Name: 人类胰岛染色协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 学习人类胰岛染色技术，通过苏木精-伊红染色和免疫组织化学方法，利用石蜡包埋胰腺样本的连续切片，评估胰岛内分泌组成、细胞增殖及炎症浸润，为糖尿病研究提供组织学分析基础。

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作者感谢为本研究提供支持的捐赠者家属和器官获取组织，以及 Emily Montgomery、Robert Pietras、Ann Fu、Mitali Agarwal 和 Roshan Agarwal 提供的专业帮助。本研究由青少年糖尿病研究基金会（M.C-T.）资助，用于支持糖尿病胰腺器官捐赠者网络。

1. 未染色切片的切片技术
<ol>
 <li>按照常规石蜡切片法设置水浴锅和切片机。使用带正电荷的载玻片，并预先标记病例编号、胰腺区域（样本）和切片编号。将石蜡包埋块放入切片机卡盘中，使包埋盒标签位于左侧。</li>
 <li>遵循常规切片程序，连续切片至组织均匀出现为止。制备一系列连续切片（厚度为 4 μm，数量为 3–6 张，具体取决于初始所需染色的种类（参见病例提交表，附录 1））。将切片带中的各张切片分开，按顺序逐一捞取并放置于载玻片上，用铅笔标注顺序编号。若某张切片未使用，仍需按确切顺序编号以作标识。切片在载玻片上的方向应与包埋盒中的方向一致，且载玻片标签朝左。室温下干燥过夜，随后进行染色或分发给研究人员。</li>
 <li>用一层薄薄的石蜡重新封住石蜡块表面，以保存组织，并在室温或 -20 °C 条件下存档保存。</li>
 <li>进行后续切片时，应按照上述方式保持各级连续切片的编号一致性。每块组织每约 100 μm 深度额外获取一张切片，并制备 H&amp;E 染色切片。</li>
</ol>
2. H&amp;E 染色
<ol>
 <li>将每个组织块的第一张连续切片置于载玻片架中，然后放入自动染色机的第一个染色槽内。</li>
 <li>选择标准的苏木精-伊红（H&amp;E）染色程序，并按常规操作进行。</li>
 <li>染色完成后，从自动染色机中取出载玻片，并置于通风橱中以进行封片。</li>
 <li>采用标准技术进行封片。彻底干燥后，使用打印标签进行标记（见第12节）。</li>
</ol>
3. 免疫组化实验设置
<ol>
 <li>选择 Dako 双重染色程序并输入玻片数量。根据指定体积准备 TBST 和柠檬酸盐缓冲液、抗体及其他试剂（表 1）。装载试剂盘和玻片。清洗管路和废液管路的旋转程序根据制造商建议进行设置。</li>
 <li>若手动进行这些检测，需准备估算体积的试剂。将玻片置于湿化 chamber 中孵育，以避免在任何步骤中玻片干燥。每种试剂的操作步骤应与使用自动染色仪时保持一致。</li>
</ol>
4. 免疫组化脱蜡与抗原修复
<ol>
 <li>将切片放入二甲苯中 5 分钟，重复一次。从此时起，直至特别说明前，切片不得干燥，否则会导致背景过深和染色效果不佳。</li>
 <li>将切片转移至 100% 乙醇中 2 分钟，重复一次。</li>
 <li>将切片放入新配制的含 3% H2O2 的甲醇溶液中，孵育 10 分钟。</li>
 <li>将切片浸入 90% 乙醇中，然后置于 90% 乙醇中 3 分钟。</li>
 <li>将切片转移至 70% 乙醇中 1 分钟。</li>
 <li>用去离子水冲洗切片。</li>
 <li>将蒸锅及锅内的柠檬酸缓冲液预热 5 分钟。</li>
 <li>将切片加入蒸锅中的柠檬酸缓冲液，蒸煮 30 分钟。</li>
 <li>立即把切片转移至水中，保持至切片冷却至室温（约 20 分钟）。</li>
 <li>根据染色顺序将切片转移至 Dako 自动染色机的载片架上（图 1），并运行双染程序。自动染色机程序的主要步骤已列出，以便手动操作时进行复制。</li>
</ol>
5. 一抗孵育（Ki-67、CD3、胰多肽）
<ol>
 <li>用 Sniper 溶液封闭载玻片 15 分钟。用 TBST 洗涤两次。</li>
 <li>将载玻片与一抗孵育 30 分钟。用 TBST 洗涤两次。</li>
 <li>加入 Mach2 羊抗小鼠（Ki-67）或抗兔（CD3、胰多肽）辣根过氧化物酶（HRP）聚合物，孵育 30 分钟。用 TBST 洗涤两次。</li>
 <li>向载玻片添加 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）4 分钟。用清水洗涤两次。</li>
 <li>对于同时进行检测的胰多肽孵育载玻片，在 Dako 仪器上保留，并在后续所有步骤中使用 TBST；其余载玻片则与第二组一抗孵育。或者，对于手动检测，继续进行第 6 部分操作。</li>
</ol>
6. 第二抗体（胰岛素、胰高血糖素）
<ol>
 <li>将切片在 DEEB 中孵育 20 分钟，用 TBST 洗涤两次。</li>
 <li>用含 10% 正常山羊血清的 TBST 溶液（胰岛素染色）或 Sniper（胰高血糖素染色）在 TBST 中封闭 20 分钟，其中胰岛素染色使用 20% 亲和素阻断剂。用 TBST 洗涤两次。</li>
 <li>加入胰岛素或胰高血糖素一抗，孵育 15 分钟。用 TBST 洗涤两次。</li>
 <li>胰岛素染色：将切片在 1:300 稀释的生物素化山羊抗豚鼠二抗中孵育 30 分钟。用 TBST 洗涤两次。随后加入标准 Vector ABC-AP 试剂，孵育 30 分钟。用 TBST 洗涤两次。</li>
