过敏性气道炎症期间肺树突状细胞成熟与迁移的分析

本实验的目的是评估小鼠在Val Boomin诱导的过敏性气道炎症过程中肺部树突状细胞（DC）的成熟与迁移情况。首先用Val Boomin对小鼠进行致敏，随后通过气道给予荧光标记的Val Boomin进行激发。接着采集肺组织和纵隔淋巴结。

最后，从肺组织和淋巴结组织制备单细胞悬液。最终，可通过流式细胞分析评估在FITC标记的Val Boomin刺激后，位于纵隔淋巴结中的Pullman读取型树突状细胞的成熟状态及其绝对细胞数量。该方法有助于回答有关肺部免疫应答的关键问题，例如树突状细胞在接触抗原后是否发生成熟，以及它们是否迁移至引流淋巴结。

如果它们发生迁移，则需确定迁移速率。首先，在涡旋振荡的同时，将新配制的 Val Boomin 溶液以1:1的比例逐滴加入装有明矾的试管中。搅拌混合物30分钟，然后用0.2毫升的该混合物填充一支1毫升的注射器。

用一只手的拇指和食指捏住待注射小鼠靠近颅底的颈背部皮肤，固定小鼠。用另一只手将 Val Boomin 铝佐剂溶液注入小鼠腹腔内。第二次注射 Val 铝佐剂后第七天，将已麻醉的、经 Val 铝佐剂致敏的小鼠保持直立姿势，使用无菌移液器吸头吸取 100 微升新鲜配制的 Val 在 fxi 溶液，逐滴加至小鼠的鼻腔（NAS）中。

首先，将一个20号导管连接到1毫升注射器上。然后，在确认小鼠已实施安乐死后，打开动物的胸腔直至颈部，暴露小鼠气管并进行插管。灌洗肺部并灌注心脏至关重要，以确保清除存在于外周血中的所有污染性肺泡巨噬细胞和单核细胞。

务必仔细并平稳地完成接下来的两个步骤。通过导管向肺部灌注冰冻的含EDTA的PBS溶液，重复三次，以冲洗下呼吸道并清除肺泡腔中的细胞。然后，将一个10毫升注射器连接20号针头，通过右心室向肺脏灌注10毫升含肝素的PBS溶液。

当肺组织变白时，表明肺血管中残留的血细胞已完全清除。接下来，摘除纵隔淋巴结，并将其置于另一个培养皿中。为防止荧光淬灭，应尽量减少组织的光照暴露。

然后解剖灌注后的肺组织，将其放入培养皿中，并用剪刀将肺组织剪碎。接着，在37摄氏度条件下，用每毫升250单位的胶原酶D消化肺组织。孵育25分钟后，向混合物中加入EDTA，作用5分钟以终止胶原酶活性。最后，将消化后的肺组织碎片通过100微米细胞筛网过滤，并用低渗缓冲液裂解红细胞。

使用细针分离纵隔淋巴结，并按照前述肺组织的方法用胶原酶进行消化，然后在腹腔注射、致敏和气道激发后，通过细胞滤器过滤组织。可通过苏木精-伊红染色对对照组代表性肺组织切片中的炎性细胞进行评估。

经生理盐水处理的动物，其组织无炎症表现，如上方图示所示。相比之下，经瓦尔（Val）致敏并激发的动物肺组织切片中可见广泛分布的炎性细胞，如下方图示所示。下方图示显示，可采用过碘酸希夫染色法（periodic acid shift stain）评估黏液分泌情况。

在经Val致敏的小鼠中，经Val激发后气道过敏性炎症的诱导可通过黏液的存在得以证实。相反，对照组及经生理盐水处理的小鼠则完全不产生黏液，如上图所示。Val激发后，肺部树突状细胞经历成熟并随后迁移至引流淋巴结。

此处对小鼠纵隔淋巴结的代表性分析显示，与生理盐水处理的小鼠相比，在经Val Boomin致敏并激发的小鼠中，CD11c阳性细胞的比例出现轻微但一致的升高。此外，对Val Boomin致敏并激发小鼠纵隔淋巴结中CD11c阳性、CD11b阳性、Val Boomin FITC阳性细胞的绝对数量进行分析表明，与生理盐水处理的小鼠相比，激发小鼠中树突状细胞（DC）数量增加了数倍。观看本视频后，我们应能充分理解用于分析肺部树突状细胞成熟及迁移的技术方法。

一旦你真正掌握了这项技术，就可以进一步改进它，用于评估肺部树突状细胞对其他病原体以及其他实验因素的反应。