Name: 作为一种工具来隔离核糖体的束缚多肽SECM逮捕序列 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学习使用SecM停滞序列分离核糖体结合的新生肽链复合物（RNCs）的方法。该技术在大肠杆菌无细胞系统中实现翻译延伸停滞，为研究蛋白质合成机制提供稳定可靠的实验手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由人类前沿科学计划项目资助，项目编号 RGP0024。

1. DNA模板的制备与 体外 转录
<ol>
 <li>目的基因被克隆至任意基于T7和/或例如SP6启动子的质粒中。为获得目标核糖体-新生肽复合物（RNCs），需在目标多肽的C末端添加SecM的阻滞诱导序列FXXXXWIXXXXGIRAGP进行延伸7为了确保目标多肽片段能够从核糖体通道中伸出，目标蛋白的C端必须至少延伸30个氨基酸。12-14可在蛋白质与SecM阻滞序列之间引入一段富含甘氨酸-丝氨酸的柔性连接子，以避免可能存在的构象限制。</li>
 <li>对于 体外 转录时，应在开放阅读框（ORF）下游使用限制性内切酶对模板DNA进行线性化。需通过琼脂糖凝胶电泳检测限制性酶切产物，以确认质粒DNA完全线性化。</li>
 <li>线性化质粒进一步用于 体外 转录反应。可测试不同浓度的模板DNA，以确定该反应所需的最适DNA浓度 体外 转录。通常使用 Ambion 的 MEGAscript High Yield Transcription Kit（Ambion/Life Technologies，Grand Island，NY）， 1 μg 线性化DNA可产生40-60 μg mRNA 体外 按照制造商说明进行转录（Ambion/Life Technologies，美国纽约州格兰岛）。</li>
 <li>随后 体外 转录后，根据制造商说明（Ambion's MEGAscript High yield Transcription Kit, Ambion/Life Technologies, Grand Island, NY），使用氯化锂沉淀法纯化mRNA。</li>
 <li>通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳进一步验证 mRNA 的完整性。</li>
</ol>
2. 体外 翻译
对于 体外 使用 RTS 100 E. coli HY 试剂盒（5 Prime，Gaithersburg，MD）进行翻译，请遵循以下步骤：
<ol>
 <li>准备 100 μl 的 体外 根据制造商说明书进行翻译反应。简言之，将以下成分加入无核酸酶的水中 24 μl 甲硫氨酸缺失的氨基酸混合物（1 mM），10单位核糖核酸酶抑制剂（Invitrogen/Life Technologies，美国纽约州格兰岛） 20 μCi 放射性[35S]-甲硫氨酸（MP Biomedicals，Solon，OH）， 20 μl 反应混合液， 24 μl 重悬缓冲液和 24 μl 的 E. coli 裂解液</li>
 <li>在指定条件下孵育反应体系 30 °C 5分钟以预热翻译反应。加入1-2 μg 将mRNA加入翻译反应体系，并在 30 °C 10-15 分钟</li>
 <li>通过将翻译反应置于冰上以终止反应。</li>
</ol>
3. 新生多肽的分离 体外 翻译反应
<ol>
 <li>为了分离核糖体-新生肽链复合物（RNCs），将翻译反应液铺在4.5 ml 5-30%蔗糖梯度溶液（含20 mM HEPES-KOH pH 7.5、15 mM MgCl2、100 mM 醋酸钾、1 mM DTT）上，使用Beckman Coulter SW55-Ti转子在4 °C条件下以41,000 rpm离心2小时。</li>
 <li>离心后，通过分级收集蔗糖梯度中的各组分，以分离不同类型的核糖体群体及其相关的新生肽链。分离过程使用ISCO Programmable Density Gradient System进行监测，并通过ISCO UA-6吸光度检测器在254 nm处连续记录吸光值。</li>
 <li>收集含有70S核糖体的组分，并根据实验目的进行后续分析。</li>
</ol>
4. 使用Tris-三氨酸SDS-PAGE观察与核糖体结合的蛋白质
为了检测SecM延伸蛋白是否仍与70S核糖体结合，收集梯度组分并按如下方式处理：
<ol>
 <li>通过加入三氯乙酸（TCA）至终浓度为10%，在4 °C下过夜孵育，使各组分中的蛋白质沉淀。</li>
