GST-他的净化：一个两步亲和纯化协议屈服全长纯化的蛋白质

以下实验的总体目标是获得高度纯化的目标全长蛋白质。这是通过产生重组 bao 病毒来实现的，该病毒用于感染 SF 9 昆虫细胞，以获得高度表达和可溶的 2 标签蛋白。然后进行两步亲和纯化，其特征是纯化谷胱甘肽、血清标签蛋白，然后进行金属亲和层析。

纯化结果是高纯度的组氨酸标签蛋白。接下来，对纯化的蛋白质样品进行透析，以保证储存缓冲液中的低盐浓度。根据 SDS 页面凝胶的整个蛋白质染色，获得显示蛋白质表达溶解度、数量和质量的结果。

当我们在纯化 PAL B 2 和 BOC two 等大而不稳定的蛋白质时遇到困难时，我们第一次想到了这种方法。因此，与现有方法（如一步亲和纯化）相比，该技术的主要优势在于，在我们的两步亲和纯化方案中，获得的蛋白质纯度高，通常不含降解产物。该方法可以帮助回答蛋白质生物学领域的关键问题，例如纯化重组蛋白的生化功能。

该方案从生产重组 bao 病毒开始，然后选择最有效的 BA 病毒，如感染文本方案中所述。在 500 毫升培养基中制备一个旋转培养容器，其中含有 0.75 至 1.0 乘以 10 至 6 个 SF 9 细胞，病毒与培养基之间的比例为 1：150。将旋转器放在细胞培养罩下，通过旋转器的一个臂将必要体积的 baula 病毒悬浮液添加到细胞悬液中来感染细胞。

让受感染的细胞在 27 摄氏度的悬浮液中生长，并在达到最大蛋白质表达时收获细胞，这是在选择最有效的黄斑病毒时确定的。收获细胞后，在大约 20 mL GST 结合缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，在冰水浴中补充蛋白酶抑制剂，对表达目标蛋白的 SF 9 细胞进行溶出。用羽绒均质器将溶液向下放置 20 次，然后超声处理 3 个第 32 个循环，然后再次跳舞 20 次，将细胞裂解物在 4 摄氏度下以 18， 000 RPM 离心 30 分钟，并保持上清液，将可溶性细胞裂解物与 1 毫升预洗的 GST 珠子在 4 摄氏度下轻轻旋转孵育 1 小时。

孵育时间应根据 pro 的稳定性和结合后的结合效率进行优化。以 700 RPM 的速度快速旋转并去除含有未结合蛋白的上清液。用 GST 洗涤缓冲液洗涤 GST 结合的蛋白质。

最后一次洗涤后重复此过程两次。去除尽可能多的上清液。然后将微珠与 5 毫摩尔 A TP 和 15 毫摩尔氯化镁在 10 毫升 GST 结合缓冲液中在 4 摄氏度下孵育 1 小时，以避免孵育后热休克蛋白的非特异性结合。

用 GST 洗涤缓冲液洗涤珠子 3 次。离心 GST 珠子并去除上清液后，用 P 5 缓冲液洗涤 GST 珠子。接下来，将 GST 珠子、100 μL 的违规行为分开，并加入 4 至 8 个单位的精密酶，稀释在 100 μL P 5 缓冲液中。

将 GST 微珠与酶一起孵育 3 小时，然后在 4 摄氏度下轻轻旋转过夜。孵育时间应根据分子量以及切割后蛋白质的稳定性进行优化。快速旋转并收集上清液。

向珠子中加入 100 微升 P 5 缓冲液。然后重复、旋转和上清液收集两次。拉出所有馏分。

EIT 分成 3 份，每份 1 mL，每份与 100 μL 预洗的利爪金属亲和树脂干珠旋转孵育 1 小时，将洗脱分成几份，提高结合和洗涤效率。然后用 P 30 缓冲液在 4 摄氏度下轻轻旋转洗涤树脂 5 分钟。重复洗涤两次后，将珠子拉入单管中以洗脱纯化的蛋白质。

