Name: 检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物悬浮细胞培养使用邻近连接测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 学习使用邻近连接测定法在悬浮细胞培养中检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物。该方法利用BV-173细胞系研究ATM与p53的相互作用，为DNA损伤修复机制提供定量分析。

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Guikema 实验室的研究工作由荷兰科学研究组织（Netherlands Organization for Scientific Research）的创新研究激励计划（VIDI 资助项目 016126355）以及“Stichting Kinderen Kankervrij” KiKA（项目 252）提供资助。

1. 细胞处理与DNA损伤诱导
<ol>
	<li>在 IMDM 培养基中培养人 BCR-ABL+ B 细胞急性淋巴母细胞白血病细胞系 BV173 或 SUP-B15，培养基中添加 20% 胎牛血清（FCS）、50 μM β-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素，在 37 °C、5% CO2 气氛条件下培养。计数细胞后，以每孔 5 mL、2 × 106 个细胞/mL 的密度接种至 6 孔板中。 
	注意：可选择使用其他来源的悬浮细胞系。</li>
	<li>为将 BCR-ABL+ B-ALL 细胞阻滞在细胞周期的 G1 期，加入 5 μM 甲磺酸伊马替尼（STI571），并过夜孵育。
	<ol>
		<li>若研究整个细胞周期中或 BCR-ABL 阴性细胞类型中的蛋白质-蛋白质相互作用，可省略此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过向培养物中加入 50 ng/mL 新生霉素（neocarzinostatin, NCS）以诱导 DNA 损伤，并孵育 2 小时。
	<ol>
		<li>或者，可使用放射性源 [137Cs] 对细胞进行照射以诱导 DNA 损伤，照射剂量率为 0.5 Gy/min，总剂量为 5 Gy。照射后，在 37 °C、5% CO2 气氛条件下恢复培养 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如需评估 ATM 激酶活性在 DNA 损伤应答中的作用，可在加入 NCS 或实施照射处理前，预先加入 5 μM ATM 激酶抑制剂 KU55933。</li>
	<li>通过将 5 g 分级沉淀 V 的牛血清白蛋白（BSA）覆盖于 50 mL 1× PBS 上，在烧杯或锥形瓶中配制 1× PBS + 10% BSA 溶液，室温静置直至 BSA 完全溶解。切勿振荡或搅拌，以免产生大量泡沫。随后缓慢通过 0.22 μm 滤器过滤，并置于冰上保存。</li>
	<li>收集细胞，并用预冷的 1× PBS 洗涤两次。计数细胞后，用 1× PBS + 10% BSA 将细胞重悬至浓度为 2 × 106/mL，并保持在冰上。</li>
</ol>
2. 细胞离心、固定和通透
<ol>
	<li>新鲜配制4%多聚甲醛溶液于1×PBS中。将2 g PFA加入50 mL 1×PBS中，置于55 °C摇床水浴中孵育，直至溶液澄清。用0.22 μm滤膜过滤溶液，并在室温下保存备用。 
	注意：可选地，4% PFA固定液可于-20 °C冷冻保存。冷冻后仅允许解冻一次使用。否则，也可直接购买PBS中的4% PFA溶液。</li>
	<li>用无绒布小心抛光76 mm × 26 mm显微镜载玻片，并将其置于Coplin瓶中的96%乙醇中5分钟以脱脂。让载玻片在空气中干燥10分钟。</li>
	<li>将显微镜载玻片装入细胞离心机/细胞学漏斗（面积为6 mm）中。通过移液枪向每个漏斗中加入50 μL 1×PBS + 10% BSA进行载玻片预包被，并在500 rpm下离心1分钟。</li>
	<li>向每个漏斗中加入100 μL细胞悬液（相当于0.2 × 106个细胞），在500 rpm下离心5分钟。每种抗体组合至少需要4个样本制备（双抗体实验；两个单抗体对照；无抗体对照）。</li>
	<li>小心拆卸漏斗，切勿触碰样本区域。立即进行样本固定。
	<ol>
		<li>可选步骤：让载玻片在空气中干燥至少30分钟。干燥后，用铝箔单独包裹载玻片，并在-20 °C保存至使用。使用冷冻样本时，应将载玻片包裹在纸巾中解冻，以防止冷凝水直接滴落在载玻片上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用PAP笔液态阻断剂（5 mm笔尖）在样本区域周围画一个圆圈（直径约15–20 mm）。</li>
	<li>向每个样本区域加入50 μL 4% PFA固定液，在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>在Coplin瓶中用1×PBS于室温轻柔振荡洗涤细胞3次，每次5分钟。</li>
	<li>用无绒布将载玻片样本区域周围擦干，并使用移液枪在不接触样本区域的情况下尽可能吸除样本上的液体，或通过倾斜载玻片去除液体。向每个样本区域加入50 μL含0.25% Triton-X的1×PBS溶液，在室温下静置孵育10分钟（无需振荡）。</li>
	<li>在Coplin瓶中用约50–60 mL含0.05% Tween-20的TBS缓冲液（TBS-T）于室温轻柔振荡洗涤载玻片3次，每次5分钟。此方式可同时处理10张载玻片。</li>
</ol>
3. 封闭与一抗孵育
<ol>
	<li>轻敲移除 TBS-T，并用无绒布擦拭载玻片上点样区域周围的液体。使用移液器在不接触点样的情况下尽可能吸除点样处的液体，或通过倾斜载玻片去除液体。短暂涡旋封闭液，然后向每个点样处加入一滴（约 40 μL）。在预热的湿盒中 37 °C 孵育 1 小时。</li>
	<li>通过将羊抗 ATM 抗体以 1:1,000 稀释，以及兔抗磷酸化 Ser15-p53 抗体以 1:100 稀释于商用抗体稀释液中，配制抗体混合液；使用前涡旋混匀抗体稀释液。对于对照实验，分别配制仅含羊抗 ATM 抗体或仅含兔抗磷酸化 Ser15-p53 抗体的稀释液（单抗体对照）。</li>
	<li>轻敲去除封闭液，注意在加入抗体稀释液前避免细胞干燥。向每个点样处加入 30 μL 抗体混合稀释液，在湿盒中 4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>通过将一包 Buffer A 和 Buffer B 分别溶于 1,000 mL 水中，配制 in situ Wash Buffer A 和 Wash Buffer B。
