检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物悬浮细胞培养使用邻近连接测定

在这里，证明了原位邻近连接测定（PLA）如何可以用于检测和可视化暴露于基因毒性应激的悬浮细胞培养物中ATM和p53之间的直接蛋白质 - 蛋白质相互作用。

该邻位连接测定实验的总体目标是可视化和量化 DNA 损伤反应的形成，并在悬浮细胞培养物中诱导 DNA 损伤后修复蛋白质复合物。这种方法可以帮助回答 DNA 损伤修复中的关键问题，例如时空组织和调节，以及不同的修复途径如何响应不同类型的 DNA 损伤。该技术的主要优点是相对简单，需要低细胞数，并且不需要大量加工，这可能会破坏或改变蛋白质-蛋白质相互作用。

虽然这种方法可以深入了解 DNA 修复、培养悬浮细胞中蛋白质复合物的形成，但它也可以应用于培养的贴壁细胞、冷冻或石蜡包埋的组织，甚至整个动物。本研究使用人 BCR 阳性 b 细胞急性淋巴细胞系 BV-173，并在 37 摄氏度和 5%CO2 的气氛中与 IMDM 一起培养。将细胞以每毫升 5 毫升的 6 毫升接种在六孔板中，以每毫升 10 倍到 6 分

为了将细胞停滞在细胞周期的 G1 期，向每个孔中加入 5 微摩尔的甲磺酸铵，并将板在 37 摄氏度、5%CO2 的气氛中孵育过夜。第二天，向两个孔中分别加入 5 微摩尔的 ATM 抑制剂，并将板放回培养箱中 30 分钟。接下来，将每毫升 50 ng 的 NCS 添加到用 ATM 抑制剂预处理的孔之一和未预处理的孔中，以诱导 DNA 损伤。

孵育 2 小时。通过在烧杯中将 5 克馏分 5 BSA 叠加在 50 毫升 1XPBS 上来制备 1XPBS 加 10%BSA，并使其在室温下放置，不要摇晃或搅拌，直到 BSA 溶解。通过 0.22 微米过滤器缓慢过滤 PBS 加 10% BSA 溶液并保持在冰上。

收获细胞，将每个孔的内容物转移到 15 毫升试管中。用冰冷的 1XBPS 洗涤细胞两次。细胞计数后，以 10 倍/毫升的 10 至 6 个细胞在 1XBPS 加 10% BSA 中重悬

将细胞放在冰上。用无绒纸巾仔细抛光显微镜载玻片，并将 96% 乙醇放入 Coplin 罐中 5 分钟，使其脱脂，从而为此过程准备显微镜载玻片。让玻片风干 10 分钟。

将显微镜载玻片组装到面积为 6 毫升的细胞离心涂片细胞学漏斗中。将 50 μL 1XPBS 加 10% BSA 移液到每个漏斗中，以 500 RPM 离心 1 分钟，对载玻片进行预涂。向每个漏斗中加入 100 μL 细胞悬液，并以 500 RPM 离心 5 分钟。

小心地拆卸漏斗，确保不要触摸载玻片上的斑点。使用带有 5 毫米尖端的巴氏笔液体阻滞剂在每个点周围画一个圆圈。然后向每个点添加 50 微升 4% PFA 固定液。

并在室温下孵育 30 分钟。30 分钟后，在室温下用 1XPBS 在 Coplin 染色缸中轻轻搅拌洗涤细胞。以这种方式洗涤 3 次，每次 5 分钟。

用无绒纸巾擦干斑点周围的载玻片，并通过倾斜载玻片并用无绒纸巾干燥来去除斑点上的尽可能多的液体。向每个点添加 50 微升 0.25% Triton X 的 1XPBS 溶液，并在室温下孵育 10 分钟，不要搅拌。在室温下，在 Coplin 染色缸中用 50 至 60 毫升 TBS-T 洗涤载玻片，并轻轻搅拌。

三次，每次 5 分钟。封闭前，轻拍 TBS-T 并用无绒纸巾擦干该点周围的载玻片。尽可能多地从现场去除液体。

短暂涡旋封闭溶液，然后向每个斑点加入一滴约 40 微升。将玻片放入预热的加湿室中，并在 37 摄氏度下孵育 1 小时。制备抗体混合物。

涡旋，然后将市售抗体稀释液移液到每个微量离心管中。以 1：1000 的比例添加山羊抗 ATM 抗体。兔抗磷酸丝氨酸-15 p53 抗体的比例为 1：100。

对于单抗体对照实验，制备仅包含山羊抗 ATM 抗体和仅包含兔抗磷酸丝氨酸-15 p53 抗体的抗体稀释液。孵育 1 小时后，轻敲封闭溶液，但注意不要让细胞变干。加入 30 μL 每种抗体混合物稀释液，并在 4 摄氏度的加湿室中孵育过夜。

