使用果蝇S2细胞进行细胞分裂的活成像

我们的协议可用于确定线粒体过程中的空间和时间动态事件，也可用于实时可视化神秘调节器的影响。使用双色成像可以同时分析两个分子标记。例如，我们可以可视化显微轴的微管和复制染色体的动力学核心结构。

为了诱导荧光蛋白表达，在RNA干扰处理后四天，将诱导的金属蛋白-硫丹宁促进剂转染细胞暴露在最终浓度为500微摩尔硫酸铜的24至36小时。为了准备荧光蛋白表达细胞成像，将细胞转移到无菌的15毫升管中，并在计数后通过离心沉淀细胞。将颗粒重新注入新鲜、25摄氏度加热SIM，辅以10%FBS，每毫升浓度为6个细胞的2倍10，并额外处理500微摩尔硫酸铜。

然后将200至500微升的细胞添加到多井活细胞室的一个井中，并将该室置于倒置的荧光显微镜阶段。当细胞在腔室中沉降时，打开活细胞成像软件，点击新的实验。要插入将拍摄图像的时差循环，请单击时差循环图标。

将间隔设置为秒，并按间隔将所需的总实验长度（以秒为单位）除以以设置周期数。允许循环在所需的总时间段内重复。要插入红外对焦检查以保持目标的焦点，请单击移动 XY 图标并选择 Z 漂移补偿，以在时间推移循环图层中添加 Z 漂移补偿步数。

若要允许采集多通道图像，请单击多通道组图标以添加多通道组图层，然后单击添加 Z 堆栈循环图标以添加 Z 堆栈循环图层。然后设置所需的步进大小和切片数，并将每个通道的曝光率设置为尽可能低，以尽量减少照片漂白。要对细胞分裂进行成像，请选择 40 或 60 倍油浸渍目标，以及 mCherry 荧光通道，然后沿井的顶部或底部对齐目标。

然后离开垂直井分隔线，以避免与 Z 漂移补偿步骤的干扰。在 G2 后期或 M 早期阶段找到单元格，然后单击实时视图按钮，开始在软件屏幕中查看单元格。在 G2 到 M 过渡时找到合适的细胞是成像细胞分裂的关键。

找到一个细胞与一个完整的细胞核和正好两个中体，以获得最佳效果。使用显微镜的精细对焦旋钮，聚焦感兴趣的细胞，然后单击查找偏移量以设置红外对焦检查。单击”开始”启动时间推移成像程序，并选择所需的通道并调整平均像素强度，以根据需要调整直方图，以清楚地显示感兴趣的单元格。

在15到20分钟后检查细胞，确认核包络已经发生，由细胞中心附近的圆形暗折射点消失所决定。再过15到20分钟，检查以确定是否出现期炎发作。然后停止程序并保存文件。

要确定核包络分解到肛门开始时间，请单击帧向上按钮，确定核包络分解的时间和初始染色体分离的时间（以分钟为单位），并减去从启动时间到特定细胞的核包络分解到阿不来提时的时间。然后继续扫描预分割单元，从初始建立开始，获取给定条件的多个端，最多 12 小时。即将分裂的细胞可以由两个中心体和一个完整的核的存在作为目标，如折射光和细胞内的暗点在α管状通道中查看时所示。

核包络分解可以通过这个暗点消失来可视化，导致细胞质的均匀着色。核包络分解后，每个细胞形成主轴和到国会的时间，通过记录这些事件相对于核包络分解的时间点来测量染色体。双滞留RNA的治疗针对短停，一种疑似影响细胞周期动力学的蛋白微管交联蛋白，可产生显著的显微托因延迟。

这种治疗导致显著延迟，许多细胞在元相停止，在整个两到三个小时的成像实验中从未过渡到肛分。与双链RNA对射枪和粗糙处理进行联合处理，这是该检查点的一个重要组成部分，导致抑制逮捕表型，导致核包络分解到与受控、未经治疗的细胞类似的厌氧时间。请务必选择合适的细胞，不要浪费时间对不开始分裂的细胞进行成像。

如果单元格在 20 分钟内没有开始分裂，请查找另一个单元格。研究人员可以遵循这个程序来帮助识别新的神秘调节剂，或者可能新的干化合物，影响细胞分裂中的特定事件。