td><td>07901</td><td>N.A.</td></tr><tr><td>Accumax</td><td>EMD Millipore</td><td>SCR006</td><td>N.A.</td></tr><tr><td colspan="4">N.A. = 不适用</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 2.&lt;/strong&gt; 包被与解离试剂</td></tr></tbody></table>

小鼠胚胎干细胞高效分化为运动神经元

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

将胚胎干细胞（ES细胞）直接分化为功能性运动神经元，为研究疾病机制、筛选新药物化合物以及开发运动神经元疾病（如脊髓性肌萎缩症（SMA）和肌萎缩侧索硬化症（ALS））的新疗法提供了有前景的资源。目前许多方案采用视黄酸（RA）与音猬因子（Shh）联合使用，以诱导小鼠胚胎干细胞（mES细胞）向运动神经元分化1-4。然而，mES细胞向运动神经元的分化效率迄今仅达到中等水平。我们开发了一种两步分化方案5，与现有成熟方案相比，显著提高了分化效率。第一步是通过添加Noggin和成纤维细胞生长因子（FGFs）来增强神经化过程。Noggin是一种骨形态发生蛋白（BMP）拮抗剂，根据神经发生的“默认模型”，其参与神经诱导，并促进前部神经模式的形成6。FGF信号通路与Noggin协同作用，通过促进后部神经特性，共同诱导神经组织的形成7-9。在此步骤中，mES细胞经Noggin、bFGF和FGF-8诱导两天，以促进其向神经谱系分化。第二步是诱导运动神经元特化。经Noggin/FGFs处理的mES细胞随后在RA和Shh激动剂Smoothened激动剂（SAG）中孵育5天，以促进运动神经元的生成。为监测mES细胞向运动神经元的分化过程，我们使用了一种转基因小鼠来源的ES细胞系，该细胞系在运动神经元特异性启动子Hb9的调控下表达eGFP1。采用这一稳健的方案，我们实现了51±0.8%的分化效率（n = 3；p &lt; 0.01，Student's t-检验）5。免疫荧光染色结果显示，GFP+细胞表达运动神经元特异性标志物Islet-1和胆碱乙酰转移酶（ChAT）。我们的两步分化方案为高效地将mES细胞分化为脊髓运动神经元提供了一种有效途径。

我们开发了一种新方案以提高效率 体外 小鼠胚胎干细胞向运动神经元的分化。通过免疫组织化学技术检测到神经元及运动神经元标志物的表达，表明已分化的胚胎干细胞具备运动神经元的特征。