第二天，在 Coplin 染色缸中，用 1X NC2 洗涤缓冲液 A 在室温下洗涤玻片，轻轻搅拌 2 次，每次 5 分钟。用洗涤缓冲液 A 洗涤载玻片两次后，从载玻片上轻敲洗涤缓冲液，并向每个点添加 30 微升邻位连接测定探针混合物。在 37 摄氏度下在预热的加湿室中孵育 1 小时。

室温下，在 Coplin 染色缸中用 50 至 60 mL 洗涤缓冲液 A 洗涤载玻片，并轻轻搅拌。接下来，在每个点的 39 μL 连接溶液中加入 1 μL 连接酶，在冰上制备连接酶溶液。向每个点添加 40 μL 连接连接酶溶液。

在 37 摄氏度的预热加湿室中孵育 30 分钟。在室温下，在 Coplin 罐中用洗涤缓冲液 A 洗涤载玻片，轻轻搅拌。在冰上制备扩增聚合酶混合物。

首先用水稀释扩增储备液 1 至 5。对于每个点，将 0.5 μL 聚合酶添加到 39.5 μL 1X 扩增溶液中。轻弹洗涤缓冲液，每个点加入 40 μL 扩增聚合酶混合物。

在 37 摄氏度下在预热的加湿室中孵育 100 分钟。孵育 100 分钟后，轻敲扩增聚合酶混合物，并在 Coplin 染色缸中用 1X NC2 洗涤缓冲液 B 洗涤玻片。在室温下轻轻搅拌 2 次，每次 10 分钟。

之后，在 0.01x 洗涤缓冲液 B 中洗涤玻片 1 分钟。拍掉多余的洗涤缓冲液 B，然后用无绒纸巾擦干斑点周围的载玻片。尽可能多地从现场去除液体。

通过在不含 DAPI 的封固剂中以 1：5 的比例稀释含有封固剂的 DAPI，制备含有不会使细胞核过度变色的 DAPI。将 25 至 30 微升稀释的含 DAPI 封固剂添加到 24 毫米 x 24 毫米的盖玻片中。用载玻片拿起盖玻片并轻轻按压以确保没有气泡滞留。

用指甲油密封盖玻片，并等待至少 15 分钟后再成像。最后，使用共聚焦荧光显微镜对载玻片进行成像和分析。邻位连接测定用于研究 ATM 与磷酸丝氨酸 15 p53 在 G1 期停滞的 BV 173 人 BCR 阳性细胞中的相互作用。

与未用 NCS 处理诱导 DNA 损伤的细胞相比，大多数用 NCS 处理的细胞仅在细胞核中具有点状信号，平均每个细胞有 7 个信号。这表明 DNA 损伤的诱导导致 ATM 和磷酸丝氨酸 15 p53 之间的相互作用。在诱导 DNA 损伤之前，用特异性 ATM 激酶抑制剂预处理细胞，将信号数量减少到每个细胞平均两个信号，证实 p53 在残基丝氨酸 15 位点的磷酸化取决于 ATM 激酶活性。

在发射抗 ATM 或抗磷酸丝氨酸 15 p53 抗体的单抗体对照实验中，未按预期产生任何信号。该图显示了结果的定量和统计分析，这些结果证明并证实了邻位连接测定技术对悬浮细胞培养物的细胞离心涂片制备物的特异性。一旦掌握，如果作得当，该技术可以在与一抗孵育过夜后约 5 小时内完成。

在尝试此程序时，请务必记住在进行邻位连接测定之前，通过对目标细胞进行免疫荧光染色来仔细滴定抗体。开发后，这项技术为细胞生物学研究人员探索瞬时蛋白质相互作用铺平了道路，这些相互作用很难使用标准方法（如免疫沉淀和基于 FRET 的成像）进行评估，这通常会导致技术伪影。观看此视频后，您应该对如何对悬浮细胞培养物进行邻位连接测定以原位可视化和定量蛋白质蛋白质相互作用有很好的了解。