Name: 过敏性气道炎症在肺树突状细胞的成熟和迁移分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 了解肺树突状细胞在卵清蛋白诱导的过敏性气道炎症中的成熟与迁移分析方法。该技术利用流式细胞术评估小鼠肺部DC细胞向纵隔淋巴结的迁移动态，为免疫学研究提供关键工具。

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本工作由加拿大卫生研究院（CIHR）和加拿大囊性纤维化基金会（CF Canada）向 Jim Hu 博士提供的资助，以及加拿大囊性纤维化基金会授予 Rahul Kushwah 的博士生奖学金资助。

1. 卵清蛋白致敏小鼠
<ol>
 <li>将OVA（V型；Sigma，MO）溶于无菌PBS中，配制成1 mg/ml的溶液（该溶液可保存于-80 °C）。</li>
 <li>为制备OVA-Alum混合物，取Alum置于离心管中，在涡旋振荡条件下按1:1比例逐滴加入OVA溶液。混合后持续搅拌30分钟，配制完成后立即使用。</li>
 <li>使用1 ml注射器，向小鼠腹腔内注射0.2 ml该混合物，并在2周后重复注射一次。</li>
</ol>
2. 使用FITC标记的卵清蛋白对小鼠进行鼻内激发
<ol>
 <li>在第二次注射 OVA-Alum 后 7 天，小鼠即可通过鼻内途径进行 OVA-FITC 激发。</li>
 <li>使用无菌 PBS 配制 OVA-FITC（Sigma）溶液，浓度为 1 mg/ml，并分装后于 -80 °C 保存。</li>
 <li>在 50 ml 离心管底部放置无菌纱布，在通风橱内将 5 ml Aerrane 加入纱布上。为麻醉小鼠，将小鼠放入管中约 5–10 秒，使其吸入麻醉气体。</li>
 <li>将麻醉后的小鼠保持直立姿势，使用无菌移液器吸头以逐滴方式向小鼠鼻孔滴加 100 μl OVA-FITC 溶液。</li>
 <li>在接下来的两天中，继续每天重复一次鼻内 OVA-FITC 激发。</li>
</ol>
3. 肺脏及引流淋巴结单细胞悬液的制备
<ol>
 <li>使用戊巴比妥钠腹腔注射处死小鼠。</li>
 <li>为了减少可能干扰树突状细胞（DC）分析的巨噬细胞污染，需进行肺灌洗。进行肺灌洗时，短暂暴露小鼠气管并插入导管和注射器；使用含5 mM EDTA的冰冻PBS冲洗下呼吸道3次，以清除肺泡腔中的细胞。</li>
 <li>通过右心室灌注10 ml含10 U/ml肝素的PBS，以去除肺血管中的血细胞。持续灌注直至肺组织变为白色，表明大部分血细胞已被清除。此步骤对去除外周血中的污染细胞尤为重要。</li>
 <li>解剖取出肺组织，分离纵隔淋巴结（MLN），并将淋巴结置于另一培养皿中。（尽量减少组织暴露于光照下，以防止FITC荧光淬灭。）</li>
 <li>将肺组织置于培养皿中，用剪刀剪碎。随后在37 °C条件下使用250 U/ml Collagenase D（Roche）消化25分钟，并加入EDTA（终浓度10 mM）继续孵育5分钟以终止胶原酶活性。</li>
 <li>将消化后的肺组织碎片通过100 μm细胞筛网过滤，并进行低渗裂解以去除红细胞。所得单细胞悬液可用于后续树突状细胞的分析。</li>
 <li>为制备MLN的单细胞悬液，使用细针轻轻研磨MLN，并按上述方法用胶原酶消化，随后通过细胞筛网过滤。</li>
</ol>
4. 染色检测树突状细胞标志物以评估成熟/迁移
<ol>
 <li>为了鉴定肺部的树突状细胞（DCs），需进行 CD11c 和 CD11b 染色。此外，为评估其成熟状态，还需进行 CD86 和 CD80 染色，这两种分子在树突状细胞成熟过程中表达上调。在纵隔淋巴结（MLN）中鉴定出的 CD11c+CD11b+OVA-FITC+ 细胞，被认为是响应 OVA 气道刺激后从肺部迁移至 MLN 的肺源性树突状细胞。</li>
 <li>将细胞重悬于 FACS 缓冲液（含 1% FBS 和 1 mM EDTA 的 PBS）中，浓度为 10 × 106 个细胞/ml，并每管分装 150 μl 细胞悬液用于流式染色。为鉴定肺部树突状细胞，需设置以下染色对照：未染色对照（未接触 OVA-FITC 的小鼠肺细胞）、OVA-FITC 单染对照、CD11c 单染对照、CD11b 单染对照、CD11b+CD11c+ 双染对照、CD11b+OVA-FITC+ 双染对照、CD11c+OVA-FITC+ 双染对照、MHC II 单染对照、CD86 单染对照、CD80 单染对照，以及待测样本：OVA-FITC+CD11c+CD11b+MHCII+、OVA-FITC+CD11c+CD11b+CD86+ 和 OVA-FITC+CD11c+CD11b+CD80+。</li>
 <li>为评估树突状细胞迁移情况，需对来自纵隔淋巴结（MLN）的单细胞悬液进行绝对细胞计数，随后准备以下检测管：未染色对照（未接触 OVA-FITC 的小鼠 MLN 细胞）、OVA-FITC 单染对照、CD11c+ 单染对照、CD11b+ 双染对照、CD11b+OVA-FITC+ 双染对照、CD11c+OVA-FITC+ 双染对照，以及 CD11c+CD11b+OVA-FITC+ 样本。</li>
</ol>
5. 典型结果
腹腔致敏诱导气道过敏性炎症所需的时间点至关重要，应按照图1所示进行操作。在腹腔致敏及气道OVA激发后，为确认气道过敏性炎症的建立，可处死部分小鼠，并对肺组织切片进行组织学分析，如图2所示。可通过苏木精-伊红染色（图2A）确认炎性细胞的存在，通过过碘酸-希夫染色（图2B）评估黏液分泌情况。综合上述结果可证实，在OVA致敏小鼠经OVA激发后成功诱导了气道过敏性炎症8。相比之下，经生理盐水处理的小鼠肺组织切片应无任何炎症表现，且无黏液分泌。此外，在OVA激发后，肺部树突状细胞（DCs）会发生成熟并迁移至引流淋巴结。对经OVA致敏和激发小鼠的纵隔淋巴结（MLN）中CD11c+细胞进行分析，预期显示其CD11c+细胞比例高于生理盐水处理小鼠（图3A）。此外，对OVA致敏并激发小鼠MLN中CD11c+CD11b+OVA-FITC+细胞的绝对细胞数量进行分析，预期显示其数量显著高于生理盐水处理小鼠（即高出数倍）（图3B）。
<img alt="OVA致敏、对照方案、示意图；小鼠、腹腔注射、流式细胞术分析流程。" src="/files/ftp_upload/4014/4014fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 诱导小鼠卵清蛋白（OVA）致敏性气道炎症的实验方案，以及使用荧光素异硫氰酸酯标记的卵清蛋白（OVA-FITC）进行气道激发的流程。
<img alt="肺组织切片的苏木精和伊红染色（H&amp;E）及过碘酸雪夫染色（PAS），生理盐水组与OVA致敏组在50倍和200倍显微镜下的比较。" src="/files/ftp_upload/4014/4014fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. OVA致敏后经OVA气道激发可诱导气道过敏性炎症，通过肺组织切片的苏木精和伊红（Hematoxylin &amp; Eosin）染色结果（见图A）可识别；同时可导致气道黏液分泌增加，通过肺组织切片的过碘酸雪夫（Periodic Acid Schiff）染色结果（见图B）可识别。
<img alt="显示生理盐水组与OVA致敏组中CD11c细胞数量的流式细胞术散点图和柱状图。" src="/files/ftp_upload/4014/4014fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. OVA-FITC激发诱导树突状细胞（DC）从肺部迁移至纵隔淋巴结（MLN）。(A) 流式细胞术图显示对照组或OVA致敏小鼠MLN中CD11c+细胞的比例。(B) 生理盐水组或OVA致敏小鼠MLN中CD11c+CD11b+OVA-FITC+细胞的绝对计数。*p&lt;0.05。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4014/4014fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。

