EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

이 절차의 전반적인 목표는 multi back baula virus 곤충 세포 시스템을 사용하여 단백질 복합체를 생산하는 것입니다. 이것은 먼저 다중 유전자 구조를 생성하여 선택한 단백질 복합체를 암호화함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 박테리아 세포를 형질전환하고 올바른 back mids를 스크리닝하여 다중 유전자 구조를 포함하는 복합 baula 바이러스를 만드는 것입니다.

다음으로, baula 바이러스 게놈을 분리하고 단백질 생산을 테스트한 후 6개의 웰 플레이트에서 소규모로 곤충 세포를 감염시키는 데 사용합니다. 선택되는 단백질 복합물은 더 큰 규모로 발현되고 정제됩니다. 궁극적으로 정제된 단백질 복합체는 구조와 기능을 발견하고 잠재적으로 약물 발견에 사용됩니다.

기존 에코바이러스 시스템에 비해 이 기술의 주요 장점은 두 가지입니다. MultiPro 콤플렉스는 전례가 없는 방식으로 생산될 수 있습니다. 또한, 최적의 단백질 생산을 위해 에코바이러스를 설계하기 때문에 생산된 물질의 품질이 훨씬 더 우수합니다.

이 기술의 의미는 기본적인 생물학적 질문을 훨씬 뛰어넘습니다. 당사의 멀티백 플랫폼은 다양한 질병에 대한 유망한 새로운 백신 후보 단백질을 생산하고 종양 성장을 유발하는 주요 단백질 어셈블리를 생산하여 암 연구를 촉진하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 프로세스와 불임의 필요성으로 인해 약간 어려움을 겪을 것입니다.

따라서 우리는 비전문가 사용자가 가능한 한 쉽게 멀티뱅크를 적용할 수 있도록 표준 운영 절차를 수립하기 위해 매우 열심히 노력했습니다. 이 방법의 시각적 시연은 프로세스가 동작으로 표시될 때 로봇 단계를 훨씬 더 쉽게 이해할 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 이것은 아무리 상세하더라도 기록되어 있는 프로토콜을 보는 것만으로는 추출할 수 없습니다.

이 절차를 시작하기 전에 공동 표현 전략을 신중하게 계획하는 것이 중요합니다. 먼저 실험을 시뮬레이션하는 것이 좋습니다. 인실리코.

유전자는 수용체와 공여자 플라스미드에 분포되어야 합니다. 가장 효과적인 것은 생리학적 하위 모듈을 형성할 수 있는 하위 단위를 그룹화하는 것입니다. 큰 복합체는 많은 단백질 소단위를 가지고 있기 때문에 많은 유전자가 동시에 발현되어야 합니다.

멀티백 시스템은 크리어 재조합효소에 의해 인식되는 락 P라고 하는 짧은 DNA 염기서열을 포함하는 작은 DNA 전구 분자에 유전자를 배치하기 위해 자동화된 루틴을 사용하여 유전자 복제를 크게 단순화합니다. 그런 다음 이러한 전구 세포는 lox P 부위가 있는 모든 것을 하나의 큰 DNA 플라스미드로 결합하는 pre recombinase를 추가하여 1단계 반응으로 결합됩니다. 이 다중 유전자 구조는 이후에 다중 후방 불라 바이러스 게놈에 삽입됩니다.

많은 수의 구조를 생성해야 하는 경우 로봇 스크립트와 액체 처리 워크스테이션을 사용하는 것이 좋습니다. 워크스테이션에는 미니 준비 및 PCR 세척을 위한 진공, PCR 샘플의 자동 로딩을 위한 EEL이 장착되어 있습니다. PCR 및 배양 단계를 위한 열순환기, 부유 세포 및 저온 블록을 재생하기 위한 셰이커.

효소의 경우, 관심 유전자는 제한 효소 및 리가아제를 사용하여 선택된 공여자 및 수용자에 삽입되거나 또는 결찰 독립적 방법을 사용하여 제한 매핑 및 염기서열분석에 의해 복제된 모든 공여자 및 수용체 구조를 검증합니다. CRE LAX P 재조합에 의한 확산 공여체 수용체 조합을 진행하여 선택한 다중 유전자 발현 구조를 생성합니다. 조립된 다중 유전자 구조는 특별히 설계된 프라이머 세트를 사용한 분석적 PCR 반응에 의해 검증됩니다.