 <li>胰高血糖素染色：将切片先在缓冲液中孵育 30 分钟，再加入山羊抗小鼠碱性磷酸酶（AP）聚合物，孵育 30 分钟。用 TBST 洗涤两次。</li>
 <li>在切片孵育结合物期间，将 LPR 缓冲液升温至室温。使用前每 3 mL 缓冲液中立即加入 1 滴液体永久红（LPR），并将溶液置于 Dako 试剂架中。将切片在 LPR 中孵育 4 分钟，然后用蒸馏水洗涤两次。</li>
 <li>将切片在苏木精中孵育 1 分钟，用蒸馏水冲洗两次。</li>
 <li>将切片在 pH 7.6 的 TBS 溶液中孵育 1 分钟，用蒸馏水冲洗两次。</li>
 <li>从 DAKO Autostainer 中卸载切片。</li>
 <li>立即对胰多肽染色的切片进行脱水处理。对于所有双重染色切片，需至少干燥 1 小时后再进行脱水。</li>
</ol>
7. 脱水
<ol>
 <li>将载玻片放入80%乙醇中1分钟。</li>
 <li>将载玻片浸入95%乙醇中。</li>
 <li>在95%乙醇中孵育载玻片30秒。</li>
 <li>转移载玻片至100%乙醇中，孵育1分钟。重复一次。</li>
 <li>将载玻片浸入二甲苯中。</li>
 <li>在二甲苯中孵育载玻片1分钟。重复一次。</li>
 <li>立即使用Cytoseal将盖玻片封片于载玻片上。</li>
</ol>
8. 载玻片标记
<ol>
 <li>输入病例识别信息，包括器官和组织块编号、染色方法及日期，然后打印。每个组织块的首张切片染色可选择是否标注连续切片编号；后续切片水平通过编号加以区分。</li>
 <li>在载玻片上粘贴标签。</li>
</ol>
9. 载玻片扫描
<ol>
 <li>将染色的载玻片放入扫描仪托盘，并根据仪器操作说明进行扫描。</li>
 <li>按供体和组织类型（胰腺头、体、尾、脾脏）对载玻片进行分类整理。</li>
 <li>将染色的载玻片在室温下存档，未染色的剩余载玻片保存于 -20 °C，直至使用。</li>
</ol>
10. 代表性结果
这些染色程序由糖尿病胰腺器官捐献者JDRF网络（nPOD）开发，旨在为石蜡包埋组织和新鲜冷冻组织块提供基础表征。每位捐献者的胰腺各区域（头、体、尾）及脾脏均需进行基础表征，包括各区域取2个组织块进行染色（图1，另见病例提交表单，附录1）。H&amp;E染色使用自动染色仪完成，其程序设置与临床机构一致，全过程采用临床级试剂。当额外切片新的组织块时，每块均需制备一张H&amp;E切片以显示组织形态。当组织块再次切片（例如分发给研究人员时），深层切片也需制备代表性H&amp;E切片，以记录整个组织块的组织形态，并在每一层对连续切片进行编号。染色后的切片需标注病例编号、胰腺区域、组织块编号、染色类型及日期（图2），并扫描录入在线病理信息管理系统。对照捐献者的代表性图像在图3中以低倍和高倍显示，以展示本方案预期的结果。使用胰多肽（D,H）染色的切片在另一天手工完成检测，结果显示苏木精复染的染色强度有所降低。不同检测批次间应尽量避免一抗或复染染色强度的差异，特别是当使用图像分析时，否则需对每张切片进行单独的颜色校正，以获得一致的细胞区域或计数结果。
每个实验室都应根据抗体批次间的差异以及其他试剂和条件的影响，对抗体浓度进行优化，因为这些因素可能影响染色的强度和特异性。当获取新的试剂时，需使用已知的阳性和阴性对照样本验证染色程序，以确保达到与先前试剂相同的染色强度。nPOD病理核心实验室已优化的其他抗体列于表2中，可供参考，并已用于共聚焦显微镜的多标记免疫荧光检测。
<img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig1.jpg" alt="胰腺解剖示意图；用于组织学分析的石蜡和OCT包埋块制备。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. Dako染色板布局。 本示意图展示了一例来自nPOD供体胰腺在Dako全自动染色仪上进行的常规分析。nPOD供体以四位数字编号标识。图中显示两个载玻片托盘，载玻片按染色类型排列。根据供体载玻片数量不同，载玻片排布可能有所调整。阳性对照包括：已知阳性供体组织用于两种双重染色，以及供体脾脏组织用于Ki-67和CD3染色。阴性对照为双重设置，包括来自同一供体胰腺包埋块的两张切片，使用与一抗相同宿主物种的免疫球蛋白（Ig）进行孵育；另包括供体脾脏的两张切片，用于胰岛素和胰高血糖素染色的阴性对照。
<img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig2.jpg" alt="脊椎动物神经管发育示意图；前后轴分节阶段 A、B、D。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 典型的双染色切片。 显示一个典型的成品切片，包含切片标记参数和组织在数字扫描前的放置位置。
<img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig3.jpg" alt="使用H&amp;E染色及Ki67+胰岛素、CD3+胰高血糖素标记物对胰腺组织进行的组织学分析示意图" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 胰腺切片中代表性H&amp;E染色与免疫组化染色结果。 来自一名成年女性器官捐献者（6096-04 PanHead）胰腺的组织切片按本实验方案所述方法进行染色并获取数字扫描图像。图像通过ImageScope阅片程序获得，A-D为整张切片图像，E-H为单个胰岛图像。在B-D图中可见胰岛素、胰高血糖素及胰多肽的预期染色强度；其中D图显示，该胰头组织块包含少量钩突区域或腹侧胰腺叶组织，因为所有胰岛主要由胰多肽阳性细胞构成。请注意，D图中的苏木精复染颜色过浅，而B图和C图中的苏木精复染强度适中。E-H图显示来自背侧胰叶的一个胰岛，其中β细胞与α细胞分布符合预期。少量胰多肽阳性细胞位于胰岛左下区域（H图）。A、E：H&amp;E染色；B、F：Ki67+胰岛素染色；C、G：CD3+胰高血糖素染色；D、H：胰多肽染色。A-D：0.2倍放大；E-H：12.8倍放大。

