利用邻位连接技术在悬浮细胞培养物中检测和可视化DNA损伤诱导的蛋白质复合物

本邻近连接实验的总体目标是，在悬浮细胞培养物中诱导 DNA 损伤后，可视化并定量分析 DNA 损伤应答及修复蛋白复合物的形成。该方法有助于解答 DNA 损伤修复领域中的关键问题，例如修复蛋白在时空上的组织与调控机制，以及不同的 DNA 损伤类型如何激活多样的修复通路。该技术的主要优势在于操作相对简便、所需细胞数量少，且无需复杂的处理步骤，从而避免干扰或改变蛋白质-蛋白质相互作用。

尽管该方法可用于研究培养悬浮细胞中的DNA修复和蛋白质复合物形成，但也同样适用于培养的贴壁细胞、冷冻或石蜡包埋组织，甚至整个动物。本研究使用人BCR/ABL阳性B细胞急性淋巴细胞白血病细胞系BV-173，在IMDM培养基中添加补充物，于37°C、5% CO2气氛条件下培养。将细胞以每毫升2×10⁶个的密度接种于6孔板中，每孔5毫升。

为了将细胞阻滞在细胞周期的G1期，向每个孔中加入5 µM的甲磺酸铵，并在37 °C、5% CO2的培养箱中孵育过夜。次日，向其中两个孔中各加入5 µM的ATM抑制剂，并将培养板放回培养箱中孵育30分钟。接着，通过向一个经ATM抑制剂预处理的孔以及一个未经预处理的孔中各加入50 ng/mL的NCS，以诱导DNA损伤。

孵育两小时。在烧杯中，将五克 Fraction-5 BSA 加入 50 毫升 1×PBS 上层，室温静置，不振荡或搅拌，直至 BSA 完全溶解，配制成含 10% BSA 的 1×PBS 溶液。随后将含 10% BSA 的 PBS 溶液缓慢通过 0.22 微米滤膜过滤，并置于冰上保存。

将每个孔中的细胞转移至15毫升离心管中以收获细胞。用预冷的1×BPS缓冲液洗涤细胞两次。计数后，将细胞重悬于1×BPS缓冲液（含10% BSA）中，浓度为每毫升2×10⁶个细胞。

将细胞置于冰上。用无绒布仔细擦拭显微镜载玻片，并将其放入盛有96%乙醇的考普林瓶中脱脂5分钟，以准备本实验所需的载玻片。让载玻片在空气中干燥10分钟。

将显微镜载玻片组装到容量为六毫升的细胞离心涂片漏斗中。通过移液器向每个漏斗中加入50微升1×PBS缓冲液（含10% BSA）对载玻片进行预包被，然后在500 RPM转速下离心1分钟。向每个漏斗中加入100微升细胞悬液，并在500 RPM转速下离心5分钟。

小心拆卸漏斗，切勿触碰载玻片上的点样区域。使用带有5毫米尖端的Pap笔液态阻断剂，在每个点样区域周围画一个圆圈，然后向每个点样区域加入50 µL的4% PFA固定液。

室温下孵育30分钟。30分钟后，在室温下用Coplin瓶中的1×PBS轻柔振荡洗涤细胞，每次5分钟，共洗涤三次。

用无绒布擦拭载玻片上样点周围的区域，并通过倾斜载玻片并用无绒布擦拭，尽可能去除样点中的液体。向每个样点加入 50 µL 含 0.25% Triton X 的 1×PBS 溶液，在室温下静置孵育 10 分钟，不进行振荡。将载玻片置于 Coplin 染色缸中，加入 50 至 60 mL TBS-T 缓冲液，在室温下轻轻振荡洗涤。

每次五分钟，共三次。封闭前，轻敲除去TBS-T，并用无绒纸巾擦干玻片上点样区域周围的液体。尽可能去除点样处的残留液体。

短暂涡旋封闭液，然后向每个点加入约40微升的一滴溶液。将玻片置于预热的湿化 chamber 中，在37摄氏度下孵育一小时。配制抗体混合液。

涡旋后，将商用抗体稀释液用移液器加入各微量离心管中。按1:1000比例加入羊抗ATM抗体，按1:100比例加入兔抗磷酸化丝氨酸-15 p53抗体。

对于单抗体对照实验，配制仅含山羊抗ATM抗体和仅含兔抗p53磷酸化丝氨酸-15抗体的抗体稀释液。完成一小时孵育后，吸去封闭液，注意避免细胞干燥。每孔加入30 µL相应的抗体混合稀释液，在4°C湿盒中孵育过夜。