将 P 500 缓冲液添加到蛋白质结合的 talon 树脂中。添加 1 比 1 体积的缓冲液与磁珠比率。卷。在旋转下将悬浮液孵育 5 分钟。

重复此步骤两次。将每个逃脱的级分分开以储存纯化的蛋白质。在搅拌下，在 4 摄氏度下用适当的储存缓冲液透析蛋白质 2 次，持续 1 小时。

在透析过程中检查纯化蛋白的沉淀很重要。将纯化的蛋白质分成小份，在干冰上冷冻 30 分钟。将等分试样储存在负 80 摄氏度下，避免多次解冻冷冻循环。

通过将大约 20 至 40 μL 的每种组分加载到 SDS 页面凝胶上来分析纯化过程。在用 kumasi 蓝或蛋白质染色剂运行凝胶染色进行可视化后，通过 Kumasi 蓝染色分析感染 REC 14 重组 valo 病毒或模拟感染作为对照的 SF 9 细胞的可溶性和总细胞裂解物，从而确认纯化过程中 GST re 14 his 蛋白的表达。对许多样品进行了分析，以跟踪 kumasi Blue 对这些样品的方法分析效率。

染色显示，在纯化的第一步中，由于 rec 14 与 GST 融合，GST Rec 14 与表观分子量约为 50 道尔顿的 GST 珠子在与 G-S-T-G-S-T 精确切割后正确结合，游离 rec 14 嘶嘶声迁移约 37 道尔顿。虽然可以在 GST 珠子上看到裂解的 GST，但尽管部分不含 GST 的 REC 14 仍与 GST 珠子结合，但 REC 14 嘶嘶声的显着富集实现了。与 GST 纯化步骤后提到的蛋白质相比，对与 Talon 珠结合的 REC 14 嘶嘶声进行精确的蛋白酶分析表明，大部分 REC 14 嘶嘶声与 Talon 珠子结合，可以通过增加蛋白质的孵育时间来改进此步骤。

经过几次洗涤，REC 14 嘶嘶声被躲避并收集，进行了 3 次幻觉。分析显示，在 Ellucian 说明了错觉的效率之后，首次将逃避的分数与爪珠进行比较，发现了高纯度的 rec 14 嘶嘶声和 rec 14 嘶嘶声的最大浓度。由于小 rec 14 嘶嘶声可以检测到与珠子结合。

这些样本还进行了抗 GST 和抗嘶嘶声抗体的蛋白质血液分析，以遵循 REC 14。在整个程序中，抗 GST 印迹显示，GST 纯化步骤中提到的蛋白质中仅存在一些 GS TRE 14 和 GST，并且污染物通过嘶嘶标签亲和纯化步骤去除。该印迹显示，通过精确处理和 hiss ttag 纯化步骤，已从 re 14 中有效去除 GST。

抗嘶嘶声印迹旨在检测 re 14。该印迹证实 GST Rec 14 嘶嘶声和 REC 14 嘶嘶声未被完全切割并从 GST 珠子中去除。此外，在高浓度下，REC 14 似乎聚集。

总之，所呈现的结果表明 GST 嘶嘶声纯化对 S palm B rec 14 的纯化效率。看完这个视频，你应该对如何恢复高度美化的能量有了很好的了解。重组蛋白 一旦掌握。

如果作得当，这项技术可以在可溶性酸变性后的 12 小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住在 4 摄氏度下快速严格地工作，以避免蛋白质降解遵循此程序。可以执行其他方法，例如代码沉淀分析或质谱分析，以回答其他问题，例如蛋白质伴侣的鉴定或目标蛋白质的翻译后修饰。

尽管我们将这种方法用于 DNA，但可以修改修复蛋白质策略以研究蛋白质在其他研究领域的功能。