<ol><li>In't Veld, P., Marichal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+anatomy+of+the+human+islet+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).</li>
<li>Matveyenko, A. V., Butler, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+beta-cell+mass+and+diabetes+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Obes.+Metab%22%5BJournal%5D)">Relationship between beta-cell mass and diabetes onset.</a> Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008).</li>
<li>Saisho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+volumes+in+humans+from+birth+to+age+one+hundred+taking+into+account+sex%2C+obesity%2C+and+presence+of+type-2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Anat%22%5BJournal%5D)">Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes.</a> Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).</li>
<li>Hruban, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+intraepithelial+neoplasia%3A+a+new+nomenclature+and+classification+system+for+pancreatic+duct+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions.</a> Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).</li>
<li>Campbell-Thompson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+adenocarcinoma+patients+with+localised+chronic+severe+pancreatitis+show+an+increased+number+of+single+beta+cells%2C+without+alterations+in+fractional+insulin+area%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area.</a> Diabetologia. 52, 262-270 (2009).</li>
<li>Meier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+replication+is+the+primary+mechanism+subserving+the+postnatal+expansion+of+beta-cell+mass+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.</a> Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).</li>
<li>Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pancreas+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The pancreas in human type 1 diabetes.</a> Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).</li>
<li>Veld, I. n't, P, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulitis+in+human+type+1+diabetes%3A+The+quest+for+an+elusive+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion.</a> Islets. 3, 131-138 (2011).</li>