 <li>过夜孵育后，样品在14,000 × g离心15分钟以收集蛋白质沉淀。离心后弃去上清液，并用丙酮：1 mM Tris-HCl pH 7.6（4:1）溶液洗涤沉淀两次。沉淀进一步风干后溶于SDS-PAGE上样缓冲液中。</li>
 <li>处理后的样品通过Tris-三羟甲基甘氨酸（Tris-tricine）SDS-PAGE进行分离和分析。</li>
 <li>电泳完成后，凝胶经固定后使用真空凝胶干燥仪干燥，并进行放射自显影。新生多肽的分布通过磷屏成像技术进行观察。</li>
</ol>
5. 代表性结果
本文介绍了一项实验，描述了从70S核糖体上稳定结合的全长牛Gamma-B晶状体蛋白的分离过程。 图1 描述了分离牛γ-B-晶状体蛋白核糖核蛋白复合物（RNCs）的步骤。γ-B-晶状体蛋白的C末端共延伸了32个氨基酸，以确保全长蛋白能够从核糖体通道中完全伸出；该延伸序列还包括位于融合多肽C末端的SecM停滞序列。随后 体外 通过蔗糖梯度离心法分离70S核糖体 （图 2.1）为了确保蛋白质稳定结合在核糖体上，将含有70S的组分合并，进行脱盐和缓冲液置换，随后再进行一轮蔗糖梯度离心 （图 2.2）. 结果显示在 图2 明确表明SecM能够高效诱导Gamma-B Crystallin核糖体新生肽链复合物（RNCs）的翻译停滞。
<img alt="体外转录与翻译示意图；mRNA合成、核糖体蛋白分离、离心。" src="/files/ftp_upload/4027/4027fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. RNCs分离过程中各步骤的示意图解。 牛γ-B晶状体蛋白的C末端被延长了32个氨基酸序列。该延长的C末端区域还包含SecM停滞序列。带有SecM序列的γ-B晶状体蛋白被克隆至pIVEX 2.3（基于T7）质粒中。为进行in vitro转录，模板DNA通过XbaI酶切线性化。线性化后的模板进一步用于in vitro转录。DNA模板中的T7启动子被T7 RNA聚合酶识别，从而转录位于T7启动子下游的γ-B晶状体蛋白基因。mRNA通过氯化锂沉淀法进行纯化。纯化后的mRNA随后用于体外翻译。孵育后，将翻译反应液铺在5-30%蔗糖梯度溶液上方，并在Beckman Coulter SW55-Ti转子中以41,000 rpm、4 °C离心2小时。
<img alt="蔗糖梯度图，核糖体亚基分离，254 nm 处吸光度，蛋白质分析。" src="/files/ftp_upload/4027/4027fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 稳定结合于 70S 核糖体的牛 Gamma-B 晶状体蛋白核糖体复合物（RNC）的分离。 将 1 μg mRNA 与 100 μl 反应体系中的 E. coli S30 提取物（如方案部分所述）混合，加入 20 μCi [35S]-甲硫氨酸，在 30 °C 下孵育 15 分钟。孵育后，将翻译反应液铺在含 20 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、15 mM MgCl2、100 mM 醋酸钾、1 mM DTT 的 5–30% 蔗糖梯度上，使用 Beckman Coulter SW55-Ti 转子在 41,000 rpm、4 °C 条件下离心 2 小时。经速度沉降后，收集梯度组分并获得核糖体图谱。数据由 PeakTrak 程序（ISCO 梯度密度梯度分级系统）记录。收集各组分，蛋白质经三氯乙酸（TCA）沉淀后，在 16.5% T、6% C 的 Tris-Tricine PAGE 凝胶上电泳分离15。凝胶干燥后进行放射自显影。曝光后使用 Typhoon 9410 成像扫描仪扫描凝胶。图 2.1 显示全长的 Gamma-B 晶状体蛋白存在于 70S 核糖体组分中。因此，SecM 停滞序列可实现稳定牛 Gamma-B 晶状体蛋白 RNC 的分离。图 2.2 中的数据明确表明所分离的 RNC 确实具有稳定性。在本实验中，第一轮蔗糖梯度离心后的 70S 组分被合并，使用 Amicon Ultra-4 离心过滤装置（Millipore）去除蔗糖，并置换为含 20 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、15 mM MgCl2、100 mM 醋酸钾、1 mM DTT 的缓冲液。该样品进一步通过 5–30% 蔗糖梯度进行第二轮离心和分级。每个组分的处理与分析方式同 图 2.1。