<ol><li>Kushwah, R., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+dendritic+cells+in+the+induction+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Role of dendritic cells in the induction of regulatory T cells.</a> Cell Biosci. 20, (2011).</li>
<li>Kushwah, R., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+of+dendritic+cell+subsets+and+their+function+in+the+host+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Complexity of dendritic cell subsets and their function in the host immune system.</a> Immunology. 133, 409-419 (2011).</li>
<li>Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+our+breath+away%3A+dendritic+cells+in+the+pathogenesis+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Taking our breath away: dendritic cells in the pathogenesis of asthma.</a> Nat Rev Immunol. 3, 994-1003 (2003).</li>
<li>Hammad, H., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+epithelial+cells%3A+linking+innate+and+adaptive+immunity+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and epithelial cells: linking innate and adaptive immunity in asthma.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 193-204 (2008).</li>
<li>Lloyd, C. M., Murdoch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerizing+allergic+responses+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tolerizing allergic responses in the lung.</a> Mucosal. Immunol. 3, 334-344 (2010).</li>
<li>Herz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+murine+animal+models+to+study+the+development+of+allergic+bronchial+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The relevance of murine animal models to study the development of allergic bronchial asthma.</a> Immunol. Cell Biol. 74, 209-217 (1038).</li>
<li>Herz, U., Lumpp, U., Daser, A., Gelfand, E. W., Renz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+animal+models+to+study+the+central+role+of+T+cells+in+immediate-type+hypersensitivity+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Murine animal models to study the central role of T cells in immediate-type hypersensitivity responses.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 409, 25-32 (1996).</li>
<li>Nakae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+can+contribute+to+multiple+features+of+ovalbumin-induced+allergic+inflammation+of+the+airways+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Allergy+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">TNF can contribute to multiple features of ovalbumin-induced allergic inflammation of the airways in mice.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 119, 680-686 (2007).</li>
<li>Guth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+environment+determines+unique+phenotype+of+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lung environment determines unique phenotype of alveolar macrophages.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 296, L936-L946 (2009).</li>
<li>Kushwah, R., Cao, H., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pulmonary+T+cell+response+to+helper-dependent+adenoviral+vectors+following+intranasal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of pulmonary T cell response to helper-dependent adenoviral vectors following intranasal delivery.</a> J. Immunol. 180, 4098-4108 (2008).</li>
<li>Kushwah, R., Oliver, J. R., Zhang, J., Siminovitch, K. A., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+dendritic+cells+induce+tolerance+in+mice+through+suppression+of+dendritic+cell+maturation+and+induction+of+antigen-specific+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic dendritic cells induce tolerance in mice through suppression of dendritic cell maturation and induction of antigen-specific regulatory T cells.</a> J. Immunol. 183, 7104-7118 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述方法基于气道激发OVA-FITC，提供了一种基于流式细胞术分析肺树突状细胞（DCs）的技术。该方法可选择性地监测摄取OVA-FITC的肺DCs，因此所检测的DC群体实际上正是参与OVA诱导的过敏性气道炎症过程中气道免疫应答的细胞群体。在对照组小鼠中，由于不存在过敏性气道炎症，引流淋巴结（MLN）中检测到的迁移型DCs（OVA-FITC+ DCs）数量反映了DC迁移的基础速率；而在过敏性气道炎症发生时，DC迁移速率加快，导致MLN中OVA-FITC+ DCs的绝对数量显著增加。与传统的基于免疫组织化学或免疫染色的分析方法相比，该策略具有明显优势，因其可在更短的时间内完成分析，且效率和灵敏度更高。因此，在进行流式细胞术分析时，必须严格按照方法中所述设置适当的对照组。另一个可能影响实验结果的因素是肺组织单细胞悬液的制备过程。因此，在操作过程中需注意避免组织长时间暴露于光照下，以免影响OVA-FITC的荧光信号；同时在肺组织酶解过程中也需格外小心，过度消化可能导致细胞表面标志物的裂解，从而影响后续分析。肺泡巨噬细胞与DCs具有相似的表面标志物谱，这进一步增加了肺DC群体分析的复杂性9。因此，必须对肺进行灌洗以清除可...