<li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+etiology%2C+immunology%2C+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

免疫组化（IHC）操作流程的标准化对于图像分析至关重要，尤其是在长时间内对大量切片使用基于计算机的分析算法时。本报告中描述的IHC染色程序经过改进自先前的研究5，可在8小时工作日内利用自动染色仪对同一供体的样本进行批量处理。所有染色切片的数字化全切片图像均通过基于网络的在线病理系统提供给nPOD合作研究人员。研究人员可结合切片查看供体的人口统计学信息、实验室数据及其他相关临床病史，并据此选择最适用于其研究的组织块（更多信息请参见<a href="http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php" target="_blank">http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php</a>）。该在线病理系统起到了“虚拟生物样本库”的作用。未来将进一步优化该系统，通过在切片标签中引入条形码，追踪每个组织块的连续切片和不同切面，最终实现胰腺的三维重建。
选择这两种双重染色方法，主要是为了确定胰岛β细胞（胰岛素）的组成，并结合细胞增殖（Ki-67）情况进行分析，这对于理解1型糖尿病中成年β细胞...

<table><tbody><tr><td>30% 过氧化氢（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>费舍尔科技公司</td><td>H325-500</td><td>内源性过氧化物酶阻断</td></tr><tr><td>ABC-碱性磷酸酶（AP）</td><td>Vector Laboratories</td><td>AK-5000</td><td>AP 结合物</td></tr><tr><td>抗体稀释液</td><td>Invitrogen</td><td>003218</td><td>一抗</td></tr><tr><td>亲和素阻断剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-2001</td><td>阻断内源性生物素</td></tr><tr><td>生物素化山羊抗豚鼠抗体</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-7000</td><td>二抗</td></tr><tr><td>蓝化试剂</td><td>费舍尔科技公司</td><td>7301</td><td>Leica 自动染色机</td></tr><tr><td>柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0</td><td>BioGenex</td><td>HK086-9K</td><td>抗原修复</td></tr><tr><td>Clarifier 1</td><td>费舍尔科技公司</td><td>7401</td><td>Leica 自动染色机</td></tr><tr><td>Cytoseal XYL</td><td>费舍尔科技公司</td><td>8312-4</td><td>盖玻片封片剂</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>HRP 显色剂</td></tr><tr><td>DEEB</td><td>Dako</td><td>S2003</td><td>内源性 AP 阻断试剂</td></tr><tr><td>醇溶伊红 Y</td><td>费舍尔科技公司</td><td>71204</td><td>Leica 自动染色机</td></tr><tr><td>乙醇 — 100%、95%、90%、70%</td><td>费舍尔科技公司</td><td>Various</td><td>脱蜡和封片</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Dako</td><td>S3301</td><td>Dako 自动染色机</td></tr><tr><td>苏木精 7211</td><td>费舍尔科技公司</td><td>7211</td><td>Leica 自动染色机</td></tr><tr><td>IgG（所有一抗宿主物种）</td><td>Various</td><td>Various</td><td>一抗阴性对照</td></tr><tr><td>液体永久红（LPR）</td><td>Dako</td><td>K0640</td><td>AP 显色剂</td></tr><tr><td>Mach2 AP</td><td>Biocare Medical</td><td>MALP521L</td><td>山羊抗小鼠 AP 结合物</td></tr><tr><td>Mach2 HRP</td><td>Biocare Medical</td><td>MHRP520L</td><td>山羊抗小鼠 HRP 结合物</td></tr><tr><td>Mach2 HRP</td><td>Biocare Medical</td><td>RHRP520L</td><td>山羊抗小鼠 HRP 结合物</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>费舍尔科技公司</td><td>Various</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 