로봇 보조 TR 프로세스의 스냅샷이 여기에 나와 있습니다. 여기에는 멀티웰 플레이트에서 PCR 반응 준비, 템플릿 DNA 및 프라이머 제공, DNA의 PCR 증폭 및 멀티웰 플레이트에서 알칼리 용해에 의해 박테리아 배양에서 성장한 다중 유전자 구조체 준비가 포함됩니다. 이 절차를 시작하려면 바이러스 게놈과 TN 7 전위에 필요한 기능을 품고 DH 10 세포로 형질전환하여 다중 유전자 전달 벡터를 다중 불라 바이러스 게놈에 통합합니다.

TN 후, 관심 유전자를 포함하는 복합 baula 바이러스를 가진 7개의 전위 세포를 청백색 스크리닝에 의해 선택하고 TN 7 전치가 성공하면 베타 갈락토의 알파 보체가 손실됩니다. 따라서 올바른 TN 7 전치가 있는 콜로니는 xal을 포함하는 선택적 APL에서 흰색으로 유지됩니다. 백색 콜로니에서 박테리아 배양을 준비하고 알칼리 용해 및 에탄올 이소프로판올 침전으로 backin을 분리합니다.

다음으로, 멸균 후드에서 작동하는 정제된 bao 바이러스 게놈으로 곤충 세포를 transfection하고, 6개의 웰 조직 배양 플레이트에서 로그 상 SF 21 곤충 세포의 종자 분취액을 주입합니다. 각각에 정제된 bao 바이러스 게놈과 배양 배지에 혼합된 형질주입 시약을 잘 첨가합니다. 형질주입된 세포를 섭씨 27도에서 48-60시간 동안 움직임 없이 배양합니다.

48-60 시간 후, 배지를 제거하여 초기 바이러스 또는 V zero를 수확하고 신선한 배지로 보충하고 2-3 일 후에 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 놓고 단백질 생산을 테스트합니다. YFP 마커가 있는 경우 바이러스 증폭을 위한 형광을 테스트합니다. 초기 바이러스인 V zero를 사용하여 안와 플랫폼에서 교반된 작은 삼각 셰이커 플라스크에서 로그 단계에서 25-50밀리리터의 세포를 감염시킵니다.

셰이커는 세포를 계수하고 두 배가 멈출 때까지 24시간마다 세포를 분할합니다. 감염의 다양성이 낮거나 MOI 요법을 따르는 경우, 세포는 적어도 한 번은 두 배로 늘어야 하며, 그렇지 않으면 더 적은 부피의 V zero를 추가하여 실험을 반복합니다. 왼쪽 이미지는 multi back baula 바이러스에 감염된 후 감염되지 않은 곤충 세포를 보여줍니다.

감염된 곤충 세포는 증식을 멈추고 오른쪽 이미지에서 볼 수 있듯이 크기가 커졌습니다. 48-60시간 후 세포를 펠릿화하여 V one 바이러스를 수확합니다. 바이러스가 들어 있는 미디어를 제거하고 보관하십시오.

Resus는 새로운 배지로 세포를 현탁시키고 이를 삼각 플라스크로 다시 옮깁니다. 펠렛화로 12시간 또는 24시간마다 6개의 세포를 1회 1회 제거하고 더 큰 발현 부피가 필요한 경우 단백질 생산 및 마커 단백질 신호를 테스트합니다. 2리터 셰이커 플라스크에 있는 최대 400ml의 세포를 V one 바이러스로 감염시켜 바이러스를 더욱 증폭시킵니다.

낮은 MOI 요법에 따라, 재조합 바이러스의 변형을 방지하고 높은 발현 수준을 유지하기 위해 V-one 바이러스를 생산 바이러스로 저장하기 위해 ular 바이러스에 감염된 곤충 세포 또는 VIC 방법을 사용하여 저장할 것을 강력히 권장합니다.증식 정지 후 24 시간 후에 펠릿 감염 세포가 관찰됩니다. 이 단계에서 세포는 배지로 방출되기 직전에 완전한 바이러스 입자를 포함합니다.

