Name: 多分析物生物芯片（MAB），基于全固态离子选择性电极（ASSISE）的生理研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-18T08:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学习全固态离子选择性电极的制备与校准方法，用于电化学生物技术研究。该方法采用导电聚合物转导层和离子选择性膜，可在复杂生物介质中长期稳定运行，实现离子活性的实时无损检测。

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我们感谢美国国家航空航天局天体生物学科学与技术仪器开发（ASTID）项目提供的资金支持（资助编号：103498 和 103692），感谢普渡大学比尔克纳米技术中心的 Gale Lockwood 对 MAB 装置进行的引线键合，以及感谢 Joon Hyeong Park 提供的流动池腔室的 CAD 图纸。

1. 用于 H+ 和 CO32- 离子的聚(3,4-乙烯二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸钠) (PEDOT:PSS) 电聚合溶液的制备
<ol>
	<li>将 70 mg 聚（苯乙烯磺酸钠）(Na+PSS-) 加入 10 ml 去离子水（DI 水）中，涡旋振荡至完全分散（约 10 秒）。</li>
	<li>向步骤 1.1 的溶液中加入 10.7 μl 3,4-乙烯二氧噻吩（EDOT），涡旋振荡至溶液完全混合。</li>
</ol>
2. 用于 Ca2+ 离子的聚(3,4-乙烯二氧噻吩):硫酸钙（PEDOT:CaSO4）电聚合溶液的制备
<ol>
	<li>将136 mg硫酸钙（CaSO4）加入10 ml去离子水中，涡旋混匀；溶液不会完全分散，呈乳白色。</li>
	<li>向步骤2.1中的溶液中加入10.7 μl EDOT，涡旋至完全混合。</li>
</ol>
3. 基于PEDOT的导电聚合物的电聚合
<ol>
	<li>使用Bioanalytical Systems Inc. (BASI) C3细胞支架（图3）和EC epsilon恒电位仪/恒电流仪构建用于电聚合的电化学池。将EDOT:PSS电聚合溶液置于电化学池中，并通入氮气20分钟以去除溶解氧。</li>
	<li>将铂丝网电极夹在电化学池的对电极位置。然后将MAB夹在电化学池的工作电极位置，使工作电极面向铂丝网。调节MAB的深度，确保只有圆形电极浸入PEDOT:PSS电聚合溶液中，避免溶液接触方形电极引线焊盘。</li>
	<li>将BASI饱和甘汞/氯化银（Ag/AgCl）电极置于电化学池的参比电极位置。确保参比电极不位于工作电极与对电极之间。</li>
	<li>对于PEDOT:PSS沉积：向电化学池中通氮气20分钟，使用EC epsilon恒电位仪/恒电流仪在±100 μA量程下进行单次循环伏安扫描，扫描范围为0 V至1.1 V，扫描速率为20 mV/sec。</li>