<ol><li>Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational protein folding.</a> J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).</li>
<li>Hardesty, B., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+a+nascent+peptide+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucleic+Acid+Res.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding of a nascent peptide on the ribosome.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).</li>
<li>Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+as+a+platform+for+co-translational+processing%2C+folding+and+targeting+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).</li>
<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li>
<li>Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein folding on the ribosome.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).</li>
<li>Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Escherichia+coli+secA+by+cellular+protein+secretion+proficiency+requires+an+intact+gene+X+signal+sequence+and+an+active+translocon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon.</a> J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+monitor%2C+SecM%2C+undergoes+self-translation+arrest+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol.</a> Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.</li>
<li>Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+but+non+polypeptide+prolyl-tRNA+functions+in+the+A+site+for+SecM-mediated+ribosomal+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall.</a> Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).</li>
<li>Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+ribosome-nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).</li>
<li>Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+structure+acquisition+of+nascent+polypeptides+monitored+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).</li>
<li>Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+activity+of+the+ribosome-bound+nascent+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide.</a> FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).</li>
<li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289, 905-920 (2000).</li>
<li>Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometry+of+the+ribosomal+polypeptide+exit+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel.</a> J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+of+globin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding of globin.</a> J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).</li>
<li>Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+peptide+tagging+system+in+degradation+of+proteins+synthesized+from+damaged+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA.</a> Science. 271, 990-993 (1996).</li>
<li>Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+stalled+ribosome+nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+or+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro.</a> Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

为获得可重复的结果，所用组分的质量与浓度需严格控制 体外 转录和翻译至关重要。我们使用了商业可获得的 体外 转录与翻译提取物在谨慎操作下可获得高效且可重复的结果。mRNA的质量会影响翻译效果，因此在将其用于后续实验前，检测mRNA的完整性至关重要。 体外 翻译。孵育时间 体外 翻译会因蛋白质的长度不同而有所变化。此外，如果70S核糖体组分未能与50S充分分离，可相应调整离心的时间/速度。同时，应小心操作核糖体结合的蛋白质复合物，避免RNase污染。此外，应密切监控缓冲液条件，避免使用可能螯合Mg²⁺的螯合剂2+ 应避免。
SecM 停滞序列在翻译过程中会与核糖体隧道内的核糖体蛋白 L4 和 L22 以及 23S rRNA 相互作用7,8。构成 SecM 停滞基序的多个关键残基，即 FXXXXWIXXXXGIRAGP7（加粗部分），对于确保翻译停...

<table><tbody><tr><td>MEGAscript T7 高产转录试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>RTS 100 E.coli HY 试剂盒</td><td>5 Prime</td><td>2401100</td><td></td></tr><tr><td>核糖核酸酶抑制剂</td><td>Invitrogen</td><td>15518012</td><td></td></tr><tr><td>Trans [&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt;S]-标记物</td><td>MP Biomedicals</td><td>0151006</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 离心滤过装置</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>储存磷屏自显影技术</td><td>GE Healthcare</td><td>Typhoon 9410 多功能成像仪</td><td></td></tr><tr><td>密度梯度分级系统</td><td>Teledyne Isco, Inc.</td><td>ISCO 可编程密度梯度系统</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖梯度离心</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-90 K 制备型超速离心机</td><td></td></tr></tbody></table>

