Name: GST-他的净化：一个两步亲和纯化协议屈服全长纯化的蛋白质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-29T17:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学习利用GST-His双标签两步亲和纯化技术从SF9昆虫细胞中高效纯化全长可溶性重组蛋白。该方法通过谷胱甘肽和金属亲和层析获得高纯度蛋白，适用于DNA修复蛋白等生化功能研究。

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我们感谢Anne-Marie Dion-Cote就本方法的开发所进行的讨论。J.K.和R.B.为FQNRT博士研究员，M.-M.G.为CIHR范尼尔学者，J.-Y.M.为FRSQ高级研究员。本研究工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）向J.-Y.M.提供的资金支持。

1. 重组杆状病毒的制备
杆状病毒的制备主要采用 Invitrogen 公司的 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统，基本按照制造商提供的方案进行，仅作轻微修改：
<ol>
	<li>构建了一种改良的 pFastBac1 载体（Gibco, life），其中包含 GST 和 His 标签（图 2）。将含有 10xHis 标签的 pET-52b(+) 载体（Novagen）的多克隆位点（MCS）插入 pFastBac1 载体的 MCS 中，以生成 pFastBac1-Strep-10xHis。通过 PCR 扩增 pET-52b(+) MCS 序列，扩增引物在 XbaI 和 BlpI 限制性酶切位点之间引入了 5' 端的 BglII 限制性酶切位点和 3' 端的 HindIII 限制性酶切位点。将 PCR 产物利用 BamHI 和 BglII 限制性酶切序列的兼容性，克隆至 pFastBac1 的 BamHI 和 HindIII 位点之间。由于目标是构建一种可表达带有链霉亲和素标签和 10xHis 标签的重组蛋白的 pFastBac1 载体，因此未使用 pET-52b(+) MCS 序列中的 BamHI 位点。此外，未使用 XbaI 位点，以避免插入的 pET-52b(+) MCS 与 pFastBac1 原有 MCS 中已有的限制性酶切位点重复。随后，将带有 PreScission 蛋白酶识别位点（LeuGluValLeuPheGln/GlyPro）的 GST 编码序列插入 pFastBac1-Strep-10xHis 中。使用含有 NcoI 和 KpnI 限制性酶切位点的引物，对 pGEX-6P-2（GE Healthcare）中的 GST cDNA 序列进行 PCR 扩增，分别位于 5' 和 3' 末端。NcoI 位点可引入起始密码子，同时在 GST 上添加一个丙氨酸。将 PCR 产物克隆至 pFastBac1-Strep-10xHis 的 NcoI 和 KpnI 位点之间，导致链霉亲和素标签被删除。由此获得的新型融合载体命名为 pFastBac1-GST-10xHis。</li>
	<li>将目标蛋白的 cDNA 克隆至 pFastBac-GST-10xHis 载体中 GST（N 端）与 His 标签（C 端）之间的位点。注意去除 cDNA 的终止密码子，以确保与 C 端 His 标签的融合表达。</li>
	<li>将重组 pFastBac 载体（步骤 1.2 获得）转化至 E. coli DH10Bac 中，以生成杆状病毒基因组（bacmid）。在含有 Bluo-gal 和 IPTG 的选择性平板上（含 10 μg/ml 四环素、50 μg/ml 卡那霉素、7 μg/ml 庆大霉素、100 μg/ml Bluo-Gal、40 μg/ml IPTG），于 37 °C 培养过夜，随后在 30 °C 继续培养数小时，使菌落生长。</li>