	<ol>
		<li>或者，通过将 8.8 g NaCl、1.2 g Tris-base 和 0.5 mL Tween-20 溶于 800 mL 水中配制 Wash Buffer A。用 HCl 调节 pH 至 7.4，加水至终体积 1,000 mL。</li>
		<li>或者，通过将 5.84 g NaCl、4.24 g Tris-base 和 26.0 g Tris-HCl 溶于 500 mL 水中配制 Wash Buffer B。用 HCl 调节 pH 至 7.5，加水至终体积 1,000 mL。</li>
		<li>将两种溶液均通过 0.22 μm 滤器过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下，用 1x in situ Wash Buffer A 在 Coplin 染色缸中轻轻振荡洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗 2 次。</li>
</ol>
4. PLA 探针、连接与扩增
<ol>
	<li>通过将抗山羊 PLUS 和抗兔 MINUS 探针均用商用抗体稀释液按 1:5 比例稀释来制备 PLA 探针。从载玻片上吸去 1× in situ 洗涤缓冲液 A，每点加入 30 μL PLA 探针混合液。在预热的湿化室中 37 °C 孵育 1 小时。 
	注意：可使用任意组合的 PLUS 和 MINUS PLA 二抗探针（抗小鼠、抗兔、抗山羊），只要所用的一抗来源于不同物种，且 PLA 探针组合中始终包含一个 PLUS 探针和一个 MINUS 探针。</li>
	<li>在室温下，将载玻片置于 Coplin 染色缸中，用约 50–60 mL 的 1× in situ 洗涤缓冲液 A 轻柔振荡洗涤 2 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在冰上配制连接-连接酶溶液：将 1 μL 连接酶加入 39 μL 连接溶液中，混匀后每点加入 40 μL 连接-连接酶溶液。在预热的湿化室中 37 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>在室温下，将载玻片置于 Coplin 染色缸中，用约 50–60 mL 的 1× in situ 洗涤缓冲液 A 轻柔振荡洗涤 2 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在冰上配制扩增-聚合酶混合液：将扩增储存液用水按 1:5 比例稀释，然后每点加入 0.5 μL 聚合酶至 39.5 μL 的 1× 扩增溶液中。 
	注意：扩增试剂对光敏感，应避免直接暴露于光照下。扩增试剂有四种不同颜色（红色：激发波长 594 nm，发射波长 624 nm；远红：激发波长 644 nm，发射波长 669 nm；橙色：激发波长 554 nm，发射波长 576 nm；绿色：激发波长 501 nm，发射波长 523 nm），请确保所用显微镜系统具备适合激发和滤光以检测这些颜色的配置。</li>
	<li>吸去 1× in situ 洗涤缓冲液 A，每点加入 40 μL 扩增-聚合酶混合液。在预热的湿化室中 37 °C 孵育 100 分钟。</li>
</ol>
5. 封片与成像
<ol>
	<li>制备 0.01x 原位 通过将1 mL 1×洗涤缓冲液B加入99 mL水中，配制洗涤缓冲液B。</li>
	<li>轻敲去除扩增-聚合酶混合物，并用1x缓冲液洗涤载玻片2次，每次10分钟 原位 在室温下，于Coplin罐中用缓冲液B轻轻振荡洗涤。</li>
	<li>用 0.01x 洗涤缓冲液 B 清洗载玻片 1 分钟。</li>
	<li>轻敲去除多余的0.01×洗涤缓冲液B，用无绒纸巾擦干点样区域周围的载玻片。使用移液器尽可能吸除点样区域的液体，注意不要触碰样点，或通过倾斜载玻片的方式去除液体。</li>
	<li>将含DAPI的封片液用不含DAPI的封片液按1:5比例稀释，以避免细胞核染色过深。</li>
	<li>向24 mm × 24 mm的盖玻片上加入25–30 μL含1:5 DAPI的封片剂，将盖玻片连同载玻片一起拿起，轻轻按压以确保无气泡残留。用指甲油封闭盖玻片边缘，成像前至少静置15分钟。</li>
	<li>使用（共聚焦）荧光显微镜分析载玻片。
	<ol>
		<li>在至少4个获取的图像视野中（20倍物镜），对每种条件或抗体组合下至少20个细胞进行计数，统计每个细胞中点状PLA信号的数量；计数依据此前报道的效能分析，设定处理组细胞信号均值为7 ± 5，未处理组为2 ± 2，Ⅰ类错误概率为0.05，检验效能为80%15). 
		注意：通过使用软件包获取Z轴层扫图像并进行去卷积，可获得最佳分辨率例如，ImageJ，Leica Acquisition Suite (LAS)）。信号应清晰可见于DAPI染色所界定的细胞核轮廓内。</li>
		<li>不要计数明显位于细胞核外的信号。通常情况下，NCS处理或γ射线照射后，每个细胞会产生约5-10个phospho-p53/ATM PLA信号。单抗体对照可能会产生一定的背景信号，但每20个细胞中最多仅有1个细胞出现1-2个PLA信号。</li>
		<li>出于发表和展示目的，应使用40X或63X油浸物镜采集图像。载玻片可存放于4 °C环境中，并应避免光照。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本报告表明，PLA 可用于检测和可视化悬浮细胞培养物中蛋白质之间的特异性相互作用。值得注意的是，此处描述的实验方案不仅限于DNA修复复合物的研究，还可用于可视化和定量悬浮细胞培养物中的其他蛋白质-蛋白质相互作用。实验结果显示，在暴露于诱导DNA损伤的试剂后，ATM激酶在G1期阻滞的BCR-ABL+ B-ALL细胞中与磷酸化的p53发生相互作用。此前，我们曾利用PLA技术发现ATM与转录因子FOXO1在BCR-ABL+ B-ALL细胞中存在相互作用，但这种相互作用极可能并未导致FOXO1的ATM依赖性磷酸化。免疫共沉淀内源性ATM/ATR磷酸化蛋白的结果进一步支持了PLA数据：与已知的ATM底物p53和NBS1不同，FOXO1在DNA损伤诱导后不会被ATM磷酸化15。此外，PLA方法已成功应用于研究多种人B细胞淋巴瘤细胞系中错配修复复合物（例如 MSH2与MSH6之间的相互作用）的形成（数据未显示）。在这些特定情况下，PLA技术为支持我们的研究发现提供了一种替代方法。结果表明，PLA能够对不同实验条件下蛋白质-蛋白质相互作用进行半定量评估，并揭示这些相互作...