稀释液</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td>IHC 阻断试剂</td></tr><tr><td>Sniper</td><td>Biocare Medical</td><td>BS966M</td><td>IHC 阻断试剂</td></tr><tr><td>TBST 20X</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>TA-999-TT</td><td>IHC 缓冲液</td></tr><tr><td>Triology 20x</td><td>Cell Marque</td><td>920P-06</td><td>抗原修复</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>费舍尔科技公司</td><td>Various</td><td>脱蜡和封片</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 1.&lt;/strong&gt; 特定试剂。</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">石蜡</td></tr><tr><td>淀粉酶</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-46657</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>胰淀素</td><td>Serotec</td><td>MCA11267</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>碳酸酐酶 19.9</td><td>Abcam</td><td>ab15146</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>剪切型 Caspase-3</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9961</td><td>兔</td></tr><tr><td>CD20</td><td>Dako</td><td>M0755</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>CD3</td><td>Dako</td><td>A0452</td><td>兔</td></tr><tr><td>CD34</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3569</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>CD4</td><td>Dako</td><td>M7310</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Dako</td><td>M0754</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>CD68</td><td>Dako</td><td>M0876</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>CD8</td><td>Dako</td><td>M7103</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>嗜铬粒蛋白 A</td><td>Dako</td><td>A0430</td><td>兔</td></tr><tr><td>CK17</td><td>Dako</td><td>M7046</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>CK19</td><td>Dako</td><td>M0772</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>CK7</td><td>Dako</td><td>M7018</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>C 肽</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4593</td><td>兔</td></tr><tr><td>Foxp3</td><td>e Bioscience</td><td>14-4776-80</td><td>大鼠</td></tr><tr><td>Ghrelin</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-10386</td><td>山羊</td></tr><tr><td>Ghrelin</td><td>Abcam</td><td>ab85104</td><td>兔</td></tr><tr><td>胰高血糖素</td><td>Dako</td><td>A0565</td><td>兔</td></tr><tr><td>胰高血糖素</td><td>Abcam</td><td>ab10988</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>胰高血糖素</td><td>Bachem</td><td>T-5037</td><td>豚鼠</td></tr><tr><td>