	<li>对于PEDOT:CaSO4 沉积：向电化学池中通氮气20分钟，使用EC epsilon恒电位仪/恒电流仪在814 nA电流下进行30分钟的计时电位法沉积。</li>
</ol>
4. 基于PEDOT的聚合物共轭物在K3Fe(CN)6中的循环伏安法
<ol>
	<li>执行上述步骤 3.1–3.3。</li>
	<li>使用 EC epsilon 恒电位仪/恒电流仪，在 ±10 μA 量程下，对样品进行单次循环伏安扫描，扫描范围为 -653 mV 至 853 mV，扫描速率分别为 (25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200) mV/sec。</li>
</ol>
5. 表面功能化方案
<ol>
	<li>按照步骤3的方法，沉积针对目标离子的导电聚合物共轭物。</li>
	<li>按照步骤6的方法，涂覆离子选择性膜。</li>
</ol>
6. 离子选择性膜的应用
<ol>
	<li>将MAB置于真空旋转涂布夹头上居中。</li>
	<li>在MAB中心滴加100 μl膜溶液，然后运行。</li>
	<li>使用旋涂仪以1,500 rpm转速旋涂离子选择性膜30秒，升速和降速时间各为5秒。</li>
	<li>将旋涂后的MAB抽真空30分钟，并在70 °C烘箱中烘烤20分钟。</li>
</ol>
7. PEDOT-PSS 导电聚合物共轭物与 pH 及碳酸根（CO32-）离子选择性膜的校准
<ol>
	<li>将 MAB 缓冲液在 10 μM 碳酸氢钠（NaHCO₃）中过夜孵育3) 以及在藻类培养基中添加 5 mM 氯化钾（KCl）。</li>
	<li>将MAB插入微流控流动池芯片支架中。</li>
	<li>注入5 ml测试溶液，初始pH值或浓度（例如 pH 4 或 CO 的 10 μM32-去除流路池芯片支架中的气泡。</li>
	<li>将流动池芯片支架放置到流动池电学夹具上。</li>
	<li>打开 EC epsilon 软件，进入开路电位（OP）模式。设置时间为 300 min，电压范围为 ± 1 V，截止频率为 10 kHz，每 2 秒记录一次数值。</li>
	<li>在继续校准过程之前，让MAB稳定（观察是否出现平稳的直线）。</li>
	<li>一旦MAB稳定后，用测试溶液冲洗流通池，并注入下一个待校准浓度（pH 5或25 μM CO32-）。确保无气泡进入流通池。针对pH 6、7、8和9或CO32- 50、75、100、250、500、750 和 1,000 μM 浓度</li>
	<li>最后一次浓缩完成后，移除MAB并用氮气吹干。</li>
	<li>下次使用前，将MAB放回新鲜的预处理溶液中保存。</li>
</ol>
8. PEDOT:CaSO4 导电聚合物共轭物在 CaCl2 中的校准
<ol>
	<li>将MAB在7 ml含有0.1 M CaCl2和10 μM NaNO3的溶液中过夜孵育。</li>
	<li>执行与步骤7.2–7.10类似的步骤。在步骤8.3中，用初始浓度为0.01 mM的CaCl2替代碳酸盐测试溶液。依次重复测试溶液浓度为0.05、0.1、0.5、1和10 mM的情况。</li>
</ol>