DNA损伤会触发一系列高度调控的事件，涉及蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后修饰，从而确保DNA得到高效且快速的修复，进而维护基因组的完整性1。通常，通过（共聚焦）荧光显微镜检测所谓的电离辐射诱导灶（IRIF）的形成，来研究暴露于电离辐射下的细胞中的DNA修复过程。许多DNA修复蛋白和DNA损伤感应蛋白会形成IRIF，这些结构代表在发生DNA损伤的染色质位点上聚集形成的蛋白质复合物2,3。IRIF在时间和空间上的定位及其消退过程，为DNA修复的时空组织提供了重要信息，并可能提示不同DNA修复通路的参与。DNA损伤的性质以及细胞所处的细胞周期阶段决定了激活哪条DNA修复通路。例如，在正在进行DNA复制的细胞（S期）中，同源重组（HR）是主要的DNA修复通路；而在处于细胞周期G1期或G2/M期的细胞中，则以非同源末端连接（NHEJ）修复通路为主。DNA损伤后最早发生的事件之一是DNA损伤感应激酶——共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（Ataxia Telangiectasia-Mutated protein, ATM）的活化，该蛋白主要在细胞周期的G1期和G2/M期发挥作用并调控NHEJ；而共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关蛋白（Ataxia Telangiectasia and Rad3-related protein, ATR）则在S期通过激活HR发挥作用。ATM和ATR均为具有多效性的激酶，可磷酸化多种参与DNA修复、细胞死亡与存活的蛋白质4。研究表明，这两种激酶在基因毒性应激后均可磷酸化并激活肿瘤抑制蛋白p53，表明它们是关键肿瘤抑制信号轴的上游调控因子5,6。
通常通过双色免疫荧光染色和显微镜检测不同蛋白质的共定位来评估IRIF的形成及其组成，然而，并非所有参与修复蛋白复合物的蛋白质都会形成IRIF，这限制了该方法的适用性。此外，（共聚焦）免疫荧光显微镜受光的衍射特性限制，空间分辨率较低，约为200–300 nm，超过了大多数亚细胞结构的尺寸，因此本质上无法在分子水平上直接研究蛋白质-蛋白质相互作用。因此，通过（共聚焦）荧光显微镜检测到的免疫荧光染色模式的共定位并不一定代表直接的蛋白质-蛋白质相互作用。近年来，已开发出新的超分辨率技术，例如三维结构照明显微镜（3D-SIM）7，该技术已成功用于在纳米尺度上研究53BP1和BRCA1 IRIF的形成，揭示了共聚焦激光扫描显微镜无法检测到的这些蛋白质的空间分布特征8。
检测蛋白质-蛋白质相互作用还可采用多种其他方法 体内，例如免疫共沉淀、pull-down 方法和酵母双杂交筛选技术。然而，这些技术较为繁琐，需要大量细胞或蛋白质，或涉及蛋白质的过表达，从而可能引入实验假象。最近开发出一种新技术，可实现对蛋白质-蛋白质相互作用的可视化与定量分析 原位 (即 在细胞和组织中），称为邻近连接分析（Proximity Ligation Assay, PLA）9,10两种目标蛋白的特异性一抗由与寡核苷酸偶联的二抗（即所谓的PLA探针）进行识别。当两种不同的二抗因一抗所识别的蛋白之间发生相互作用而足够接近时，其偶联的寡核苷酸可发生杂交并连接形成闭合的环状DNA模板。该环状模板随后通过滚环扩增进行扩增，并利用荧光染料标记的互补寡核苷酸进行检测。通过PLA技术，蛋白相互作用的亚细胞定位得以保留，因为荧光标记的滚环扩增产物仍与PLA探针相连。该检测方法的分辨力为 &#60;50 nm，基于抗体直径约为 7-10 nm 的发现11滚环扩增仅在两对抗体（一抗与二抗）在由其尺寸定义的范围内发生物理相互作用时才能进行（10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm）。信号扩增步骤提高了PLA检测的灵敏度，从而能够检测低丰度表达蛋白之间的相互作用。PLA产生点状、焦点样信号模式，可对单个细胞进行定量分析，进而评估蛋白质-蛋白质相互作用在细胞内和细胞间的差异。
DNA修复复合物和IRIFs的形成与组成主要在贴壁细胞系中进行研究，例如人骨成骨肉瘤上皮细胞系U2OS、人胚胎肾细胞系HEK293以及视网膜色素上皮细胞系RPE-1，这些细胞系生长迅速且易于转染。悬浮细胞培养物，如淋巴系和髓系细胞系，使用频率较低，因为这类细胞较难转染，且通常不能贴附于盖玻片，因此成像时需要额外或替代的步骤。然而，在淋巴系和髓系恶性肿瘤的背景下，DNA损伤的修复具有重要意义，因为这些肿瘤中基因组（驱动）异常常常影响DNA损伤应答，在正常淋巴系和髓系（前体）细胞的恶性转化过程中发挥关键作用12,13,14。
本方案描述了如何利用邻近连接技术（PLA）在悬浮培养细胞中DNA损伤诱导后，评估并定量蛋白质-蛋白质相互作用。本文中，通过PLA检测在DNA损伤后人B细胞白血病细胞中ATM与p53之间的相互作用，并对其进行可视化分析，这些细胞已被诱导进入G1期细胞周期阻滞。值得注意的是，本方案不仅限于研究G1期阻滞的白血病细胞中ATM与p53的相互作用，也可用于在多种细胞类型及悬浮培养细胞中可视化其他蛋白质-蛋白质相互作用。