	<li>从步骤 1.3 中挑取 2 个白色菌落，并在选择性平板上重新划线，以确认其白色表型。</li>
	<li>从步骤 1.4 中取两个白色菌落，接种于 2 ml 含 10 μg/ml 四环素、50 μg/ml 卡那霉素、10 μg/ml 庆大霉素的 LB 培养基中，在 37 °C、250 rpm 振荡条件下过夜培养。</li>
	<li>为纯化 bacmid DNA，将步骤 1.5 中的细菌离心收集，用 300 μl 溶液 I 重悬细胞，加入 300 μl 溶液 II（Qiagen Maxiprep 试剂盒）。室温孵育 5 分钟，加入 300 μl 3 M KOAc（pH 5.5），冰上孵育 10 分钟。4 °C 下最大转速离心 10 分钟。向上清中加入 800 μl 异丙醇，冰上孵育 10 分钟。4 °C 离心 15 分钟，用 500 μl 70% 乙醇洗涤沉淀。将沉淀干燥后，在无菌条件下用 40 μl Tris-EDTA（pH 8.0）重悬。bacmid DNA 应保存于 4 °C。</li>
	<li>按照制造商说明书生成杆状病毒。杆状病毒可在避光条件下保存于 4 °C。</li>
</ol>
2. 重组蛋白表达
<ol>
	<li>为了选择最高效的杆状病毒用于纯化，并监测目标蛋白表达量达到峰值的时间，请按以下步骤进行小规模感染实验：将133 μl（1/150）的杆状病毒感染2 × 107个在Grace's培养基（添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）中、于27 °C培养的Sf9细胞。在感染后0、24、48和72小时分别收集1.5 ml样品。离心收集细胞沉淀，利用抗标签抗体通过蛋白质印迹法分析目标蛋白的表达水平。</li>
	<li>采用步骤2.1中确定的最高效杆状病毒，以病毒与培养基体积比1/150的比例，感染装有500 ml培养基、细胞密度为1.0 × 106个/ml Sf9细胞的悬浮培养瓶。将感染后的细胞在27 °C下悬浮培养，当蛋白表达量达到最高水平（依据上述步骤2.1确定）时收获细胞。细胞沉淀可于-80 °C保存，待后续使用。</li>
</ol>
3. 可溶性细胞裂解液的制备
以下所有孵育步骤均在 4 °C 下温和旋转条件下进行。
<ol>
	<li>在约 20 ml GST 结合缓冲液（150 mM NaCl、1 mM EDTA、0.05% Triton-X-100、1 mM DTT 溶于 PBS 1X，最终 NaCl 浓度为 250 mM）中裂解表达目标蛋白的 Sf9 细胞，并加入蛋白酶抑制剂混合物（Roche）。将溶液置于冰水浴中，使用 Dounce 匀浆器匀浆 20 次，超声处理 3 次，每次 30 秒（输出功率 70%），再重复 Dounce 匀浆 20 次。</li>
	<li>（可选）将总细胞裂解液与 1 mM MgCl2 和 Benzonase7 核酸酶（2.5 U/ml）在 4 °C 下孵育 30 分钟，以去除 DNA 或 RNA 污染。</li>
	<li>在 4 °C 下以 18,000 rpm 离心 30 分钟，保留上清液。</li>
	<li>（可选）将上清液再次在 4 °C 下以 18,000 rpm 离心 30 分钟，以获得澄清的可溶性裂解液。将上清液通过 0.2 或 0.45 μm&#160;滤膜过滤，防止堵塞。</li>
</ol>
4. 蛋白质在 GST 珠上的结合
<ol>
	<li>将可溶性细胞裂解液与1 ml GST凝胶珠（预先用10 ml GST结合缓冲液洗涤两次）在4 °C下轻柔旋转孵育1小时。</li>
</ol>
注释：孵育时间需根据蛋白质的稳定性和结合效率进行优化。
<ol start="2">
