GST-His纯化：一种两步亲和纯化方案，可获得全长纯化蛋白

以下实验的总体目标是获得一种高度纯化的全长目标蛋白。通过构建重组杆状病毒，感染SF nine昆虫细胞，从而高效表达并获得可溶性的双标签目标蛋白。随后进行两步亲和纯化，首先纯化谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase）标签蛋白，继而进行金属亲和层析。

纯化结果为高纯度的组氨酸标签蛋白。接下来，对纯化的蛋白样品进行透析，以确保储存缓冲液中的低盐浓度。通过SDS-PAGE凝胶的全蛋白染色，获得结果以显示蛋白的表达可溶性、产量和质量。

我们最初想到这一方法是因为在纯化 PAL B2 和 BOC2 等大分子且不稳定的蛋白质时遇到了困难。因此，与一步亲和纯化等现有方法相比，本技术的主要优势在于：通过我们的两步亲和纯化方案所获得的蛋白质纯度很高，通常不含降解产物。该方法有助于回答蛋白质生物学领域的关键问题，例如纯化后的重组蛋白质的生物化学功能。

本方案首先进行重组杆状病毒的制备，随后根据文本方案中所述的感染方法，筛选出效率最高的BA病毒。准备一个旋转培养瓶，其中含有500毫升培养基，内含0.75至1.0 × 10⁶个SF9细胞，病毒与培养基的比例为1:150。将旋转培养瓶置于细胞培养罩内，通过旋转瓶的一侧管口，将适量的杆状病毒悬液加入细胞悬液中，以感染细胞。

将感染的细胞在27摄氏度下悬浮培养，并在达到最大蛋白表达量时收获细胞，该时间点由选择最有效的杆状病毒确定。收获细胞后，在冰水浴中用约20毫升GST结合缓冲液裂解表达目标蛋白的SF9细胞，缓冲液中需添加蛋白酶抑制剂。使用Dounce匀浆器上下吹打20次，随后进行超声处理，共3个循环，每个循环32秒，之后再次吹打20次。接着，将细胞裂解液在4摄氏度下以18,000 RPM离心30分钟，保留上清液。将可溶性细胞裂解液与1毫升预先洗涤过的GST磁珠在4摄氏度下轻柔旋转孵育1小时。

应根据结合后前体的稳定性及结合效率优化孵育时间。以700 RPM短暂离心后，弃去含有未结合蛋白的上清液。使用GST洗涤缓冲液洗涤与GST结合的蛋白。

在最后一次洗涤后重复此步骤两次。尽可能吸除上清液。然后将珠子与5毫摩尔ATP和15毫摩尔氯化镁加入10毫升GST结合缓冲液中，在4摄氏度下孵育1小时，以避免热激蛋白在孵育后发生非特异性结合。

用 GST 洗涤缓冲液洗涤珠子三次。离心 GST 珠子并去除上清液后，用 P5 缓冲液洗涤 GST 珠子。接下来，将 GST 珠子分装成每份 100 微升（µL），并在每份中加入 4 到 8 单位用 100 微升（µL）P5 缓冲液稀释的 Precision 酶。

将GST磁珠与酶在4°C下轻轻旋转孵育3小时至过夜。孵育时间应根据蛋白质的分子量及其在切割后的稳定性进行优化。短暂离心并收集上清液。

向珠子中加入 100 µL 的 P5 缓冲液。然后重复离心并收集上清液两次。合并所有组分。

将EIT分成三份，每份一毫升，每份与100微升预洗涤的Talon金属亲和树脂干珠在旋转条件下孵育一小时，将洗脱分成多个组分可提高结合和洗涤效率。然后在4摄氏度下，用P 30缓冲液轻轻旋转洗涤树脂五分钟。重复洗涤两次后，将珠子收集至一个离心管中，以洗脱纯化的蛋白质。

向与 Talon 树脂结合的蛋白质中加入 P 500 缓冲液。按一体积缓冲液对一体积树脂的比例加入缓冲液。在旋转条件下孵育悬浮液 5 分钟。

重复此步骤两次，每次洗脱的组分需分别保存，以用于纯化蛋白的储存。将蛋白在4°C下，于适当储存缓冲液中振荡透析两次，每次一小时。

透析过程中需注意检查纯化后蛋白质是否发生沉淀。将纯化后的蛋白质分成小份，置于干冰上速冻30分钟。将分装样品于负80摄氏度保存，避免反复冻融。

通过将每种组分约 20 至 40 微升上样至 SDS-PAGE 胶中，分析纯化过程。电泳完成后，用考马斯亮蓝或蛋白质染色剂染色以进行可视化。对感染 REC14 重组杆状病毒或未感染（对照）的 SF9 细胞的可溶性组分及全细胞裂解液进行考马斯亮蓝染色分析，从而确认 GST-RE14-His 蛋白在纯化过程中的表达情况。通过考马斯亮蓝染色分析多个样品，以追踪该方法的纯化效率。

染色结果显示，在纯化的第一步中，GST Rec 14 正确结合到 GST 琼脂糖珠上，由于 rec 14 与 GST 融合，其表观分子量约为 50 千道尔顿；经 GST-GST 蛋白酶精确切割后，游离的 rec 14 hiss 迁移至约 37 千道尔顿处。尽管部分游离的 GST 仍保留在 GST 琼脂糖珠上，且有一定量的 REC 14 hiss 仍与 GST 琼脂糖珠结合，但已实现 REC 14 hiss 的显著富集。通过延长蛋白与精确蛋白酶的孵育时间，该步骤可进一步优化。将结合于 Talon 琼脂糖珠上的 REC 14 hiss 与 GST 纯化步骤后提及的蛋白进行比较分析，结果显示大部分 REC 14 hiss 能够结合到 Talon 琼脂糖珠上。

经过数次洗涤后，REC 14 hiss 被洗脱并收集，共进行了三次洗脱。分析结果显示，REC 14 hiss 纯度较高，并且在洗脱组分与磁珠结合物的首次洗脱比较中，REC 14 hiss 浓度最高，这说明了洗脱过程的高效性。由于仅有少量 REC 14 hiss 可检测到与磁珠结合。

这些样品还通过抗 GST 和抗 hiss 抗体进行了 Western 血液分析，以追踪 REC 14。在整个过程中，抗 GST 印迹显示，在来自 GST 纯化步骤的上述蛋白中存在部分 GST-REC14 和游离 GST，且 hiss 标签亲和纯化步骤去除了污染物。该印迹结果表明，经 Precision 蛋白酶处理及 hiss 标签纯化步骤后，GST 已从 REC14 中被高效去除。

抗组氨酸印迹旨在检测 Rec14。该印迹证实 GST-Rec14-组氨酸和 Rec14-组氨酸并未从 GST 琼脂糖微珠上完全切割并去除。此外，在高浓度下，Rec14 似乎发生聚集。

综上所述，所展示的结果证明了 GST hiss 纯化方法在纯化 S palm B rec 14 蛋白中的高效性。在观看本视频后，您应能充分理解如何获得高纯度的目标蛋白，一旦掌握该技术。

如果操作得当，在可溶性裂解液降解后的12小时内即可完成该技术。进行此实验时，必须注意快速操作，并严格在4°C条件下进行，以避免蛋白质降解。在此步骤之后，还可采用其他方法，如共沉淀实验或质谱分析，以回答更多问题，例如鉴定目标蛋白质的相互作用蛋白或翻译后修饰情况。

尽管我们使用此方法研究DNA，但该策略可经修改用于研究蛋白质在其他研究领域的功能。