<ol><li>Migdalski, J., Bas, B., Blaz, T., Golimowski, J., Lewenstam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Miniaturized+and+Integrated+Galvanic+Cell+for+the+Potentiometric+Measurement+of+Ions+in+Biological+Liquids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Solid+State+Electrochem%22%5BJournal%5D)">A Miniaturized and Integrated Galvanic Cell for the Potentiometric Measurement of Ions in Biological Liquids.</a> J. Solid State Electrochem. 13, 149-155 (2009).</li>
<li>Designing a Water-quality Monitor with Ion-selective-electrodes. Buehler, M. G., Kounaves, S. P., Martin, D. P. Proceedings of the IEEE Aerospace Conference, 1, 331-338 (2001).</li>
<li>Adamchuk, V. I., Lund, E. D., Sethuramasamyraja, B., Morgan, M. T., Doberman, A., Marx, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Measurement+of+Soil+Chemical+Properties+on-the-go+using+Ion-selective-electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Computers+and+Electronics+in+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Direct Measurement of Soil Chemical Properties on-the-go using Ion-selective-electrodes.</a> Journal Computers and Electronics in Agriculture. 48 (3), 272-294 (2005).</li>
<li>Oelβner, W., Hermann, S., Kaden, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+Sensors+and+Sensor+Module+for+Studying+Biological+Systems+in+Space+Vehicles%5BTitle%5D)+AND+%22Aerospace+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Electrochemical Sensors and Sensor Module for Studying Biological Systems in Space Vehicles.</a> Aerospace Science and Technology. 1, 291-296 (1997).</li>
<li>Bobacka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conducting+Polymer-based+Solid-state+Ion-selective+Electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Electroanalysis%22%5BJournal%5D)">Conducting Polymer-based Solid-state Ion-selective Electrodes.</a> Electroanalysis. 18 (1), 7-18 (2006).</li>
<li>Buck, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuck%2C+R+%22Ion+Selective+Electrodes+in+Analytical+Chemistry%22">Ion Selective Electrodes in Analytical Chemistry</a>. , Plenum Press. New York. (1980).</li>
<li>Nam, H., Cha, G. S. Chapter 18. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNam%2C+H+%22Biosensors+and+their+Applications%22">Biosensors and their Applications</a>. Yang, V. C., Ngo, T. T. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. N.Y. (2000).</li>
<li>Anatova-Ivanova, S., Mattinen, U., Radu, A., Bobacka, J., Lewenstem, A., Migdalski, J., Danielewski, M., Diamond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Miniature+All-solid-state+Potentiometric+Sensing+System%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%22%5BJournal%5D)">Development of Miniature All-solid-state Potentiometric Sensing System.</a> Sensors and Actuators B. 146, 199-205 (2010).</li>
<li>Michalska, A., Galuszkiewicz, A., Ogonowska, M., Ocypa, M., Maksymiuk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEDOT+Films%3A+Multifunctional+Membranes+for+Electrochemical+Ion+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Solid+State+Electrochem%22%5BJournal%5D)">PEDOT Films: Multifunctional Membranes for Electrochemical Ion sensing.</a> J. Solid State Electrochem. 8, 381-389 (2004).</li>
<li>Bard, A. J., Faulkner, L. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBard%2C+AJ+%22Electrochemical+Methods%3A+Fundamentals+and+Applications%22">Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications</a>. ed, 2nd , 2nd ed, Wiley. New York. (2000).</li>
<li>Claussen, J. C., Artiles, M. S., McLamore, E. S., Mohanty, S., Shi, J., Rickus, J., Fisher, T. S., Porterfield, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+Glutamate+Biosensing+with+Naanocube+and+Nanosphere+Augmented+Single-walled+Carbon+Nanotube+Networks%3A+A+Comparative+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrochemical Glutamate Biosensing with Naanocube and Nanosphere Augmented Single-walled Carbon Nanotube Networks: A Comparative Study.</a> J. Mater. Chem. 21, 11224-11231 (2011).</li>
<li>Bobacka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+Stability+of+All-solid-state+Ion-selective+Electrodes+using+Conducting+Polymers+as+Ion-to-electron+Transducers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Potential Stability of All-solid-state Ion-selective Electrodes using Conducting Polymers as Ion-to-electron Transducers.</a> Anal. Chem. 71, 4932-4937 (1999).</li>
<li>Lee, J. H., Yoon, I. J., Yoo, C. L., Pyun, H. J., Cha, G. S., Nam, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiometric+Evaluation+of+Solvent+Polymeric+Carbonate-selective+Membranes+based+on+Molecular+Tweezer-type+Neutral+Carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Potentiometric Evaluation of Solvent Polymeric Carbonate-selective Membranes based on Molecular Tweezer-type Neutral Carriers.</a> Anal. Chem. 72, 4694-4699 (2000).</li>
<li>Song, F., Ha, J., Park, B., Kwak, T. H., Kim, I. T., Nam, H., Cha, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-solid-state+Carbonate+Selective+Electrode+based+on+a+Molecular+Tweezer-type+Neutral+Carrier+with+Solvent-soluble+Conducting+Polymer+Solid+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">All-solid-state Carbonate Selective Electrode based on a Molecular Tweezer-type Neutral Carrier with Solvent-soluble Conducting Polymer Solid Contact.</a> Talanta. 57, 263-270 (2002).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