<table><tbody><tr><td>BV173 细胞系</td><td>DSMZ</td><td>AC-20</td><td>BCR-ABL+ B-ALL 细胞系</td></tr><tr><td>SUP-B15 细胞系</td><td>DSMZ</td><td>ACC-389</td><td>BCR-ABL+ B-ALL 细胞系</td></tr><tr><td>Iscove 改良 Dulbecco 培养基（IMDM）</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>批号 #: 064M3396</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>甲磺酸伊马替尼</td><td>LC Laboratories</td><td>I-5508</td><td>溶于 DMSO，配制 10 mM 储存液</td></tr><tr><td>新制癌菌素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N9162</td><td>具有致突变性和致畸性，操作时需谨慎</td></tr><tr><td>KU55933</td><td>Selleckchem</td><td>S1092</td><td>溶于 DMSO，配制 5 mM 储存液</td></tr><tr><td>Starfrost 显微镜载玻片</td><td>Waldemar Knittel</td><td>VA11200 003FKB</td><td></td></tr><tr><td>PAP 笔液态阻断剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 离心沉降漏斗</td><td>Q Path Labonord SAS</td><td>003411324</td><td></td></tr><tr><td>Duolink 原位红色初学者试剂盒（山羊/兔）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DUO92105</td><td>适用于不同物种/组合，亦有远红、橙色和绿色版本可选</td></tr><tr><td>山羊抗 ATM 抗体</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-136A</td><td>适用于 PLA 实验；我们在研究中成功使用了批号 A300-136A-1</td></tr><tr><td>兔抗磷酸化 Ser15-p53 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9284</td><td>我们在研究中成功使用了批号 #9284-4</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Vectashield 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>PBS 中的 4% 多聚甲醛</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>亦可从其他供应商获取</td></tr></tbody></table>

