基于全固态离子选择性电极的多分析物生物芯片在生理学研究中的应用

本实验的总体目标是制备一种可同时检测阳离子和阴离子的全固态离子选择性电极。首先，在工作电极上电聚合一层导电聚合物换能层；随后，在MAB上旋涂一层离子选择性膜，并将生物芯片在溶液中过夜孵育以活化离子选择性膜。接着，将芯片置于流动池腔室中，将电极引线连接至三电极体系的电化学工作站，并将测量溶液注入腔室中进行检测。

去除不需要的气泡后，最终可对MAB芯片进行针对目标离子的校准，并实时记录MAB的输出信号。与传统的微电极和放射性标记探针技术不同，全固态离子选择性电极具有非侵入性，且可实现多重检测，用于实时测量离子活性，并模拟生物和生理系统。我们最初是在参与天体生物学研究时提出该方法的设想，该研究要求在有限空间内进行生理测量。

在波本树叶生理传感实验室攻读学位的研究生June Hume Park将协助我进行电化学聚合电极的制备。使用Bassi C3电解池支架和EC epsilon电位仪/恒电位仪。将电化学聚合溶液放入电解池中，然后通入氮气20分钟，以除去溶解的氧气。

现在将铂网对电极夹在电化学池的对电极位置。然后将MAB夹在电化学池的工作电极位置或中心位置，使工作电极面向铂网，调节MAB的浸入深度，确保只有圆形电极浸没在电聚合溶液中，避免溶液接触方形电极接触焊盘。

接下来，将一个饱和甘汞电极置于电化学池的参比电极位置。确保参比电极不与工作电极和对电极接触。然后使用 EC epsilon 电位仪（Galvanostat），在±100 微安量程下，以 20 毫伏/秒的扫描速率，从 0 扫描至 1.1 伏特，进行一次单循环伏安扫描。

进行钙离子检测时，在MAB气泡上进行PDO硫酸钙沉积，加入硫酸钙溶液反应20分钟。为表征Pdot表面，采用基于Pdot聚合物偶联物的循环遥测技术。

在2毫摩尔氰化钾溶液中，以±10微安每伏为量程，在-653毫伏至853毫伏范围内进行单循环伏安扫描，扫描速率可变。将多分析物生物芯片置于真空旋转夹具中心，将100微升膜溶液滴加至MAB中心后开始测量。随后，在1500转/分钟条件下旋涂离子选择性膜30秒，升速和降速时间均为5秒，旋涂后将MAB在真空条件下放置30分钟。然后将芯片置于70摄氏度烘箱中烘烤20分钟。

在藻类培养基中，用10 µM碳酸氢钠和5 mM氯化钾对MAB进行过夜预处理。现在将MAB插入微流控流动池芯片支架中。注入5 mL具有适当初始pH值或浓度的测试溶液。

清除流动池芯片支架中的所有气泡，并将流动池芯片支架放置到流动池电学夹具上。接着，打开 EC epsilon 软件并进入开路电位模式。将时间设置为 300 分钟，电压范围设为正负 1 伏，截止频率设为 10 千赫兹，并设置每 2 秒记录一次数值。

在继续校准过程之前，先让MAB稳定。然后用测试溶液冲洗流通池，并注入下一个待校准的浓度。确保无气泡进入流通池。

在最后一次运行后，对校准曲线的剩余样品重复进行测量。取出分子天平装置（MAB）并用氮气吹干。将分子天平装置（MAB）重新放入新鲜的 conditioning 溶液中，直至下次使用。

使用 MAB 和氯化钙对 MAB 进行校准，条件为：在 0.1 摩尔氯化钙和 10 微摩尔硝酸钠中，用含 pdot 聚合物共轭物和钙选择性膜的 MAB 溶液浸泡过夜。然后将 pH 或碳酸盐测试溶液替换为初始浓度为 0.01 毫摩尔氯化钙的溶液。对其他测试溶液浓度重复该步骤。

这些数据展示了聚(3,4-乙烯二氧噻吩)聚苯乙烯磺酸盐（PEDOT:PSS）的循环伏安图及其相应的阴极峰电流随扫描速率的变化情况。Randall 的次级分析确定了无离子选择性膜的固态接触层有效表面积为 4.4 × 10⁻¹¹ cm²。作为对全固态离子选择性电极（ISE）在真实细胞培养环境中获取测量数据能力的测试。

在Lgal培养基中储存20天后，使用pH值范围为4至9的Lgal培养基对ISEs进行校准。此处，PDO PSS在碳酸盐溶液中进行校准，浓度范围为0.01毫摩尔至1毫摩尔，分别在Lgal生物培养基以及pH 8.5缓冲的Lgal生物培养基中进行。注意缓冲溶液中浓度变化伴随斜率降低的现象。

碳酸根选择性电极具有pH依赖性，电压的升高与碳酸根离子浓度的增加呈正相关。由于测量在pH 7.8条件下进行，大多数碳酸根物种以碳酸氢根形式存在。在环境光照和黑暗条件下，利用生物模型小球藻（Chlorella vulgaris）进行的碳酸根浓度测量显示有30毫伏的变化；而仅含藻类培养基的对照组无响应，表明生物芯片功能正常。这些MAB离子选择性电极基于PPSS在氯化钙溶液中的响应，随着钙离子浓度增加，对二价阳离子呈现出接近能斯特斜率的响应特性，约为每数量级30毫伏。

通过检测钙离子浓度的变化来测定蕨类植物萌发过程中的钙电流水平。该方法在生物学、农业和医学领域具有应用价值，可用于研究涉及离子转运、细胞电生理与信号传导以及动植物系统的生物分子机制。