将胚胎干细胞（ES细胞）直接分化为功能性运动神经元是一种有前景的资源，可用于研究疾病机制、筛选药物……

本实验的总体目标是将小鼠胚胎干细胞分化为运动神经元。首先，将小鼠胚胎干细胞接种于原代小鼠胚胎成纤维细胞上进行培养，并添加白血病抑制因子。随后，通过加入noggin、BFGF和FGF8促进标准化过程，再通过与视黄酸和smoothened激动剂共孵育以诱导运动神经元特化，之后进行轴突伸长和运动神经元成熟。最后，利用免疫荧光显微镜观察已分化并表达强GFP荧光的MES细胞。与现有的常规方案相比，该方法能够生成大量运动神经元，从而促进运动神经元疾病的研究。这种将小鼠胚胎干细胞分化为运动神经元的方法效率更高，可为脊髓性肌萎缩症的研究提供重要见解。该方法也可应用于其他运动神经元疾病，例如肌萎缩侧索硬化症。接种原代胚胎小鼠成纤维细胞时，用八毫升0.1%明胶溶液包被四个100毫米的组织培养皿。室温孵育30分钟后，弃去多余液体。将一管丝裂霉素C在活化的PMEF中稀释后加入40毫升PMEF培养基中，分装至四个培养皿，并培养长达一周时间。接下来，在37摄氏度水浴中解冻一管MES细胞。用5毫升E ES培养基在15毫升离心管中洗涤细胞。在800转/分钟下离心5分钟。吸弃上清液，并将 MES 细胞重悬于 20 毫升新鲜添加白血病抑制因子的 ES 培养基中。从 PMEF 培养物中移除 10 毫升培养基，替换为 10 毫升 HBG 三型 ES 细胞悬液。接种后持续观察 MES 细胞的生长情况，从 24 小时时的小克隆逐渐发育为 72 小时时直径约 100 微米的克隆。每天更换培养基以维持细胞增殖，用于诱导生成中脑样细胞。向运动神经元分化。小鼠胚胎干细胞必须首先从 PMEF 饲养层细胞中分离，然后在诱导当天置于悬浮环境中培养。每 100 毫米 ES 培养物，准备一个经 0.1% 明胶包被的 T150 培养瓶。室温孵育 30 分钟后，吸除多余明胶，并用 PBS 洗涤三次。随后小心吸除 ES 培养物中的培养基，注意不要使松散贴壁的克隆脱落。然后用 10 毫升 PBS 洗涤一次。现在，为了将MES细胞与PMEF分离，加入3毫升0.25%胰蛋白酶EDTA，于37摄氏度孵育3至5分钟。确认干细胞和PMEF已从培养皿上脱落。然后加入15毫升新鲜ES培养基，通过移液吹打使细胞集落分散。将细胞悬液转移至预先包被明胶的T150培养瓶中，在37摄氏度孵育30分钟，使PFS细胞贴附于明胶化表面。随后收集悬浮的MES细胞至50毫升离心管中，通过离心形成细胞沉淀。将细胞重悬于10毫升神经分化培养基中。使用血细胞计数板对培养基中的细胞进行计数，然后在分化当天将其接种至100毫米的悬浮培养皿中。第一天，通过显微镜观察确认胚胎干细胞（MES细胞）已形成称为胚胎体的小型悬浮细胞团。由于可能存在残留的PMEF细胞贴壁生长，将胚胎干细胞悬液及培养基转移至15毫升离心管中，随后以500 RPM离心3分钟。收集拟胚体时，小心吸除培养基，向沉淀的拟胚体中加入10毫升新鲜的神经分化培养基，然后将细胞接种至新的细菌培养皿中，继续分化培养24小时。第二天，轻轻摇晃培养皿，将培养基和拟胚体转移至15毫升离心管中。让拟胚体依靠重力自然沉降，小心吸除上清液，再用10毫升运动神经元分化培养基重悬拟胚体。将 EBS 在新的细菌培养皿中用 EBS 培养基培养五天以诱导分化。第七天，确认 EBS 的直径约为 150 至 200 微米，并在分化过程中表现出强烈的 GFP 信号。第五天，即在消化 EBS 前两天，将 12 毫米的圆形盖玻片放置于 24 孔板底部。然后加入 0.5 毫升浓度为 100 微克/毫升的聚-DL-鸟氨酸，在 4 摄氏度下孵育过夜。在组织培养超净台中吸除聚-DL-鸟氨酸，使培养板和盖玻片风干。用双蒸水冲洗培养板孔三次。让盖玻片在空气中干燥以完成包被。将鼠尾层粘连蛋白新鲜稀释为每毫升含2微克，溶于5毫升冰上预冷的1×PBS中。每孔加入0.5毫升，4摄氏度孵育过夜。在分化过程中用 PBS 洗涤两次。第7天，将拟胚体（EBS）收集至15毫升离心管中，静置使其自然沉降。用 PBS 洗涤四次后，向 EBS 中轻轻加入1毫升 ACU max，轻柔混匀，在室温下孵育5分钟，然后吸除覆盖在 EBS 上的多余 ACU max。现在加入三毫升 MND 培养基，使用一毫升微量移液器反复吹打约 20 次以解离 EBS，然后在室温下孵育两分钟，将细胞悬液通过细胞滤帽转移至 12 × 75 毫米试管中。对滤膜上残留的剩余细胞团块和细胞重复此解离步骤，以富集单细胞，最终获得六毫升的单细胞悬液。轻轻混匀单细胞悬液，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞稀释至完全 MND 培养基中，调整细胞密度为每毫升 2 × 10⁵ 个细胞后进行接种。每孔加入0.5毫升细胞悬液至已制备的24孔板中，孔内含有多聚DL鸟氨酸-层粘连蛋白包被的盖玻片。分化细胞在两天后伸出长长的神经突。在培养中，HBG3是一种胚胎干细胞系，来源于经基因修饰的小鼠，该小鼠在运动神经元特异性启动子HB9调控下表达EGFP，并采用特定的分化方案进行诱导分化。可以利用MES细胞来诱导生成运动神经元。未分化的MES细胞在成纤维细胞饲养层上方形成圆形克隆集落，且表现出微弱的GFP表达。这些MES细胞从饲养层中分离，并在低黏附培养皿中培养以形成胚胎小体。分化后的MES细胞在第7天后表现出强烈的GFP荧光。将分化后的EBs解离后接种于包被有多聚DL鸟氨酸和层粘连蛋白的培养板上。培养两天后，分化细胞从贴壁细胞的细胞体延伸出长长的神经突，可通过免疫荧光染色对MES细胞来源的运动神经元进行表征。这些GFP阳性细胞表达泛神经元标志物神经丝蛋白以及两种运动神经元特异性标志物。Eylid one和胆碱乙酰转移酶DPI对细胞核进行共染。我们的两步分化方案提供了一种高效地将MES细胞分化为脊髓运动神经元的方法。在观看本视频后，您应能够掌握如何高效地将小鼠胚胎干细胞分化为运动神经元。总之，请记住，高质量的小鼠胚胎干细胞是高效生成运动神经元最关键的参数。