利用secm阻滞序列作为分离核糖体结合多肽的工具

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

大量研究提供了充分证据，表明蛋白质在细胞内的折叠是一个共翻译过程1-5。然而，多肽链在共翻译折叠过程中如何逐步形成其功能性结构的具体路径仍是一个未解之谜。为了深入理解这一过程，并确定共翻译折叠中间体的确切构象，必须建立能够分离携带预定长度新生肽链的核糖体-新生肽链复合物（RNCs）的技术，以便对其进行进一步的结构分析。
SecM（分泌监控蛋白）是一种含有170个氨基酸的 E. coli 蛋白，可调控 secM-secA 操纵子中下游SecA（驱动分泌的）ATP酶的表达6。Nakatogawa和Ito最初发现，SecM蛋白C端区域一段长为17个氨基酸的序列（150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166）足以且必需引起SecM在Gly165位点的翻译延伸停滞，从而产生稳定结合于核糖体P位点的肽基甘氨酰-tRNA7-9。更重要的是，研究发现这段17个氨基酸的序列几乎可以融合至任何全长和/或截短蛋白的C末端，从而实现携带预定长度新生肽链的核糖体-新生肽复合物（RNCs）的制备7。因此，当该序列融合或插入目标蛋白时，SecM停滞序列可导致多肽链延伸的中止，并可在 E. coli 细胞内的 in vivo 条件下以及无细胞的 in vitro 系统中生成稳定的RNCs。随后可通过蔗糖梯度离心法进一步分离纯化RNCs。
分离的核糖体-新生链复合物（RNCs）可用于分析共翻译折叠中间体的结构与功能特征。最近，该技术已成功用于揭示多种核糖体结合新生链的结构。10,11. 本文描述了在体外系统中生成的、与SecM融合的牛γ-B晶状体蛋白核糖体新生肽链复合物（RNCs）的分离方法 体外 翻译系统。

本文介绍一种目前常规用于分离稳定结合的核糖体新生肽链复合物（RNCs）的技术。该技术利用了以下发现：当一段长为17个氨基酸的SecM“阻滞序列”被插入（或融合至C末端）几乎任何蛋白质时，可在原核生物（E. coli）系统中阻断翻译延伸过程。