세포 펠렛을 동결 용액에 재현탁하고, 단백질 생산 실행을 위해 극저온 튜브에서 BIIC를 동결합니다. V 1, V V 2 또는 냉동 BIC 부분 표본을 사용하여 더 큰 세포 배양을 감염시킬 수 있습니다. 일반적으로 2리터 플라스크에 담긴 400밀리리터는 낮은 MOI 요법을 따릅니다.

감염된 배양이 한 번 이상 두 배가 되도록 감염에 사용되는 바이러스 양을 조정합니다. YFP 마커 단백질이 존재하는 경우, 정의된 간격으로 6개의 세포로 10회 1회 회수하고, 세포를 초음파 처리 및 원심분리하고, 96웰 플레이트로 이동하여 형광 신호를 기록할 수 있는 표준 96웰 플레이트 리더에서 YFP 수준을 측정하고, 고원에 도달할 때까지 YFP 신호의 진화를 모니터링하고, 최대 재조합 단백질 생산을 나타냅니다. 이 단계에서 세포를 채취하고, 세포 펠릿을 단기적으로는 섭씨 영하 20도, 장기적으로는 섭씨 영하 80도에서 보관하고, 세포는 단백질과 세포질 및 핵의 요구 사항에 맞는 방법으로 보관해야 합니다.

분획된 핵 단백질은 일반적으로 핵 펠릿에서 발견됩니다. 세포질 단백질은 세포질에 남아 있습니다. 단백질 정제는 분획법(fractionation)을 통해 크게 단순화됩니다.

단일 원심분리 단계로 많은 오염 물질을 제거할 수 있기 때문입니다. 단백질 복합체는 multi-well 또는 micro tip 기반 정제와 같은 소형 정제 방법을 활용하여 소규모 초기 세포 배양에서 편리하게 정제할 수 있습니다. ACTA micro와 같은 소량 크로마토그래피 시스템과 함께 향후 단계는 전체 실험 설정을 소형화하고 클로닝 워크스테이션과 인터페이스하는 소형 탁상용 애플리케이션에 통합하는 것입니다.

여기에 표시된 것은 현재 개발 중인 마이크로 스케일 배치 로봇으로, 이러한 목적으로 사용될 것입니다. 이종 단백질의 강력한 동시 발현은 여기에서 볼 수 있듯이 multi back system에 의해 달성됩니다. 과발현된 단백질 금지는 전체 세포 추출물, WCE 및 세척된 용해물에서 명확하게 식별할 수 있습니다.

Sn. 생산된 단백질 물질의 질과 양은 종종 충분합니다. 이 다이어그램에 표시된 유사분열 체크포인트 복합체 MCC와 같은 단백질 복합체의 구조화된 측정을 가능하게 합니다. 종종 이러한 분석적 정제 실행의 수율은 전자 현미경을 포함한 다양한 수단으로 정제된 복합체의 구조와 기능을 분석하기에 충분합니다.

우리가 개발한 표준 운영 절차를 통해 비전문가 사용자도 우리의 접근 방식을 쉽게 적용할 수 있으며, 우리의 기술은 오늘날 Nikola의 작은 단백질의 경우와 마찬가지로 큰 단백질 복합체에 관심이 있는 많은 실험실에서 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 야심 찬 연구 목표를 위해 타의 추종을 불허하는 양과 품질로 관심 있는 단백질 복합체를 생산하기 위해 멀티 백을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 당사 시스템으로 작업하는 데 특별한 안전 조건이 필요하지 않습니다.

그러나 바이러스가 엉성하면 세포에서 복제되지 않더라도 감염될 수 있다는 점을 명심하자. 따라서 이 절차를 수행하는 동안 스테로이드 상태를 신중하게 처리하는 것이 필수입니다. 우리의 방법은 이미 전 세계 600개 이상의 실험실에서 상당한 인기를 얻고 있습니다.

우리의 기술을 사용하십시오. 우리는 미래에 우리의 방법이 인간의 복합 영역을 다루는 대규모 구조 유전체학 노력의 필수적인 부분이 될 것이라고 믿습니다. 이것은 질병의 기초를 밝히는 데 도움이 될 수 있으며 장기적으로 새롭고 더 나은 약물과 치료법으로 이어질 수 있습니다.