Glut-1</td><td>Abcam</td><td>ab40084</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>Glut-2</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9117</td><td>兔</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>豚鼠</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>Dako</td><td>M7240</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>Mafa</td><td>Novus Biological</td><td>NB400-137A</td><td>兔</td></tr><tr><td>胰多肽</td><td>Invitrogen</td><td>18-0043</td><td>兔</td></tr><tr><td>Pdx-1</td><td>Abcam</td><td>ab47308</td><td>豚鼠</td></tr><tr><td>前胰岛素</td><td>Novocastra</td><td>NCL-proin-1G4</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>前胰岛素</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>GS-9A8</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>分泌粒蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA 006641</td><td>兔</td></tr><tr><td>平滑肌肌动蛋白</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td>兔</td></tr><tr><td>生长抑素</td><td>Dako</td><td>A0566</td><td>兔</td></tr><tr><td>突触素</td><td>Dako</td><td>M0776</td><td>小鼠</td></tr><tr><td colspan="4">新鲜冷冻</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Abcam</td><td>ab6332</td><td>大鼠</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Serotec</td><td>AHP1226</td><td>兔</td></tr><tr><td>CD25</td><td>Novus Biological</td><td>NB 600-564</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>CD94</td><td>Abcam</td><td>ab61874</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>GAD65</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-130569</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>HLA-ABC</td><td>Dako</td><td>M0736</td><td>小鼠</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 2.&lt;/strong&gt; 一抗。</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Aperio Scanscope CS</td><td>Aperio Technologies</td><td></td><td>数字切片扫描仪</td></tr><tr><td>DAKO Autostainer Plus</td><td>Dako</td><td></td><td>IHC 染色</td></tr><tr><td>Label Matrix 打印软件</td><td>BioCarta</td><td>LM7UP57</td><td>切片标签软件</td></tr><tr><td>Leica XL Autostainer</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>H&amp;E 染色</td></tr><tr><td>优质盖玻片</td><td>费舍尔科技公司</td><td>12-548-5J</td><td>盖玻片</td></tr><tr><td>Spectrum Information Manager</td><td>Aperio Technologies</td><td></td><td>扫描仪软件</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 载玻片</td><td>费舍尔科技公司</td><td>12-550-15</td><td>带正电荷载玻片</td></tr><tr><td>蔬菜蒸锅</td><td>Black and Decker</td><td>Various</td><td>抗原修复</td></tr><tr><td>Zebra TLP 3742</td><td>CDWG</td><td>TLP3742</td><td>切片标签打印机</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 3.&lt;/strong&gt; 特定耗材与设备。</td></tr></tbody></table>