利用SecM阻滞序列作为分离核糖体结合多肽的工具

大量研究表明，细胞内的蛋白质折叠是一个共翻译过程1-5。然而，其确切的途径……

本实验的总体目标是从体外无细胞系统翻译过程中分离出与SEC TED 70S核糖体结合的新生肽链复合物（RNCs）。首先，将一段17个氨基酸长的SEC M阻滞序列引入目的基因的C末端，并将其克隆至T7转录启动子的下游。接着，通过体外转录反应转录mRNA，然后进行纯化。然后，将纯化的mRNA在含有放射性氨基酸的S30大肠杆菌提取物系统中进行翻译，以标记合成的蛋白质或新生多肽链。最后，通过蔗糖梯度离心和分级收集，分离第二次形成的Mr.Ed核糖体结合的新生链复合物。最终，通过对梯度组分中分离出的标记多肽进行凝胶电泳分析，可以获得结果显示新生链稳定地结合在70S核糖体上。与现有方法（如使用缺乏终止密码子的 mRNA）相比，该技术的主要优势在于，它能够以高效率确保在翻译过程中新生多肽链与 70 S 核糖体的结合，并在后续的离心步骤中保持这种结合。此外，与无终止密码子技术不同，该方法在体外和体内系统中均能以几乎相同的效率应用。该方法有助于回答翻译过程中蛋白质折叠领域的关键科学问题，例如在翻译早期阶段各种翻译折叠中间体可能如何形成，并进一步帮助利用直接或间接结构分析手段解析其结构。探针与检测方法：该技术可帮助我们解析核糖体上蛋白质折叠的途径。在本方案中，我们描述了分离与70S核糖体结合的全长双γB晶状体蛋白新生链的方法。但该技术也可用于分离几乎所有目标蛋白的核糖体结合新生链。该策略也可用于分离皮肤中截短的天然多肽链。通常，初次使用此方法的研究人员可能在蔗糖梯度离心步骤中遇到困难。然而，对于有经验的操作者而言，这不应成为问题。我们决定采用第二段阻滞序列，以分离与70S核糖体结合的γB-晶状体蛋白新生多肽链，此决定源于最初使用缺乏终止密码子的mRNA所进行的若干次不太成功的尝试。后一种技术在后续离心步骤中无法像使用SECM阻断序列的技术那样高效地确保RNCs的稳定性。该方法的可视化演示至关重要，因为梯度制备和RNC分离步骤可能较难掌握，且需要具备一定技术水平才能获得可重复的结果。演示操作的人员将由我实验室的一名研究生完成。进行体外转录和翻译时，首先选择一个已克隆至T7和/或SP6启动子载体中的目的基因，以生成核糖体新生肽链复合物（ribosome nascent chain complexes, RNCs）。通过添加来自 M 的阻滞诱导序列，延长目标多肽的 C 末端，以确保该多肽片段能够从核糖体通道中伸出。在蛋白与 SEC M 阻滞序列之间添加一段富含甘氨酸和丝氨酸的柔性连接子，用于制备体外转录模板。使用限制性内切酶切割开放阅读框下游序列，使模板 DNA 线性化，然后进行 AROS 凝胶电泳，以验证样品是否完全消化。在确认最佳 DNA 浓度后，按照制造商说明书使用高效转录试剂盒合成信使 RNA。使用氯化锂沉淀法纯化 mRNA。然后在丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上跑样以验证其纯度，用于体外翻译。在无核酸酶的水中使用大肠杆菌系统，加入1毫摩尔的氨基酸混合物（不含甲硫氨酸）、10单位的核糖核酸酶抑制剂、20微居里的³⁵S-甲硫氨酸、20微升反应混合液、24微升重建缓冲液和24微升大肠杆菌裂解物。将反应体系在30摄氏度预孵育5分钟。然后加入1至2微克的mRNA，并在30摄氏度继续孵育10至15分钟。通过将反应物置于冰上停止反应，以分离70S核糖体结合的新生肽链复合物或ncs。将翻译反应液加在4.5毫升5%至30%蔗糖梯度溶液上方，蔗糖梯度溶液含20毫摩尔HEPES氢氧化钾（pH 7.5）、15毫摩尔氯化镁、100毫摩尔醋酸钾和1毫摩尔DTT，在4°C下以41,000转/分钟离心2小时。离心后，使用可编程密度梯度系统和设定在254纳米波长的吸光度检测器对蔗糖梯度进行分级收集。收集含有70S核糖体的组分，用于进一步分析，以确定SEC M延伸蛋白是否仍与70S核糖体结合。通过加入三氯乙酸沉淀每个梯度组分中的蛋白质。将样品在4°C下孵育过夜，次日以14,000 × g离心15分钟以沉淀蛋白质，然后用丙酮与1 mmol/L Tris-HCl（pH 7.6）按4:1比例配制的溶液洗涤沉淀。将沉淀空气干燥，然后用SDS-PAGE上样缓冲液重悬。通过Tris-Tricine SDS-PAGE分离样品，随后固定并干燥凝胶，进行放射自显影和磷酸化成像，如下图所示。体外翻译后，通过蔗糖梯度离心及组分分离纯化70S核糖体，以确保γB-晶状体蛋白稳定结合于核糖体上。将含有70S的组分收集后进行脱盐缓冲液置换，并进行第二轮蔗糖梯度离心。此处展示的结果表明，SEC M可有效诱导γB-晶状体蛋白核糖体新生肽链复合物（RNCs）的翻译停滞。掌握该技术后，除新生肽链的凝胶电泳分析通常需要过夜三氯乙酸（TCA）沉淀步骤外，其余操作可在一个工作日内完成。在进行该实验操作时，显然必须在所有步骤中避免RNA污染。RNA污染可能影响提取物的翻译效率，并导致新生多肽从第70个核糖体上释放。通过本方案，可根据最终研究目标获得NAST以及稳定结合在第70个核糖体上的预定长度的多肽。这些复合物可用于多种用途，例如通过核磁共振（NMR）或荧光共振能量转移（FRET）等直接或间接方法，确定核糖体结合新生肽链的构象，或在该技术建立后检测因子和配体的结合。该技术为结构生物学和蛋白质折叠领域的研究人员探索全长蛋白质在核糖体上的构象以及共翻译折叠中间体提供了途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备和分离稳定结合于70S核糖体的新生多肽链，这些样品可进一步用于解答翻译过程中蛋白质折叠领域的各种科学问题。请注意，使用放射性同位素和标记的氨基酸（例如 A 35 蛋氨酸）时需要采取特殊预防措施，在进行本实验操作时应始终予以充分考虑。

using-secm-arrest-sequence-as-tool-to-isolate-ribosome-bound

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

作为一种工具来隔离核糖体的束缚多肽SECM逮捕序列

本文介绍了一种从真核细胞中提取正在翻译的核糖体的实验方案。提取后，通过蔗糖梯度分级分离将核糖体分为单体核糖体和多聚核糖体，从而实现对不同核糖体群体的分析。因此，该方法是研究翻译调控的金标准。...

