作为一种工具来隔离核糖体的束缚多肽SECM逮捕序列

该程序的总体目标是分离 SEC TED 70 s 核糖体结合的新生链复合物或在体外无细胞系统中翻译过程中产生的 RNC。这是通过首先将 17 个氨基酸长的 SEC M 停滞序列引入目标基因的 C 末端并将其克隆到 T 7 转录启动子的下游来实现的。接下来，使用体外转录反应转录 mRNA，然后进行纯化。

然后，纯化的 mRNA 在含有放射性氨基酸的 S 30 E 大肠杆菌提取物系统中翻译，以标记合成的蛋白质或新生多肽。最后，通过蔗糖、梯度、离心和分级分离分离第二个 Mr.Ed 核糖体结合的新生链复合物。最终，通过对从梯度级分中分离的标记多肽进行凝胶电泳分析，可以获得结果表明新生链稳定地结合到 70 s 核糖体。

与现有方法（如使用缺乏储备密码子的 mRNA）相比，该技术的主要优点是，它确保在翻译和随后的离心步骤中高效地将新生多肽链连接到 70 s 核糖体。此外，与无停止警戒线技术相比，该方法在体外和体内系统中可以以几乎相同的效率使用。这种方法可以帮助回答跨折叠蛋白质折叠领域的关键问题，例如在翻译过程中各种跨折叠中间体可能形成的早期时间，并进一步帮助使用直接或间接结构分析它们的结构。

探测和确定方法该技术可以帮助我们破译核糖体上蛋白质折叠的途径。在该协议中，我们描述了 70 s 核糖体结合的全长 bine γ B 结晶新生链的分离。但该技术可用于分离几乎任何目标蛋白质的 vari 病。

通常，这种方法的新个体在蔗糖梯度离心步骤中可能会遇到困难。但是，对于经验 1，这应该不是问题。我们决定利用第二个停滞序列来分离与 70 结合的 γ B 结晶新生多肽作为核糖体，在最初的、不太成功的尝试涉及使用缺乏终止警戒线的 mRNA 之后。

后一种技术无法确保 RNC 在后续离心步骤中的稳定性，其效率与涉及使用 SECM 阻滞序列的技术相同。这种方法的视觉演示至关重要，因为涉及梯度制备和 RNC 分离的步骤可能难以学习，并且需要一定程度的专业知识以确保结果的可重复性 展示姿势将是我实验室的研究生进行体外转录和翻译。从克隆到任何基于 T 7 和/或 SP six 的质粒中的目标基因开始，以产生核糖体新生链复合物或 RNC。

通过添加来自 M 的阻滞诱导序列来延长目标多肽的 C 末端，以确保多肽片段从核糖体隧道中挤出。在蛋白质和 SEC M 阻滞序列之间添加富含甘氨酸的柔性甘氨酸连接子，以准备体外转录，使用限制性内切酶，该限制性内切酶将切割开放阅读框的下游以线性化模板 DNA，运行 AROS 凝胶电泳以验证样品的完全消化。验证最佳 DNA 浓度后，根据制造商的说明使用高产量转录试剂盒合成信使 RNA。

使用氯化锂沉淀纯化 mRNA。然后在丙烯酰胺或 aros 凝胶上运行样品以验证其纯度。用于体外翻译。

在无核酸酶的水中使用大肠杆菌系统，加入 1 毫摩尔氨基酸混合物，减去蛋氨酸、10 单位核糖核酸酶抑制剂 20、微量居里 35 秒蛋氨酸、20 微升反应混合物、24 微升复溶缓冲液和 24 微升大肠杆菌。裂解物。通过在 30 摄氏度下孵育反应 5 分钟来预热反应。然后加入 1 到 2 微克 mRNA，并在 30 摄氏度下再孵育 10 到 15 分钟。

将其置于冰上以分离 70 s 核糖体结合的新生链复合物或 ncs 来终止反应。将翻译反应物分层在 4.5 毫升 5% 至 30% 蔗糖梯度上，以 20 毫摩尔堆进行。氢氧化钾 pH 7.5 15 毫摩尔镁、100 毫摩尔乙酸钾和 1 毫摩尔 DTT 离心后在 4 摄氏度下以 41， 000 RPM 离心 2 小时，使用可编程密度梯度系统和设置为 254 纳米的吸光度检测器分馏蔗糖梯度。

收集含有 70 s 核糖体的级分进行进一步分析，以确定 SEC M 延伸蛋白是否仍然附着在 70 s 核糖体上。通过添加三氯乙酸在每个梯度级分中沉淀蛋白质。第二天在 4 摄氏度下孵育样品过夜，将样品以 14， 000 倍 G 离心 15 分钟以沉淀蛋白质，以丙酮与 1 毫摩尔三 （HCL pH 7.6） 的 4：1 比例洗涤沉淀。

风干沉淀，然后将它们重悬于 SDS 页面加载缓冲液中。通过 tris Trice SDS 页面解析样品，然后固定并干燥凝胶，并对其进行自动射线照相和磷酸成像，如图所示。体外翻译后，通过蔗糖、梯度、离心和分级分离分离 70 S 核糖体，以确保 γ B 结晶蛋白与核糖体保持稳定结合。

将含有 70 秒的馏分合并，混合脱盐缓冲液，交换缓冲液，并进行另一轮蔗糖梯度离心。此处介绍的结果表明，SEC M 可以有效地诱导 γ B 结晶 RNC 的翻译停滞。一旦掌握，该技术可以在一个工作日内完成，但新生链的凝胶电泳分析除外，这通常涉及过夜 TCA 沉淀步骤。

在尝试此过程时，在任何步骤中避免 RNA 污染显然至关重要。RNS 污染可能会影响提取物的翻译效率，并导致第 70 个核糖体释放新生多肽。按照此程序，根据最终目标，可以获得与第 70 个核糖体稳定结合的预定 lanxess 多肽。

这种复合物可用于各种目的，例如使用 NMR 或 fre 等直接和间接方法确定核糖体结合新生链的确认，或在开发后测试因子和配体结合。这项技术为结构生物学和蛋白质折叠领域的研究人员探索与核糖体结合的全长蛋白质的确认以及 cot 翻译折叠中间体铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何制备和分离与 70 s 核糖体稳定结合的新生多肽有一个很好的了解，这些多肽可以进一步用于回答转录蛋白折叠领域的各种问题。

不要忘记，使用放射性同位素和标记的胺酸，例如 A 35 蛋氨酸，需要特殊的预防措施，并且在执行此程序时应始终考虑到这一点。