	<li>以700 rpm短暂离心，弃去含有未结合蛋白的上清液（可保留用于进一步分析）。用GST洗涤缓冲液（含终浓度350 mM NaCl的GST结合缓冲液）洗涤GST结合的蛋白（图3B，泳道1）。</li>
	<li>重复步骤4.2两次。最后一次洗涤时，尽可能彻底去除上清液。</li>
	<li>将珠子与5 mM ATP和15 mM MgCl2（溶于10 ml GST结合缓冲液中）在4 °C孵育1小时，以避免热休克蛋白的非特异性结合8。随后用GST洗涤缓冲液洗涤珠子三次。</li>
</ol>
5. GST 的 PreScission 酶切
<ol>
	<li>离心GST磁珠，弃上清液，并用P5缓冲液（50 mM NaHPO4 pH 7.0，500 mM NaCl，10%甘油，0.05% Triton-X-100，5 mM 咪唑）洗涤GST磁珠。</li>
	<li>将GST磁珠与PreScission酶在P5缓冲液中于4 °C孵育3小时至过夜。（将GST磁珠分成每份100 μl，加入溶于100 μl P5缓冲液中的4–8单位（2–4 μl）酶。）</li>
</ol>
注释：PreScission 酶切步骤的孵育时间需根据蛋白质的分子量及其稳定性进行优化。若观察到降解现象，可将孵育时间缩短至最少 2 小时，而非过夜孵育。
<ol start="3">
	<li>短暂离心并收集上清液。加入100 μl P5 缓冲液至珠粒后，重复此步骤两次，并合并所有组分（图3B，泳道2）。</li>
</ol>
注释：剩余的磁珠可用于切割效率分析（图3B，第3泳道）。通常，约有70-80%的蛋白被切割。
6. 蛋白质与TALON金属亲和树脂的结合
<ol>
	<li>将上述洗脱液分为3份，每份1 ml，每份中加入100 μl&#160;钴金属亲和树脂干珠（预先用P5缓冲液洗涤两次），旋转孵育1小时。</li>
</ol>
注释： 将洗脱液分为多个组分可提高结合/洗涤效率。
<ol start="2">
	<li>用P30缓冲液（含30 mM咪唑的P5缓冲液）洗涤树脂5分钟。</li>
	<li>重复步骤6.2两次，并将珠子收集至同一根离心管中。最后一次洗涤前，尽可能吸除上清液。</li>
</ol>
注释：此条带对应于 TALON 结合样品（图 3B，第 4 泳道）。
7. 纯化蛋白的洗脱
<ol>
	<li>将结合蛋白的TALON树脂与P500缓冲液（含500 mM咪唑的P5缓冲液）按1:1（v/v）的体积比混合，在旋转仪上孵育5分钟。（例如，若取用200 μl&#160;干树脂珠，则需加入200 μl&#160;P500缓冲液。）重复此步骤两次，并分别收集每次洗脱的组分（命名为洗脱组分1（E1）、洗脱组分2（E2）和洗脱组分3（E3）；图3B，泳道5–7）。</li>
</ol>
注释： 剩余的磁珠可用于分析洗脱效率（图3B，第8泳道）。通常，总共有60-80%的蛋白质被洗脱下来。
<ol start="2">
	<li>通过将每个组分约 20–40 μl&#160;与标准 BSA 浓度一同上样至 SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝（图 3B）或 SYPRO 蛋白染色剂染色，分析纯化蛋白的产量和质量。</li>
</ol>
注释： 目标蛋白也可在纯化过程中使用抗 GST 和抗 His 抗体进行检测（图 3C）。
8. 纯化蛋白的保存
<ol>
	<li>将纯化的蛋白质在适当的储存缓冲液（例如 20 mM Tris乙酸盐 pH 8.0，200 mM KAc，10% 甘油，1 mM EDTA，0.5 mM DTT）中于4 °C进行透析。透析过程中需注意检查纯化蛋白是否发生沉淀。我们通常在4 °C下轻轻旋转透析2次，每次1小时。</li>
	<li>将纯化的蛋白质分装成小份（10–20 μl），在干冰上冷冻30分钟。将分装样品储存于-80 °C，避免反复冻融。</li>
</ol>