MAB 生物芯片由 ASSISE 构成，该结构是在铂电极上，以基于 PEDOT 的共轭聚合物（CP）转导层为基底，其上构建离子选择性膜（ISM）而形成的。该组合结构可将目标离子浓度转化为可测量的电信号。稳定的电极电位由 CP 层和 ISM 层共同决定。这两个层还决定了 MAB 的工作寿命以及所测电信号的质量（噪声、漂移）。
PEDOT 因其离子和电子特性（在其氧化形式下）而成为一种特别有吸引力的转导层。PEDOT 具有高氧化还原电容，可最大限度地减少导电电极的极化效应；我们测得其相对于 Ag/AgCl 的稳定氧化还原电位为 153 mV ± 6。这一特性对于使用固态内接触的离子选择性电极（ISE）的电位稳定性至关重要12。PEDOT:PSS 共轭聚合物被用作小的一价阳离子（例如 H+）和二价阴离子（例如 CO32-）的转导材料。碳酸根选择性电极的非线性斜率曲线源于其对 pH 的依赖性。在微藻测量中，必须同时对 H+ 和 CO3<...

<table><tbody><tr><td>3,4-乙烯二氧噻吩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>483028</td><td></td></tr><tr><td>聚（苯乙烯磺酸钠）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>243051</td><td></td></tr><tr><td>EC epsilon 恒电流仪/恒电位仪</td><td>Bioanalytical Systems Inc.</td><td>e2P</td><td></td></tr><tr><td>饱和 Ag/AgCl 参比电极</td><td>Bioanalytical Systems Inc.</td><td>MF-2052</td><td></td></tr><tr><td>铂网</td><td>Alfa Aesar</td><td>10283</td><td></td></tr><tr><td>铁氰化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>硝酸钾</td><td>J.T. Baker</td><td>3190-01</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Mallinckrodt/ Macron</td><td>7412-12</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-7127</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>硫酸钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237132</td><td></td></tr><tr><td>C3 电极支架</td><td>Bioanalytical Systems Inc.</td><td>EF-1085</td><td></td></tr><tr><td>流动池芯片夹具</td><td></td><td></td><td>定制，由美国宇航局艾姆斯研究中心提供</td></tr><tr><td>流动池电学连接装置</td><td></td><td></td><td>定制，由美国宇航局艾姆斯研究中心提供</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表2. 特定试剂与设备。&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

基于全固态离子选择性电极的多分析物生物芯片在生理学研究中的应用

Multi-analyte Biochip (MAB) Based on All-solid-state Ion-selective Electrodes (ASSISE) for Physiological Research

在环境、生物医学、农业、生物学以及航天飞行研究中，芯片实验室（lab-on-a-chip, LOC）应用需要一种能够在复杂的生物介质中长期储存的离子选择性电极（ion-selective electrode, ISE）1-4。全固态离子选择性电极（all-solid-state ion-selective electrode, ASSISE）在上述应用中尤其具有吸引力。理想的电极应具备以下优点：易于构建、维护成本低，并具备微型化潜力，从而支持批量加工。本研究构建了一种用于定量检测 H+、Ca2+ 和 CO32- 离子的微加工 ASSISE。该电极由贵金属电极层（即 Pt）、转导层和离子选择性膜（ISM）层组成。其中，转导层的作用是将离子选择性膜的浓度依赖性化学势转化为可测量的电信号。
发现ASSISE的寿命取决于导电层/膜界面电位的维持5-7。为了延长ASSISE的工作寿命，从而在界面层保持稳定的电位，我们采用导电聚合物（CP）聚（3,4-乙烯二氧噻吩）（PEDOT）7-9替代氯化银/银（Ag/AgCl）作为换能层。我们将ASSISE构建成芯片实验室格式，并将其称为多分析物生物芯片（MAB）（图1）。
在测试溶液中的校准结果表明，微生物杂交传感器（MAB）能够监测 pH（工作范围 pH 4–9）、CO32-（检测范围 0.01 mM – 1 mM）和 Ca2+（对数线性范围 0.01 mM 至 1 mM）。MAB 的 pH 传感器在藻类培养基中储存近一个月后，仍表现出接近能斯特响应的斜率。碳酸根生物芯片的电位响应曲线与传统离子选择性电极相似。生理学测量被用于监测模式系统——小球藻（Chlorella vulgaris）的生物活性。
微阵列生物传感器在体积、多功能性和多重分析物检测能力方面具有优势，因此适用于地球或太空中的许多受限环境监测场景。
生物芯片设计与实验方法
该生物芯片尺寸为10 × 11 mm，包含9个被指定为工作电极（WE）的ASSISE单元和5个Ag/AgCl参比电极（RE）。每个工作电极（WE）直径为240 μm，与直径为480 μm的参比电极（RE）间距均为1.4 mm。这些电极连接至尺寸为0.5 mm × 0.5 mm的电学接触焊盘。示意图见图2。
采用循环伏安法（CV）和恒电流沉积方法，在Bioanalytical Systems Inc.（BASI）C3电解池装置上进行PEDOT薄膜的电化学聚合（图3）。PEDOT薄膜的对离子根据目标分析离子的种类进行选择。对于H+和CO32-，采用以聚苯乙烯磺酸根为对离子的PEDOT（PEDOT/PSS）；而对于Ca2+，则使用以硫酸根为对离子的PEDOT（硫酸根以CaSO4形式加入溶液中）。通过在氧化还原活性溶液（即 2 mM 铁氰化钾（K3Fe(CN)6））中进行CV测试，分析PEDOT修饰的工作电极（WE）的电化学性能。根据CV曲线，采用Randles-Sevcik分析法计算有效表面积10。在MAB工作电极（WEs）上，通过以1,500 rpm转速旋涂，制备厚度约为2 μm的离子选择性膜（ISM）。
微藻生物传感器（MAB）置于充满150 μl藻类培养基的微流控流动池室中；其接触电极与BASI系统电连接（图4）。在环境光照和黑暗条件下监测Chlorella vulgaris的光合作用活性。