<table><tbody><tr><td>卵清蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铝佐剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>77161</td><td></td></tr><tr><td>OVA-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>抗体</td><td>e-Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

过敏性气道炎症期间肺树突状细胞成熟与迁移的分析

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

树突状细胞（DCs）是通过激活抗原特异性T细胞来启动适应性免疫应答的关键参与者。在稳态下，树突状细胞存在于外周组织中；然而，在抗原刺激下，树突状细胞摄取抗原并迅速迁移至引流淋巴结，在此启动针对该抗原的T细胞应答1,2。此外，树突状细胞还在启动自身免疫和过敏性免疫应答中发挥关键作用3。
在肺部环境中，树突状细胞（DCs）在启动免疫反应和诱导免疫耐受方面均发挥着至关重要的作用4。由于持续暴露于大量环境抗原，肺部环境通常具有较强的耐受性5。然而，在部分个体中，这种耐受状态被打破，从而导致过敏和哮喘的发生。在本研究中，我们描述了一种可用于监测致敏抗原诱导的气道DC成熟与迁移的策略。对气道DC成熟和迁移的检测，有助于评估气道过敏性炎症过程中免疫反应的动力学特征，同时也有助于理解后续免疫反应的强度及其潜在机制。
我们的策略基于使用卵清蛋白作为致敏剂。由卵清蛋白诱导的过敏性哮喘是一种广泛应用的模型，可重现哮喘过程中出现的气道嗜酸性粒细胞增多、肺部炎症以及IgE水平升高等特征6,7。致敏后，通过鼻内给予荧光素FITC标记的卵清蛋白对小鼠进行激发，从而特异性地标记摄取卵清蛋白的气道树突状细胞（DCs）。随后，利用多种树突状细胞特异性标记物，我们可通过流式细胞术评估这些树突状细胞的成熟状态及其向引流淋巴结的迁移情况。