<ol><li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li>
<li>Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+separation+of+GST+fusion+proteins+from+co-purifying+GroEL%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A method for the separation of GST fusion proteins from co-purifying GroEL.</a> Trends Genet. 12, 209-210 (1996).</li>
<li>Carr, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+recombinant+form+of+the+V+antigen+of+Yersinia+pestis%2C+using+three+different+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems.</a> Vaccine. 18, 153-159 (1999).</li>
<li>Armisen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+adsorption+of+poly-His+tagged+glutaryl+acylase+on+tailor-made+metal+chelate+supports%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Selective adsorption of poly-His tagged glutaryl acylase on tailor-made metal chelate supports.</a> J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).</li>
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<li>Buisson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+of+breast+cancer+proteins+PALB2+and+piccolo+BRCA2+in+stimulating+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cooperation of breast cancer proteins PALB2 and piccolo BRCA2 in stimulating homologous recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1247-1254 (2010).</li>
<li>Filimonova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoforms+of+Serratia+marcescens+nuclease.+The+role+of+Mg2%2B+in+the+hydrolysis+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isoforms of Serratia marcescens nuclease. The role of Mg2+ in the hydrolysis mechanism.</a> Biochemistry. 62, 983-988 (1997).</li>
<li>Thorslund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+breast+cancer+tumor+suppressor+BRCA2+promotes+the+specific+targeting+of+RAD51+to+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The breast cancer tumor suppressor BRCA2 promotes the specific targeting of RAD51 to single-stranded DNA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1263-1265 (2010).</li>
<li>Genois, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+BRCA2+and+RAD51+for+promoting+homologous+recombination+in+Leishmania+infantum%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions between BRCA2 and RAD51 for promoting homologous recombination in Leishmania infantum.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6570-6584 (2012).</li>
<li>Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+vector+system%3A+an+emerging+host+for+high-throughput+eukaryotic+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression.</a> Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).</li>
</ol>