PEDOT:PSS 的循环伏安图（CV）结果示例及其相应的阴极峰电流（ip）与扫描速率（v1/2）的关系分别如图5a和图5b所示。PEDOT:CaSO4 在不同扫描速率下的循环伏安图及其阴极峰电流未予展示。通过 Randles-Sevcik 分析10，测得无离子选择性膜的固态接触 PEDOT:PSS 和 PEDOT:CaSO4 的有效表面积分别为 4.4 × 10-11 cm2 和 5.8 × 10-11 cm2。由于本研究所用电极尺寸约为本课题组先前报道电极尺寸的 1/130，因此这些数值相较于以往报道的电极较小11。需注意，MAB 电极的有效表面积可通过纳米材料修饰表面而得到提升11。
在藻类培养基中储存20天后，基于PEDOT:PSS聚...

由导电聚合物（CP）换能器构建的全固态离子选择性电极（ASSISEs）在液体介质中可提供数月的功能寿命。本文介绍了在芯片实验室格式中制备和校准ASSISEs的过程。实验表明，该ASSISE在复杂生物介质中长期储存后，仍能保持接近能斯特响应的斜率特性。

用于环境、生物医学、农业、生物学及航天研究的芯片实验室（LOC）应用需要一种离子选择性电极（ISE）……

本实验的总体目标是制备一种可同时检测阳离子和阴离子的全固态离子选择性电极。首先，在工作电极上电聚合一层导电聚合物换能层；随后，在MAB上旋涂一层离子选择性膜，并将生物芯片在溶液中过夜孵育以活化离子选择性膜。接着，将芯片置于流动池腔室中，将电极引线连接至三电极体系的电化学工作站，并将测量溶液注入腔室中进行检测。去除不需要的气泡后，最终可对MAB芯片进行针对目标离子的校准，并实时记录MAB的输出信号。与传统的微电极和放射性标记探针技术不同，全固态离子选择性电极具有非侵入性，且可实现多重检测，用于实时测量离子活性，并模拟生物和生理系统。我们最初是在参与天体生物学研究时提出该方法的设想，该研究要求在有限空间内进行生理测量。在波本树叶生理传感实验室攻读学位的研究生June Hume Park将协助我进行电化学聚合电极的制备。使用Bassi C3电解池支架和EC epsilon电位仪/恒电位仪。将电化学聚合溶液放入电解池中，然后通入氮气20分钟，以除去溶解的氧气。现在将铂网对电极夹在电化学池的对电极位置。然后将MAB夹在电化学池的工作电极位置或中心位置，使工作电极面向铂网，调节MAB的浸入深度，确保只有圆形电极浸没在电聚合溶液中，避免溶液接触方形电极接触焊盘。接下来，将一个饱和甘汞电极置于电化学池的参比电极位置。确保参比电极不与工作电极和对电极接触。然后使用 EC epsilon 电位仪（Galvanostat），在±100 微安量程下，以 20 毫伏/秒的扫描速率，从 0 扫描至 1.1 伏特，进行一次单循环伏安扫描。进行钙离子检测时，在MAB气泡上进行PDO硫酸钙沉积，加入硫酸钙溶液反应20分钟。为表征Pdot表面，采用基于Pdot聚合物偶联物的循环遥测技术。在2毫摩尔氰化钾溶液中，以±10微安每伏为量程，在-653毫伏至853毫伏范围内进行单循环伏安扫描，扫描速率可变。将多分析物生物芯片置于真空旋转夹具中心，将100微升膜溶液滴加至MAB中心后开始测量。随后，在1500转/分钟条件下旋涂离子选择性膜30秒，升速和降速时间均为5秒，旋涂后将MAB在真空条件下放置30分钟。然后将芯片置于70摄氏度烘箱中烘烤20分钟。在藻类培养基中，用10 µM碳酸氢钠和5 mM氯化钾对MAB进行过夜预处理。现在将MAB插入微流控流动池芯片支架中。注入5 mL具有适当初始pH值或浓度的测试溶液。清除流动池芯片支架中的所有气泡，并将流动池芯片支架放置到流动池电学夹具上。接着，打开 EC epsilon 软件并进入开路电位模式。将时间设置为 300 分钟，电压范围设为正负 1 伏，截止频率设为 10 千赫兹，并设置每 2 秒记录一次数值。在继续校准过程之前，先让MAB稳定。然后用测试溶液冲洗流通池，并注入下一个待校准的浓度。确保无气泡进入流通池。在最后一次运行后，对校准曲线的剩余样品重复进

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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