利用邻位连接技术在悬浮细胞培养物中检测和可视化dna损伤诱导的蛋白质复合物

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

DNA损伤应答协调修复自发产生、由基因毒性应激引起或在淋巴细胞程序性DNA断裂背景下出现的DNA损伤。共济失调毛细血管扩张症突变激酶（ATM）、ATM和Rad3相关激酶（ATR）以及DNA依赖性蛋白激酶的催化亚基（DNA-PKcs）是在DNA损伤发生后最早被激活的因子之一，它们是调控DNA修复、细胞凋亡和细胞存活网络的核心调节分子。作为肿瘤抑制通路的一部分，ATM和ATR通过磷酸化激活p53，从而调控p53的转录活性。DNA损伤还会导致所谓的电离辐射诱导灶（IRIF）的形成，这些灶代表了在DNA损伤位点聚集的DNA损伤感应蛋白和修复蛋白复合物，可通过荧光显微镜观察到。然而，由于荧光显微镜分辨率有限，蛋白在IRIF中的共定位并不一定意味着存在直接的蛋白质-蛋白质相互作用。
原位邻近连接检测（PLA）是一种新颖的技术，可在细胞和组织中直接可视化蛋白质-蛋白质相互作用，具有前所未有的特异性和灵敏度。该技术基于针对目标蛋白质的特异性抗体之间的空间邻近性。当被检测的蛋白质间距在约 40 nm 范围内时，连接于抗体的寡核苷酸将触发扩增反应，扩增产物通过荧光标记进行可视化，从而产生与相互作用蛋白质亚细胞定位相对应的信号。本文以 ATM 与 p53 之间已知的功能性相互作用为例，展示了 PLA 如何用于悬浮细胞培养体系中，研究作为 DNA 损伤应答关键组分的蛋白质之间的直接相互作用。