本文所介绍的GST-His纯化方案适用于多种分子量大小的重组蛋白纯化：我们已成功纯化了LiRAD51（41kDa）、piBRCA2（120kDa）、PALB2（130kDa），以及一种不稳定的高分子量蛋白——来自Leishmania infantum的LiBRCA2（125kDa）6,9。此外，采用该方案纯化的蛋白均具有生物化学活性6。该方法的成功完全取决于目标蛋白的表达水平、溶解性及稳定性。
	用于在其他宿主（如 E. coli 或酵母）中表达的分子生物学载体，可通过广泛使用的 GST 和 His 标签轻松进行改造。这凸显了本技术在大多数分子生物学实验室中的适用性和成本效益。多种优势促使我们选择感染细胞而非细菌或哺乳动物细胞，用于重组蛋白的表达与纯化。例如，翻译后修饰（如甲基化、磷酸化和泛素化）可显著影响蛋白质的酶活性10。因此，为了研究蛋白质的生理特性，宜采用能够实现翻译后修饰的表达系统，例如 Sf9 感染细胞。与哺乳动物细胞相比，使用 Sf...

纯化重组蛋白对于解答生物化学中的基本问题至关重要。传统的蛋白质纯化方法，如离子交换层析和尺寸排阻层析，分别依赖于目标蛋白的等电点、电荷或分子大小等物理性质。然而，这些蛋白特性在多种蛋白质中普遍存在，显著增加了传统蛋白质纯化策略中杂蛋白污染的可能性。该问题可通过使用多个纯化柱加以规避，但此方法耗时较长。同时，上述层析技术还需要昂贵的实验设备。亲和标签纯化可显著提高对目标蛋白的特异性，因为在大多数情况下，该标签仅特异性地存在于目标蛋白上。在近期的研究中，Flag标签或HA标签亲和纯化已被广泛使用。
与现有的仅使用单一标签的重组蛋白纯化方案不同，我们建立了一种独特的双标签组合方法。本方法在目标蛋白的N端融合GST标签，C端融合His标签，以实现目标蛋白产量与纯度之间的最佳比例。GST是一种较大的标签（29 kDa），在谷胱甘肽Sepharose微珠上的纯化效率很高。此外，使用GST标签可确保本方法的成本效益1。利用PreScission蛋白酶（识别序列LeuGluValLeuPheGln/GlyPro，仅引入两个氨基酸）将GST标签切除，具有多种优势，例如可避免因别构位阻而影响蛋白的正常生理功能。在蛋白另一端融合的小型His标签可用于第二步纯化，通过洗脱去除已切割的GST标签、降解的蛋白及其他污染物，从而进一步提高蛋白纯度。此外，在从GST纯化步骤转换到His纯化步骤（TALON树脂）时，本方案无需透析步骤。此类纯化过程中常见的污染物为热休克蛋白（HSP）。通过添加MgCl2和ATP的孵育步骤，可有效去除这些污染物（图1）。
快速蛋白液相色谱（FPLC）和高效液相色谱（HPLC）是常见的纯化技术，依赖昂贵的仪器设备以获得高产量的目标蛋白。相比之下，本文所介绍的批量纯化方案为手动操作，无需昂贵的仪器设备。通过放大该方案的处理规模，同样可实现高产量的蛋白纯化。同时，在批量纯化过程中，可灵活调节洗脱体积以提高蛋白浓度，而这一点在FPLC或HPLC中难以实现。
此外，采用批量GST-His纯化方案，可纯化分子量范围约为10-300 kDa的蛋白质。该方法最大的优势之一在于可同时纯化多种蛋白质，例如野生型蛋白及其突变体蛋白。本方案的成功完全取决于目标蛋白的表达水平和溶解性。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;大肠杆菌 &lt;/em&gt;DH10Bac（感受态）</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac杆状病毒表达系统</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxi Prep 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>溶液I和溶液II</td></tr><tr><td>Ultra Pure Bluo-Gal</td><td>Gibco（Life）</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gibco（Life）</td><td>15529019</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 感染细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>PreScission酶</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Grace's 感染培养基补充液</td><td>Gibco（Life）</td><td>11605-094</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清表征</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（P/S）</td><td>Gibco（Life）</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽 Sepharose 树脂</td><td>GE 生物科学</td><td>17075605</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>罗氏</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Talon 树脂</td><td>Clontech</td><td>635504</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>BioShop</td><td>288324</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Gibco（Life）</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>多克隆GST抗体</td><td>自行生产</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单克隆6X-His抗体</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dounce匀浆器（紧密型）</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪（Fisher dismembrator）</td><td>Fisher</td><td>Model 150</td><td></td></tr><tr><td>透析袋（50 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>2115217</td><td></td></tr></tbody></table>

gst-his纯化：一种两步亲和纯化方案，可获得全长纯化蛋白

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

酶学中用于蛋白质生化表征的关键检测方法 体外 需要高浓度的目标纯化蛋白。蛋白纯化方案应兼顾效率、简便性与成本效益1在此，我们介绍GST-His方法作为一种新的小规模亲和纯化系统，用于重组蛋白的纯化，该方法基于N端谷胱甘肽Sepharose标签（GST）2,3 C端10xHis标签4，两者均与目标蛋白融合。后者用于生成杆状病毒，以感染Sf9感染细胞进行蛋白表达5GST 是一个相对较长的标签（29 kDa），可用于确保纯化效率。然而，它可能影响蛋白的生理特性。因此，后续需使用 PreScission 酶将 GST 标签从蛋白上切割去除。6为了确保最大程度的纯度并去除被切割的GST，我们增加了一个基于相对较小的His标签的二次亲和纯化步骤。重要的是，我们的技术基于位于蛋白两端的两种不同标签，这是一种有效去除降解蛋白、从而富集全长蛋白的工具。本文所述方法无需昂贵的仪器设备（如FPLC）。此外，我们加入了MgCl₂2 并通过ATP洗涤去除热休克蛋白杂质，以及核酸酶处理以消除污染性核酸。总之，通过在N端和C端两侧使用两种不同的标签，并具备切除其中一个标签的能力，可确保获得高纯度且全长的目标蛋白。

为了说明 GST-His 纯化方案的效率，我们纯化了大小为 32.9 kDa 的 S. pombe 蛋白 Rec14。将 Rec14 的 cDNA 克隆至我们改造的 pFastBac1 载体中，使其在 N 端和 C 端分别添加 GST 和 His 标签（图 1A）。随后制备重组杆状病毒，并用于感染 SF9 细胞以表达目标蛋白。将可溶性细胞裂解液与 GST 琼脂糖微珠孵育，通过 PreScission 蛋白酶切割 GST 标签来洗脱结合的蛋白。所得的 Rec14-His 蛋白使用 TALON 树脂进行亲和层析纯化，并用含有 500 mM 咪唑的 TALON 缓冲液洗脱结合的蛋白。纯化后的 Rec14-His 蛋白经储存缓冲液透析后，保存于 -80 °C（图 1B）。
通过考马斯亮蓝染色分析了感染 Rec14 重组杆状病毒或模拟感染（对照）的 SF9 细胞的可溶性及全细胞裂解液，从而确认了 GST-Rec14-His 蛋白的表达（图 3A）。在纯化过程中，我们对多个样...