efficient-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-into-motor

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

高效的小鼠胚胎干细胞分化成运动神经元

我们介绍一种基于小分子的方案，用于将小鼠胚胎干细胞分化为少突胶质前体细胞（OPCs）。该方案可在30天内高效地生成Olig2+NG2+的OPCs。我们还描述了一种生成“可放电”OPCs的方法，这类细胞能够产生动作电位。...

胚胎干细胞向少突胶质细胞前体的分化

本视频演示了一种方法 体外 从小鼠胚胎干细胞（mESCs）生成神经前体细胞（NPCs）。将mESCs在悬浮培养中形成拟胚体（EBs），随后诱导其分化为NPCs 通过...

一种从小鼠胚胎干细胞生成神经前体细胞的技术

本视频展示了一种将脊髓神经前体细胞（NPCs）分化为运动神经元的方法。该方法详细介绍了在包被的培养板上使用特定培养基培养NPCs的过程，该培养基中添加了特定的抑制剂，旨在促进NPCs向成熟运动神经元的分化。...

脊髓神经前体细胞向运动神经元的分化

本视频展示了一种将胚胎干细胞分化为具有功能性突触的神经元网络群体的技术。该方法概述了胚胎干细胞向神经元分化的步骤、神经元网络形成的诱导过程，以及培养物中网络化神经元的富集方法。...

将小鼠胚胎干细胞分化为神经元网络群体

本视频展示了将人iPSCs分化为运动神经元的过程。其原理是利用经过基因改造、可表达特定转录因子的iPSCs。当在含有多西环素的培养基中培养时，该抗生素会诱导转录因子的表达，从而促进iPSCs向运动神经元前体细胞分化。最终，将这些前体细胞在神经元培养基中培养，以获得成熟且具有功能的运动神经元。...

将基因编辑的人诱导多能干细胞分化为功能性运动神经元

本方案详细描述了使用无血清单层培养法从胚胎干细胞诱导生成神经前体细胞的方法。这些前体细胞可用于分化为成熟的神经细胞类型，或用于研究神经特化过程，并可适用于多孔板形式的化合物筛选高通量扩增。...

小鼠胚胎干细胞在无血清单层培养条件下的神经分化

本方案描述了一种利用改良的拟胚体转单层法从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞及有丝分裂后中间神经元前体的方法。这些前体细胞可用于 体外...

小鼠胚胎干细胞向皮层中间神经元前体细胞的分化

本方案通过可诱导的piggyBac载体异位表达转录因子，可快速高效地将诱导性多能干细胞转化为具有脊髓或颅脑特征的运动神经元。...

利用PiggyBac载体将人诱导性多能干细胞（iPSCs）转化为功能性脊髓和颅脑运动神经元

本文介绍了一种人类胚胎干细胞单细胞培养及其后续分化为神经前体细胞的实验方案。该方案操作简便、稳定可靠、可扩展性强，适用于药物筛选和再生医学应用。...

利用人胚胎干细胞单细胞培养实现高效神经分化

本文建立了一种低成本且易于操作的方法，可实现胚胎干细胞向神经元的快速高效分化。该方法适用于在各实验室中推广应用，可为神经科学研究提供有力工具。...

小鼠胚胎干细胞体外神经元分化

我们描述了利用悬滴法将小鼠胚胎干细胞在体外分化为神经元细胞的实验步骤。此外，我们通过RT-qPCR、免疫荧光、RNA测序和流式细胞术进行了全面的表型分析。...

小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞及神经元的分化与鉴定

学习高效分化小鼠胚胎干细胞为运动神经元的方法，通过添加Noggin、BFGF和FGF8等因子诱导分化，并利用免疫荧光技术验证特异性标志物表达。该方案可生成大量运动神经元，为研究脊髓性肌萎缩等运动神经元疾病提供重要工具。

小鼠胚胎干细胞高效分化为运动神经元

探索更多视频