研究表明，p53在Ser15位点的磷酸化依赖于ATM激酶活性16。为了验证并确认PLA技术在悬浮细胞培养物涂片样本中的特异性，实验显示：在细胞周期G1期停滞的BCR-ABL+ B-ALL细胞经2小时NCS处理以诱导DNA损伤后，如预期那样，ATM与磷酸化Ser15-p53之间发生了特异性相互作用。经NCS处理的大多数细胞核内可观察到点状的PLA信号（图1B），平均每细胞有7个PLA信号15，而在未经NCS处理的细胞中则未检测到此类信号（图1A）。在诱导DNA损伤前，用特异性ATM激酶抑制剂KU55933预处理细胞，可明显减少PLA信号数量，平均每细胞仅剩2个PLA信号（图1C）。ATM与磷酸化Ser15-p53的PLA信号仅出现在细胞核中，符合预期。在PLA实验中，若省略山羊抗ATM抗体或兔抗磷酸化S...

在此演示了如何 原位 邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）可用于检测和可视化在基因毒性应激条件下悬浮培养细胞中ATM与p53之间的直接蛋白质-蛋白质相互作用。

利用邻位连接技术在悬浮细胞培养物中检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物

DNA损伤应答协调修复自发产生、由基因毒性应激引起或在特定背景下出现的DNA损伤

本项邻近连接实验的总体目标是，在悬浮细胞培养物中诱导 DNA 损伤后，对 DNA 损伤应答及修复蛋白复合物的形成进行可视化与定量分析。该方法有助于解答 DNA 损伤修复领域中的关键科学问题，例如蛋白复合物在时空上的组织与调控机制，以及不同 DNA 损伤类型下多种修复通路的响应方式。该技术的主要优势在于操作相对简便、所需细胞数量较少，且无需复杂的处理步骤，从而避免对蛋白质-蛋白质相互作用造成干扰或改变。尽管该方法可用于研究悬浮培养细胞中的DNA修复和蛋白质复合物形成，但它也可应用于培养的贴壁细胞、冷冻或石蜡包埋的组织，甚至整体动物。本研究使用人BCR/ABL阳性B细胞急性淋巴细胞白血病细胞系BV-173，在IMDM培养基中添加补充物，于37°C、5%CO2气氛条件下培养。将细胞以每毫升2×10⁶个细胞的密度接种于6孔板中，每孔5毫升。为了将细胞阻滞在细胞周期的 G1 期，向每孔中加入 5 µM 的甲基磺酸铵，并在含 5% CO2 的环境中于 37°C 下孵育过夜。次日，向两个孔中各加入 5 µM 的 ATM 抑制剂，并将培养板放回培养箱中孵育 30 分钟。接着，通过向一个经 ATM 抑制剂预处理的孔以及另一个未经预处理的孔中各加入 50 ng/mL 的 NCS 来诱导 DNA 损伤。孵育两小时。通过将 5 克 5 号级 BSA 加入 50 毫升 1×PBS 中，于烧杯内室温静置，不振荡或搅拌，直至 BSA 完全溶解，从而制备含 10% BSA 的 1×PBS。随后将含 10% BSA 的 PBS 溶液缓慢经 0.22 微米滤器过滤，并置于冰上保存。将每个孔中的内容物转移至15毫升离心管中收集细胞。用预冷的1×PBS缓冲液洗涤细胞两次。计数后，将细胞重悬于含10% BSA的1×PBS缓冲液中，浓度为2 × 10⁶ 个细胞/毫升。将细胞置于冰上。通过使用无绒布仔细抛光显微镜载玻片，并将其放入盛有96%乙醇的考普林瓶中脱脂5分钟，以准备本实验所需的载玻片。让载玻片在空气中干燥10分钟。将显微镜载玻片组装到容量为六毫升的细胞离心涂片机细胞学漏斗中。通过移液向每个漏斗中加入50微升1×PBS缓冲液和10% BSA，以500转/分钟离心1分钟，对载玻片进行预包被。向每个漏斗中加入100微升细胞悬液，并以500转/分钟离心5分钟。小心拆卸漏斗，注意不要触碰载玻片上的点样区域。使用尖端为5毫米的Pap笔液相阻断剂在每个点样周围画一个圆圈，然后向每个点样区域加入50 µL的4% PFA固定液。室温孵育30分钟。30分钟后，在室温下用1×PBS在Coplin瓶中轻轻振荡洗涤细胞，每次5分钟，共洗涤三次。用无绒布擦拭载玻片上样点周围的区域，并通过倾斜载玻片并用无绒布擦拭，尽可能去除样点中的液体。