真核生物多聚核糖体图谱分析

对含有新生肽酰-tRNA的核糖体进行生化分析的主要障碍在于，同一样品中存在其他核糖体，这些核糖体并未参与待分析的特定mRNA序列的翻译。我们开发了一种简单的方法，可特异性纯化仅含有目标新生肽酰-tRNA的核糖体。...

分离含有肽基-tRNA的翻译核糖体用于功能与结构分析

本文描述了一种用于鉴定mRNA上翻译暂停位点的技术。该方法基于在体外翻译目标mRNA时，分离在核糖体上积累的新生多肽链，随后通过变性凝胶电泳对新生肽链的大小进行分析。...

核糖体结合新生多肽的分离 体外 识别mRNA上的翻译暂停位点

结合质谱技术的标签蛋白亲和纯化（APMS）是一种强大的方法，可用于系统性绘制蛋白质相互作用网络，并研究生物过程的分子机制基础。本文中，我们描述了一种为大肠杆菌（Escherichia...

蛋白质复合物的鉴定 大肠杆菌 使用连续肽亲和纯化与串联质谱联用技术

本方案介绍了多核糖体分级分离的关键改进方法，用于研究体内中枢神经系统（CNS）样本的翻译组。通过分离并比较总RNA与核糖体结合的RNA组分，可实现对翻译和转录调控的全局评估。...

in vivo 中通过多聚核糖体分级分离研究中枢神经系统翻译组

核糖体在蛋白质合成中起着核心作用。通过蔗糖密度梯度离心法对多核糖体（多聚体）进行分级分离，可直接在全基因组范围内测定各个mRNA的翻译效率。此外，该方法还可用于对与核糖体和多核糖体相关的分子（如分子伴侣和信号分子）进行生物化学分析。...

多聚核糖体分级分离及哺乳动物转译组的全基因组规模分析

本文描述了一种用于回收内源性形成的mRNA-蛋白质复合物的串联RNA分离流程（TRIP）。具体而言，首先在活体（in...

一种基于寡核苷酸的串联RNA分离方法以回收真核生物mRNA-蛋白质复合物

本文描述了细菌RIBO-seq中样本采集与制备的各个步骤。按照本指南构建文库并进行测序，可获得足够数据用于全面的生物信息学分析。我们所介绍的实验方案简便，仅需使用常规实验室设备，从裂解到获得文库共需七天。...

细菌中的RIBO-seq：用于高通量测序的样品收集与文库构建方案

本实验方案描述了如何在不使用自动梯度生成仪或梯度分段收集系统的情况下，制备多聚核糖体图谱。...

无需梯度混合器或组分分离系统的多聚核糖体分析

共翻译相互作用在新生肽链的修饰、定位、折叠和组装过程中起着关键作用。本文介绍了选择性核糖体谱分析法，这是一种用于在模式真核生物Saccharomyces...

通过选择性核糖体谱分析全局鉴定共翻译相互作用网络

AviTag特异性定位限制性光照增强生物素化（ALIBi）是一种新型的光遗传学激活方法，用于标记和亲和纯化亚细胞区域的核糖体亚群，以进行后续的测序和蛋白质组学分析。...

基于重组肽标签特异性定位限制性光照增强生物素化的亚细胞核糖体亚群分离

学习使用SecM停滞序列分离核糖体结合的新生肽链复合物（RNCs）的方法。该技术在大肠杆菌无细胞系统中实现翻译延伸停滞，为研究蛋白质合成机制提供稳定可靠的实验手段。

利用SecM阻滞序列作为分离核糖体结合多肽的工具

探索更多视频