我们描述了一种在卵清蛋白诱导的过敏性气道炎症条件下，监测肺树突状细胞对卵清蛋白刺激的成熟与迁移的策略。该策略可经修改后用于评估感染条件下肺树突状细胞的迁移情况。

树突状细胞（DCs）是通过激活抗原特异性T细胞来启动适应性免疫应答的关键参与者。DCs存在于……

本实验的目的是评估小鼠在Val Boomin诱导的过敏性气道炎症过程中肺部树突状细胞（DC）的成熟与迁移情况。首先用Val Boomin对小鼠进行致敏，随后以荧光标记的Val Boomin进行气道激发。接着，采集肺组织和纵隔淋巴结。最后，从肺组织和淋巴结组织制备单细胞悬液。最终，可通过流式细胞术分析在FITC Val Boomin刺激后纵隔淋巴结中找到的Pullman read树突状细胞的成熟状态及其绝对细胞数量。该方法有助于回答有关肺部免疫应答的关键问题，例如树突状细胞在抗原暴露后是否发生成熟，以及它们是否迁移至引流淋巴结。如果它们发生迁移，还需确定其迁移速率。首先，在涡旋振荡条件下，将新配制的 Val Boomin 溶液以1:1的比例逐滴加入含有明矾的试管中。搅拌混合物30分钟，然后用0.2毫升该混合物填充一支1毫升的注射器。用一只手的拇指和食指抓住待注射小鼠靠近颅底的颈背部皮肤。然后用另一只手将 Val Boomin 氢氧化铝溶液注入小鼠的腹腔内。第二次注射 Val 氢氧化铝溶液后第七天，将一只经 Val 氢氧化铝致敏并已麻醉的小鼠保持直立姿势，用无菌移液器吸头吸取 100 微升 freshly prepared val in fxi 溶液，逐滴滴加于小鼠的鼻腔（NAS）中。首先，将一根20号导管连接到1毫升注射器上。然后，在确认小鼠已被安乐死后，从胸部一直切开至颈部，暴露并插管小鼠气管。灌洗肺部并灌注心脏至关重要，以确保清除外周血中所有污染的肺泡巨噬细胞和单个核细胞。务必仔细进行接下来的两个步骤，当然，操作时手要稳。现在通过导管将含有EDTA的冰冻PBS注入下呼吸道三次，以冲洗下呼吸道并清除肺泡腔中的细胞。然后，取一支10毫升注射器并安装20号针头，经心脏右心室向肺部灌注10毫升含肝素的PBS。当肺组织变白时，表明肺血管中残留的血细胞已完全清除。接下来，摘除纵隔淋巴结，并将其置于单独的培养皿中。为防止荧光淬灭，需尽量减少组织的光照暴露。然后解剖灌注后的肺组织，将其置于培养皿中，并用剪刀将肺组织剪碎。接着，在37摄氏度下用每毫升250单位的胶原酶D消化肺组织。孵育25分钟后，向混合物中加入EDTA，作用5分钟以终止胶原酶活性。最后，将消化后的肺组织碎片通过100微米细胞滤筛过滤，并用低渗缓冲液裂解红细胞。使用细针分离纵隔淋巴结，并用胶原酶进行消化（方法同前述肺组织），随后在腹腔注射、致敏和气道激发后，通过细胞筛过滤组织。可通过苏木精-伊红染色对对照组代表性肺组织切片中的炎性细胞存在情况进行评估。经生理盐水处理的动物，其组织无炎症，如上方图示所示。相比之下，在致敏并激发的动物中，经瓦尔（Val）处理的肺组织切片中可见弥漫性炎性细胞浸润，如下方图示所示。下方图示显示，周期性酸-希夫染色（periodic acid shift stain）可用于评估黏液分泌

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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基于光片显微镜的过敏性炎症活体实验模型中肺归巢人淋巴细胞的高级成像

在本实验方案中，将淋巴细胞置于跨膜迁移系统的上室，上室与下室之间由多孔膜隔开。在下室中加入趋化因子，以诱导淋巴细胞沿趋化因子浓度梯度进行主动迁移。48小时后，分别计数两个室中的淋巴细胞，以定量分析跨膜迁移情况。...

离体跨膜迁移系统中淋巴细胞迁移能力的评估

本方案描述了流式细胞术的应用，用于鉴定短暂性大脑中动脉闭塞（一种缺血性脑卒中的小鼠模型）后肺部环境中免疫细胞组成、细胞因子谱和趋化因子谱的变化。...

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