向每个样点加入50 µL含0.25% Triton X的1×PBS溶液，在室温下静置孵育10分钟，不进行振荡。将载玻片置于盛有50至60 mL TBS-T的科林瓶（Coplin jar）中，在室温下轻轻振荡清洗。每次五分钟，共三次。封闭前，倾去 TBS-T，用无绒布擦拭载玻片上点样区域周围，尽可能吸干点样处的液体。短暂涡旋封闭液，然后向每个点加入约40微升的一滴溶液。将载玻片置于预热的湿盒中，于37摄氏度孵育一小时。配制抗体混合液。涡旋后，用移液器将商用抗体稀释液加入各微量离心管中。按1:1000比例加入羊抗ATM抗体，按1:100比例加入兔抗磷酸化丝氨酸-15 p53抗体。对于单抗体对照实验，配制仅含山羊抗ATM抗体和仅含兔抗p53磷酸化丝氨酸-15抗体的抗体稀释液。完成一小时孵育后，轻拍去除封闭液，注意避免细胞干燥。每种抗体混合稀释液各加入30 µL，在4 °C湿盒中过夜孵育。次日，将载玻片置于 Coplin 染色缸中，用 1X NC2 洗涤缓冲液 A 在室温下轻轻振荡洗涤两次，每次 5 分钟。载玻片用洗涤缓冲液 A 洗涤两次后，轻拍去除洗涤液，然后向每个点加入 30 µL 的邻位连接探针混合液。在预热的湿盒中 37 °C 孵育 1 小时。在室温下，用 50 至 60 毫升洗涤缓冲液 A 在 Coplin 染色缸中轻轻振荡洗涤载玻片。接下来，在冰上配制连接酶反应液：每张芯片点加入 1 微升连接酶至 39 微升连接反应溶液中。向每个点加样 40 微升连接酶反应液。在预热的湿润孵育 chamber 中，37 摄氏度孵育 30 分钟。在室温下，用洗液缓冲液 A 在 Coplin 染色缸中轻轻振荡洗涤载玻片。在冰上配制扩增聚合酶混合液。首先将扩增用储存液用水按1:5的比例稀释。每个点加入0.5微升聚合酶至39.5微升1X扩增溶液中。轻敲去除洗涤缓冲液，每点加入40微升扩增聚合酶混合液。在预热的加湿孵育盒中37摄氏度孵育100分钟。孵育结束后，轻轻倾去扩增聚合酶混合液，将切片置于Coplin瓶中，用1X NC2洗涤缓冲液B洗涤。室温下轻柔振荡洗涤两次，每次10分钟。随后，用 0.01x 洗涤缓冲液 B 清洗玻片 1 分钟。轻拍去除多余的洗涤缓冲液 B，并用无绒纸巾擦干样品点周围的区域。尽可能去除样品点中的液体。通过将含DAPI的封片剂与不含DAPI的封片剂按1:5比例稀释，配制不会过度染色细胞核的含DAPI封片剂。取25至30微升稀释后的含DAPI封片剂滴加到24毫米×24毫米的盖玻片上。用载玻片夹起盖玻片，并轻轻按压，确保无气泡残留。用指甲油封固盖玻片，并至少等待15分钟后再进行成像。最后，使用共聚焦荧光显微镜对玻片进行成像与分析。邻近连接试验用于研究G1期阻滞的BV 173人BCR-ABL阳性细胞中ATM与磷酸化丝氨酸15位点p53之间的相互作用。与未用NCS处理以诱导DNA损伤的细胞相比，经NCS处理的大多数细胞在细胞核内呈现出专一性的点状信号，平均每细胞有七个信号。这表明DNA损伤的诱导导致了ATM与磷酸化丝氨酸15位点p53之间的相互作用。在诱导DNA损伤前，预先用特异性ATM激酶抑制剂处理细胞，可使信号数量减少至平均每细胞两个信号，证实p53在丝氨酸15位点的磷酸化依赖于ATM激酶活性。单独抗体对照实验中，无论是省略抗ATM抗体还是抗p53磷酸化丝氨酸15抗体，均未产生任何信号，结果符合预期。本图展示了对结果的定量与统计分析，证实并验证了邻近连接技术在悬浮细胞培养物的细胞离心涂片制备中的特异性。若操作得当，在经一抗过夜孵育后，掌握该技术后可在约五小时内完成。在尝试本实验操作时，重要的是要牢记：在进行邻近连接实验之前，需先通过免疫荧光染色对目标细胞进行抗体滴定，以精确优化抗体浓度。该技术一经建立，便为细胞生物学领域的研究人员提供了探索瞬时蛋白质-蛋白质相互作用的新途径，而此类相互作用往往难以通过传统的免疫共沉淀或基于FRET的成像等方法进行准确评估，后者常产生技术性假象。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在悬浮细胞培养物中开展邻近连接实验，以原位可视化并定量分析蛋白质-蛋白质相互作用。