次日，将载玻片置于Coplin染色缸中，用1X NC2洗涤缓冲液A在室温下轻轻振荡洗涤两次，每次5分钟。载玻片用洗涤缓冲液A洗涤两次后，弃去缓冲液，向每个位点加入30微升邻位连接杂交探针混合液。在预热的湿化孵育盒中37摄氏度孵育1小时。

在室温下，用50至60毫升洗涤缓冲液A在Coplin瓶中轻轻振荡洗涤载玻片。接下来，在冰上配制连接酶溶液，每点加入1微升连接酶至39微升连接反应液中。每点加入40微升连接酶溶液。

在预热的湿化箱中37摄氏度孵育30分钟。在室温下，用Coplin瓶中的洗涤缓冲液A轻轻振荡洗涤载玻片。在冰上配制扩增聚合酶混合液。

首先将扩增用储存液按1:5的比例用水稀释。每个点加入0.5微升聚合酶至39.5微升1X扩增溶液中。轻敲去除洗涤缓冲液，每点加入40微升扩增聚合酶混合液。

在预热的加湿孵育室中37摄氏度孵育100分钟。孵育结束后，从切片上移除扩增聚合酶混合液，并在Coplin染色缸中用1X NC2洗涤缓冲液B洗涤切片，室温下轻轻振荡，每次10分钟，共洗两次。

随后，用 0.01x 洗涤缓冲液 B 清洗载玻片 1 分钟。轻拍去除多余的洗涤缓冲液 B，并用无绒纸巾擦干样品点周围的载玻片表面。尽可能去除样品点中的液体。

通过将含DAPI的封片剂与不含DAPI的封片剂按1:5比例稀释，配制DAPI工作液，以避免细胞核过度染色。取25至30微升稀释后的含DAPI封片剂滴加至24毫米×24毫米的盖玻片上。将载玻片轻轻拾起并倒扣于盖玻片上，施加轻微压力，确保无气泡残留。

用指甲油封固盖玻片，并在成像前至少等待15分钟。最后，使用共聚焦荧光显微镜对玻片进行成像与分析。邻近连接实验用于研究处于G1期阻滞的BV 173人BCR-abl阳性细胞中ATM与磷酸化丝氨酸15位点p53之间的相互作用。

与未用NCS处理以诱导DNA损伤的细胞相比，经NCS处理的大多数细胞在细胞核内出现专一性的点状信号，平均每细胞有七个信号。这表明DNA损伤的诱导导致了ATM与磷酸化丝氨酸15位点p53之间的相互作用。在诱导DNA损伤前，预先用特异性ATM激酶抑制剂处理细胞，可使信号数量减少至平均每细胞两个信号，证实p53在丝氨酸15位点的磷酸化依赖于ATM激酶活性。

单抗体对照实验中，无论是省略抗ATM抗体还是抗p53磷酸化丝氨酸15抗体，均未产生任何信号，符合预期。该图展示了对结果的定量与统计分析，证明并确认了邻近连接实验技术在悬浮细胞培养物的细胞离心涂片中的特异性。若操作得当，在经过一整夜的一抗孵育后，熟练掌握该技术可在约五小时内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要牢记：在开展邻近连接实验之前，应先通过免疫荧光染色对目标细胞进行抗体滴定，以精确优化抗体用量。该技术一经建立，便为细胞生物学领域的研究人员提供了探索瞬时蛋白质-蛋白质相互作用的途径，而这类相互作用往往难以通过传统的免疫共沉淀或基于FRET的成像等标准方法进行准确评估，后者常产生技术性假象。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在悬浮细胞培养物中开展邻近连接实验，以原位可视化并定量分析蛋白质-蛋白质相互作用。