在本实验方案中，我们展示了一种高效且经济的小规模蛋白质纯化方法，该方法通过独特地结合可切割的GST标签和小型His标签，实现对重组蛋白的纯化。

GST-His纯化：一种两步亲和纯化方案，可获得全长纯化蛋白

酶学研究中的关键检测方法在体外对蛋白质进行生化表征时，需要高浓度的纯化目标蛋白。

以下实验的总体目标是获得一种高度纯化的全长目标蛋白。通过构建重组杆状病毒，感染SF nine昆虫细胞，从而高效表达并获得可溶性的双标签目标蛋白。随后进行两步亲和纯化，首先纯化谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase）标签蛋白，继而进行金属亲和层析。纯化结果为高纯度的组氨酸标签蛋白。接下来，对纯化的蛋白样品进行透析，以确保储存缓冲液中的低盐浓度。通过SDS-PAGE凝胶的全蛋白染色，获得结果以显示蛋白的表达可溶性、产量和质量。我们最初想到这一方法是因为在纯化 PAL B2 和 BOC2 等大分子且不稳定的蛋白质时遇到了困难。因此，与一步亲和纯化等现有方法相比，本技术的主要优势在于：通过我们的两步亲和纯化方案所获得的蛋白质纯度很高，通常不含降解产物。该方法有助于回答蛋白质生物学领域的关键问题，例如纯化后的重组蛋白质的生物化学功能。本方案首先进行重组杆状病毒的制备，随后根据文本方案中所述的感染方法，筛选出效率最高的BA病毒。准备一个旋转培养瓶，其中含有500毫升培养基，内含0.75至1.0 × 10⁶个SF9细胞，病毒与培养基的比例为1:150。将旋转培养瓶置于细胞培养罩内，通过旋转瓶的一侧管口，将适量的杆状病毒悬液加入细胞悬液中，以感染细胞。将感染的细胞在27摄氏度下悬浮培养，并在达到最大蛋白表达量时收获细胞，该时间点由选择最有效的杆状病毒确定。收获细胞后，在冰水浴中用约20毫升GST结合缓冲液裂解表达目标蛋白的SF9细胞，缓冲液中需添加蛋白酶抑制剂。使用Dounce匀浆器上下吹打20次，随后进行超声处理，共3个循环，每个循环32秒，之后再次吹打20次。接着，将细胞裂解液在4摄氏度下以18,000 RPM离心30分钟，保留上清液。将可溶性细胞裂解液与1毫升预先洗涤过的GST磁珠在4摄氏度下轻柔旋转孵育1小时。应根据结合后前体的稳定性及结合效率优化孵育时间。以700 RPM短暂离心后，弃去含有未结合蛋白的上清液。使用GST洗涤缓冲液洗涤与GST结合的蛋白。在最后一次洗涤后重复此步骤两次。尽可能吸除上清液。然后将珠子与5毫摩尔ATP和15毫摩尔氯化镁加入10毫升GST结合缓冲液中，在4摄氏度下孵育1小时，以避免热激蛋白在孵育后发生非特异性结合。用 GST 洗涤缓冲液洗涤珠子三次。离心 GST 珠子并去除上清液后，用 P5 缓冲液洗涤 GST 珠子。接下来，将 GST 珠子分装成每份 100 微升（µL），并在每份中加入 4 到 8 单位用 100 微升（µL）P5 缓冲液稀释的 Precision 酶。将GST磁珠与酶在4°C下轻轻旋转孵育3小时至过夜。孵育时间应根据蛋白质的分子量及其在切割后的稳定性进行优化。短暂离心并收集上清液。向珠子中加入 100 µL 的 P5 缓冲液。然后重复离心并收集上清液两次。合并所有组分。将EIT分成三份，每份一毫升，每份与100微升预洗涤的Talon金属亲和树脂干珠在旋转条件下孵育一小时，将洗脱分成多个组分可提高结合和洗涤效率。然后在4摄氏度下，用P 30缓冲液轻轻旋转洗涤树脂五分钟。