在体外化培养基层小鼠结肠肿瘤

该程序的总体目标是建立原代神经元结肠肿瘤类器官。这是通过首先收集小鼠结肠肿瘤组织来实现的。第二步是解离邻近的正常结肠上皮。

接下来，结肠肿瘤细胞被消化成单个细胞。最后一步是将结肠肿瘤细胞包埋到基质胶中，并在有限的营养条件下选择性地培养它们。最终，光学显微镜用于显示结肠肿瘤类器官形成的时间进程。

与现有方法（如转化的结肠癌细胞系）相比，该技术的主要优点是类器官培养物与体内状态非常相似，并产生更多生理相关数据。用二氧化碳对小鼠实施安乐死并收集结肠后，用 PBS 冲洗结肠。用剪刀纵向打开结肠，然后将其置于立体显微镜下，用剪刀去除包含肿瘤的区域。

收集并用 PBS 洗涤肿瘤组织。洗涤后，将肠道碎片转移到 EDTA 螯合剂中，缓冲，并在冰上孵育 60 分钟螯合后，大部分正常肠上皮细胞将被分离，而肿瘤细胞将保持附着在机制上。吸出含有正常上皮细胞的螯合缓冲液并洗涤剩余的肿瘤片段。

再来一次。含 5 mL 冷螯合缓冲液。吸出螯合缓冲液后，用 5 毫升冷的 1 XPBS 洗涤肿瘤片段。

吸出 1 个 XPBS 后，向组织片段中加入消化缓冲液并孵育 2 小时。在 37 摄氏度下，让肿瘤片段在正常重力下沉降 1 分钟，然后将 S 上清液收集在 15 毫升离心管中。以 200 倍 G 离心 3 分钟，使单细胞肿瘤悬液旋后沉淀。

然后用 5 毫升 PBS 洗涤一次并离心。同样，用 500 微升 PBS 重悬肿瘤沉淀。然后使用血细胞仪对分离的单个肿瘤细胞进行计数。

接下来，以 200 倍 G 离心 3 分钟，将肿瘤细胞卷起，并在冰上重新加入每毫升 5 毫克的基质胶。然后在 24 孔板中每孔将 15， 000 个细胞接种在每孔 50 微升体积的基质胶中。让基质胶细胞混合物在 37 摄氏度下聚合 15 分钟后，将 500 微升含有 50 ng/mL 尿液 EGF 的基础培养基添加到每孔更换含有 EGF 的基础培养基中，每两天更换一次，并按摩类器官 1 至 5 次，每周一次。

用新鲜的基础培养基替换培养基后，使用带有切割移液器吸头的 P 1000 移液器机械破坏类器官和基质胶。将类器官悬浮液转移到 15 毫升 falcon 管中。使用火抛光的意大利面移液器进一步破坏类器官。

用 5 毫升基础培养物、培养基洗涤解离的类器官，并以 200 倍 G 离心 2 分钟。然后弃去腌物，如前所述用 matri 凝胶和板重悬沉淀，以冷冻类器官、解离、洗涤和离心。和以前一样，丢弃旋后和 resus。

将沉淀悬浮在含有 20% 胎牛血清和 10% 二甲基亚砜氧化物的 DMEM 中。接下来，将细胞悬液转移到 1.5 mL 冻存管中。将试管转移到 Nalgene Mr.Frosty 冷冻容器中，并储存在零下 80 摄氏度的冰箱中，以达到每分钟零下 1 摄氏度的冷却速率。

孵育过夜后，将细胞转移到液氮中。细胞可以以这种方式储存两年以上。对于 RNA 提取，收集细胞。

至于传代，使用 pico pure RNA 分离试剂盒分离 RNA。根据制造商的蛋白质提取说明，以通常的方式收集细胞沉淀，然后躺在 100 微升放射免疫沉淀测定缓冲液中用于免疫组织化学。吸出细胞培养基后，使用 cut P 1000 移液器将肿瘤类器官转移到冷冻模具中。

将模具放在干冰上，向模具中加入组织冷冻培养基，以 7 微米切割冷冻切片并染色根据先前发布的方案，该图像显示了一个代表性的类器官形成，该组织来自三个月大的 PC min 小鼠在电镀后不久取自结肠肿瘤。该图像显示了铺板后一天的相同类器官。在这里，类器官已经培养了三天。

虽然这张图片显示了接种后 6 天的类器官。这里显示了两个已经培养了 14 天的类器官。请注意，在此阶段，每个类器官都由一组细胞组成。

该直方图显示了在两种不同的胶原酶消化条件下类器官形成的成功率。这些图像显示了来自结肠肿瘤的类器官，该结肠肿瘤取自三个月大的 PC min 小鼠，对 β-catenin 进行免疫荧光染色。DPI 用于细胞核染色。

看完这个视频，你应该对如何通过酶消化建立原发性尿结肠肿瘤 OID 有了很好的了解。