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科研

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Biochemistry

生物化学

检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物悬浮细胞培养使用邻近连接测定

本文展示了如何利用邻近连接技术（PLA），结合特异性抗体来可视化固定细胞中骨形态发生蛋白（BMP）信号通路。该技术使我们能够追踪内源性BMP激活的效应复合物在细胞核中的累积，并在BMP4刺激条件下随时间定量其表达水平。...

使用 BMP4 下游信号效应复合物的检测 原位 PLA，一种邻近连接检测技术

本视频介绍了用于研究线虫细胞中原位蛋白质-蛋白质相互作用的邻近连接分析技术。当目标蛋白质彼此靠近时，在连接有二抗的PLA探针的帮助下，可形成环状DNA模板。随后使用扩增溶液对探针进行扩增，产生一条长的单链DNA，再通过检测探针的杂交，实现细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的定位。...

原位蛋白质-蛋白质相互作用研究的邻近连接实验

本视频展示了利用邻近连接实验（Proximity Ligation Assay,...

蛋白质-蛋白质相互作用的检测 果蝇 使用邻近连接实验检测幼虫

本方案演示了如何利用邻近连接技术检测 原位 蛋白质-蛋白质相互作用在 果蝇 幼虫神经肌肉接头。利用该技术，Discs large 和 Hu-li tai shao...

检测 原位 蛋白质-蛋白质复合物在 果蝇 利用邻近连接技术检测幼虫神经肌肉接头

激光常用于研究细胞对DNA损伤的响应。然而，激光产生的损伤位点之间的间距、发生频率及其与复制叉的碰撞情况很少被表征。本文中，我们描述了一种利用激光定点诱导链间交联的方法，可实现对这些参数的测定。...

单分子分析激光定位补骨脂素加合物

本实验方案的目的是定量分析质粒DNA上特定DNA-蛋白质交联的修复情况。将含有损伤的质粒转染至受体哺乳动物细胞系中，并在转染后的多个时间点提取低分子量DNA。通过链特异性引物延伸结合qPCR方法，定量检测DNA修复动力学。...

一种简单、快速且可定量检测转染至哺乳动物细胞质粒上DNA-蛋白质交联修复的实验方法

本文展示了如何利用邻近连接实验（PLA）以高灵敏度在固定细胞中可视化MST1/MST2异源二聚体的形成。...

利用双分子荧光互补技术检测蛋白异构体异源二聚化 原位 邻近连接实验

同源J结构域蛋白与Hsp70分子伴侣协同作用，参与从蛋白质折叠到降解等多种生物学过程。本文介绍了一种原位邻近连接实验方法，可用于在细菌、酵母和人类细胞中监测这些短暂形成的分子伴侣复合物。...

原位监测细菌、酵母和人类细胞中瞬时形成的分子伴侣复合物

D-环捕获（DLC）和D-环延伸（DLE）实验利用邻近连接原理结合定量PCR，用于定量检测酿酒酵母（Saccharomyces...

同源重组中间体的检测 通过 邻近连接与定量 PCR 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

本文介绍一种在DNA损伤位点检测蛋白质相互作用的简单快速方案。...

邻近连接测定法定位DNA损伤位点中的蛋白质

学习使用邻近连接测定法在悬浮细胞培养中检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物。该方法利用BV-173细胞系研究ATM与p53的相互作用，为DNA损伤修复机制提供定量分析。

利用邻位连接技术在悬浮细胞培养物中检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物

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