重复洗涤两次后，将珠子收集至一个离心管中，以洗脱纯化的蛋白质。向与 Talon 树脂结合的蛋白质中加入 P 500 缓冲液。按一体积缓冲液对一体积树脂的比例加入缓冲液。在旋转条件下孵育悬浮液 5 分钟。重复此步骤两次，每次洗脱的组分需分别保存，以用于纯化蛋白的储存。将蛋白在4°C下，于适当储存缓冲液中振荡透析两次，每次一小时。透析过程中需注意检查纯化后蛋白质是否发生沉淀。将纯化后的蛋白质分成小份，置于干冰上速冻30分钟。将分装样品于负80摄氏度保存，避免反复冻融。通过将每种组分约 20 至 40 微升上样至 SDS-PAGE 胶中，分析纯化过程。电泳完成后，用考马斯亮蓝或蛋白质染色剂染色以进行可视化。对感染 REC14 重组杆状病毒或未感染（对照）的 SF9 细胞的可溶性组分及全细胞裂解液进行考马斯亮蓝染色分析，从而确认 GST-RE14-His 蛋白在纯化过程中的表达情况。通过考马斯亮蓝染色分析多个样品，以追踪该方法的纯化效率。染色结果显示，在纯化的第一步中，GST Rec 14 正确结合到 GST 琼脂糖珠上，由于 rec 14 与 GST 融合，其表观分子量约为 50 千道尔顿；经 GST-GST 蛋白酶精确切割后，游离的 rec 14 hiss 迁移至约 37 千道尔顿处。尽管部分游离的 GST 仍保留在 GST 琼脂糖珠上，且有一定量的 REC 14 hiss 仍与 GST 琼脂糖珠结合，但已实现 REC 14 hiss 的显著富集。通过延长蛋白与精确蛋白酶的孵育时间，该步骤可进一步优化。将结合于 Talon 琼脂糖珠上的 REC 14 hiss 与 GST 纯化步骤后提及的蛋白进行比较分析，结果显示大部分 REC 14 hiss 能够结合到 Talon 琼脂糖珠上。经过数次洗涤后，REC 14 hiss 被洗脱并收集，共进行了三次洗脱。分析结果显示，REC 14 hiss 纯度较高，并且在洗脱组分与磁珠结合物的首次洗脱比较中，REC 14 hiss 浓度最高，这说明了洗脱过程的高效性。由于仅有少量 REC 14 hiss 可检测到与磁珠结合。这些样品还通过抗 GST 和抗 hiss 抗体进行了 Western 血液分析，以追踪 REC 14。在整个过程中，抗 GST 印迹显示，在来自 GST 纯化步骤的上述蛋白中存在部分 GST-REC14 和游离 GST，且 hiss 标签亲和纯化步骤去除了污染物。该印迹结果表明，经 Precision 蛋白酶处理及 hiss 标签纯化步骤后，GST 已从 REC14 中被高效去除。抗组氨酸印迹旨在检测 Rec14。该印迹证实 GST-Rec14-组氨酸和 Rec14-组氨酸并未从 GST 琼脂糖微珠上完全切割并去除。此外，在高浓度下，Rec14 似乎发生聚集。综上所述，所展示的结果证明了 GST hiss 纯化方法在纯化 S palm B rec 14 蛋白中的高效性。在观看本视频后，您应能充分理解如何获得高纯度的目标蛋白，一旦掌握该技术。如果操作得当，在可溶性裂解液降解后的12小时内即可完成该技术。进行此实验时，必须注意快速操作，并严格在4°C条件下进行，以避免蛋白质降解。在此步骤之后，还可采用其他方法，如共沉淀实验或质谱分析，以回答更多问题，例如鉴定目标蛋白质的相互作用蛋白或翻译后修饰情况。尽管我们使用此方法研究DNA，但该策略可经修改用于研究蛋白质在其他研究领域的功能。

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