人胰岛染色方案

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

成人胰腺中胰岛面积、数量以及内分泌细胞组成的估计值差异较大，胰岛数量从数十万到数百万不等，β细胞质量范围为500至1500 mg1-3。鉴于这种已知的异质性，我们建立了一种标准化的处理和染色流程，以明确定义胰腺区域，并通过严格的组织病理学和免疫定位检测对胰岛进行表征。
本系列第1部分描述了对器官捐献者获取的人胰腺进行处理的标准操作流程。胰腺被分为3个主要区域（头、体、尾），随后进行横向切片。根据大小，胰腺头部的横切片进一步被分割，并按字母顺序编号以表示不同的亚区。该标准化流程可实现对胰腺头部区域（包括主要由胰多肽细胞组成的胰岛的钩突区域）至尾部区域的完整横断面分析。
本报告为该系列的第二部分，介绍了胰腺石蜡切片连续切片及组织病理学表征的操作步骤，重点在于胰岛内分泌细胞、细胞复制以及T细胞浸润的分析。胰腺组织切片的病理学评估旨在全面描述外分泌部、导管结构以及内分泌成分。对外分泌部的评估包括是否存在胰腺炎（活动性或慢性）、萎缩、纤维化和脂肪变性，同时评估导管系统，特别是与胰腺导管内肿瘤形成相关的病变4。胰岛的评估则通过苏木精-伊红（H&amp;E）染色和免疫组织化学（IHC）染色，分析其形态、大小和密度、内分泌细胞情况、炎症浸润、纤维化、淀粉样物质沉积，以及是否存在增殖性或凋亡性细胞。
第2部分中描述的最后一个组分是将染色后的切片以数字化全切片图像的形式提供。这些数字化切片按照病例和胰腺区域进行组织，存储于一个在线病理学数据库中，形成一个虚拟生物样本库。目前，该在线资源库已向200多名参与1型糖尿病研究的临床医生和科研人员开放。该在线数据库为快速、全面地共享数据提供了途径，同时也使研究人员能够选择石蜡包埋或冷冻连续切片的组织块。

本视频演示了使用苏木精和伊红（H&E）以及免疫组织化学（IHC）对人胰岛进行表征的实验步骤。对胰腺头、体和尾部位的组织切片分别进行H&E和IHC染色，以确定胰岛的内分泌细胞组成（胰岛素、胰高血糖素和胰多肽）、细胞增殖情况（Ki67）以及炎性浸润（H&E、CD3）。通过胰多肽的免疫组织化学染色来定位钩突区域。

成人人类胰腺中胰岛面积与数量的估计值，以及内分泌细胞的组成，从数十万到数百万不等，并且……

本实验的总体目标是通过苏木精和伊红染色以及免疫组织化学方法对人体胰腺胰岛进行表征。该目标通过制备包埋于石蜡块中的胰腺样本的连续切片来实现。随后，将这些切片按原始方向置于载玻片上。部分切片使用伊红-苏木精染色，其余切片则通过免疫组织化学法染色，最后一步是扫描染色后的切片并按病例进行归类。最终，这些图像可上传至在线病理学数据库，供本领域的其他研究人员查看。该技术相较于现有方法的主要优势在于，切片在染色过程中能够以系列形式进行，同时保持其原始方向。本次操作演示由本实验室的组织技术员 Linda Snyder、生物科学家 Emily Montgomery 和实验室技术员 Tiffany Hippo 进行。首先，按照石蜡切片的标准操作程序设置水浴锅和切片机。随后，使用载玻片标记笔在带正电荷的载玻片上标注病例编号、胰腺区域和玻片编号。所有准备工作完成后，将石蜡包埋块放入切片机夹具中，使包埋盒标签位于左侧。按照常规切片程序切片，直至组织均匀暴露。当组织切面均匀一致时，连续切下厚度约为四微米的带状连续切片。根据所需的初始染色数量，需要三到六个切片。接下来，将切片带中的各切片分开。按顺序逐个拾取每个切片，并将其放置在载玻片上。用铅笔记录切片编号。若某个切片无法使用，则跳过该编号，并按确切顺序继续对后续切片进行编号。将切片放置于载玻片上时，须保持其在包埋盒中原有的方向，并使载玻片标签位于左侧。接下来，将切片放入切片架中，室温下过夜晾干。在室温下，用一层薄薄的石蜡重新封固石蜡块表面，以保存组织，并将石蜡块在室温或-20摄氏度条件下存档。对下一个样品重复此操作步骤。对于连续切片的编号，每个层级都应保持如上所述的H和E染色顺序。将每个组织块的第一张切片放入载玻片架中，然后将玻片架放入自动染色机的第一个染色槽内。选择标准的HE染色程序并启动染色过程。染色完成后，将载玻片从自动染色机中取出，放入通风橱内进行封片。采用标准技术在每张载玻片上加盖盖玻片。最后，使用打印标签标记载玻片，并在通风橱中充分干燥。首先设置自动染色机并准备所有必要的试剂。选择用于双重染色的Daco程序。输入玻片数量及每张玻片将接受的处理方案。根据制造商的建议将所有试剂加入自动染色机中。接着，配制本实验步骤所需的TBST和柠檬酸缓冲液、抗体及其他试剂。将切片放入二甲苯中孵育5分钟以脱蜡。切勿让玻片干燥，否则在脱蜡过程中会导致背景染色过强和孔隙染色。使用前将柠檬酸缓冲液倒入蒸锅中预热。随后，将脱蜡后的玻片依次进行系列乙醇洗涤。用去离子水将玻片再冲洗一次。将玻片放入预热的柠檬酸盐缓冲液中，蒸汽处理30分钟。处理结束后，立即将玻片转移至室温水浴中，直至完全冷却。冷却后，将切片转移至Dayco自动染色机的染色架上，并注意保持正确的顺序。最后，运行之前加载的双重染色程序；程序完成后，从自动染色机中取出切片，在脱水前使其干燥至少一小

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