本机配合物的净化对结构研究使用串联亲和标签法
2016年7月27日
串联亲和纯化 （TAP） 方法已广泛用于从细胞提取物（主要是真核生物）中分离天然复合物，用于蛋白质组学。在这里，我们提出了一种针对纯化天然复合物进行结构研究而优化的 TAP 方法方案。
该方案的总体目标是纯化质量合适的天然大分子复合物，用于生物物理研究。该方案不仅用作纯化复合物的一种方式，而且作为纯化过程中评估样品结构质量的详细指南。该方案的主要优点是它允许在接近生理缓冲条件下简单快速地纯化天然组装体，从而确保成分的均匀性。
离心酿酒酵母细胞后，根据文本方案倾析上清液，加入 2 毫升冷冻裂解缓冲液，涡旋和/或使用 10 毫升血清移液管悬浮沉淀。将细胞悬液转移到冰上的空 50 ml 锥形聚丙烯离心管中。然后，再使用两毫升冷冻裂解缓冲液洗涤每个离心瓶，并将溶液加入 50 毫升试管中。
确定细胞沉淀的湿重后，在 50 毫升锥形聚丙烯离心管中及其周围制备液氮浴。接下来，将悬浮细胞吸入 5 毫升注射器中，并将 16 号针头连接到注射器。然后，将细胞悬液通过注射器和针头以大约每分钟 1 毫升的速率进入浴中以产生液滴，从而冻结细胞悬液。
要裂解酵母细胞，首先使用液氮预冷咖啡研磨机。然后加入最多 40 克酵母细胞，研磨 25 秒，重复研磨 8 或 9 次。建议一次纯化的细胞培养物不要超过 10 升。
这最大限度地减少了纯化时间，并确保了复合物的结构完整性。每两轮研磨后，在研磨机中加入一层浅层液氮并使其蒸发。为防止细胞结块，请使用液氮冷却的刮刀搅拌细胞，以防止细胞解冻。
裂解后，细胞应呈现为细小的白色粉末。根据文本方案检查细胞裂解并用 PMSF、DTT 和蛋白酶抑制剂制备裂解缓冲液后，使用液氮冷冻刮刀将冷冻裂解细胞粉末逐渐舀入准备好的 50 毫升缓冲液管中。每增加一次增量，在室温下轻轻旋转 50 毫升试管，以便解冻和溶解细胞并防止形成气泡。
随着细胞溶解，添加更多的细胞粉末。添加所有细胞后，继续解冻和溶解细胞，直到在试管中未观察到冻结的细胞团块。这大约需要 50 分钟。
接下来，将细胞裂解物以 25， 000 倍 g 和 4 摄氏度离心 20 分钟。细胞裂解后，离心后，您可能会在不溶性沉淀中观察到一个小的黑层。将上清液转移到聚碳酸酯超速离心管中，并向每个满管中加入 10 微升 200 毫摩尔 PMSF。
将样品在 100， 000 倍 g 和 4 摄氏度下离心 1 小时。在旋转结束时，应可以看到四个层。一种坚硬的透明颗粒，主要含有核糖体复合物;富含脂质的柔软颗粒;一个大而透明的黄色层，包含细胞的大部分可溶性蛋白质和复合物;以及由脂质组成的鳞状顶层。
在 4 摄氏度的冷藏室中，使用 1 毫升移液器尽可能多地去除顶部鳞状脂质层并丢弃。使用 10 毫升血清移液管回收大部分透明黄色层。然后，使用 1 毫升移液器为避免干扰底部两层，回收该层的最后几毫升。
从 40 克湿细胞沉淀中，通常回收大约 48 毫升的中间层。根据文本方案制备 IgG 琼脂糖凝胶后，将 IGG 树脂与中间相上清液和每 40 克细胞两片小型蛋白酶抑制剂片剂混合。然后放在 4 摄氏度的旋转器上 2 小时。
这是 IgG 批量解决方案。通过切开色谱柱的末端以产生平坦的开口，制备两个 10 mL Polyprep 色谱柱。将 24 mL 悬浮 IgG 树脂浆液或分批溶液倒入每根色谱柱中，并在重力作用下沉淀。
这相当于 200 μL 的填充 IgG 填料。如果沉淀时间超过 30 分钟，则中间相可能已被脂质污染。沉降完成后，使用四个连续的 10 mL 体积的 IgG D150 缓冲液清洗填充柱。
要在色谱柱上进行烟草蚀刻病毒或 TEV 蛋白酶切割，请密封色谱柱底部并加入 1 毫升 IgG D150 缓冲液和 100 微升 TEV 蛋白酶。密封色谱柱顶部，使用 750 RPM 和 18 摄氏度的热混合器混合 20 分钟。重新悬浮树脂并再次混合 20 分钟。
然后重新悬浮并重复第三次 20 分钟混合。将色谱柱返回 4 摄氏度，并利用重力洗脱蛋白质复合物。然后，加入 200 μL IgG D150 以洗脱死体积。
根据文本方案制备钙调蛋白亲和树脂后，将钙调蛋白结合缓冲液和样品加入树脂中，并使用试管旋转器在 4 摄氏度下孵育 1 小时。通过切割塔的末端以形成一个平坦的开口，每 100 μL 钙调蛋白浆液制备一根 2 mL 的 Polyprep 色谱柱。该方案详细说明了所选的特定缓冲液和停留体积，以保持复合物的浓度并最大限度地缩短其填料停留时间。
如果培养体积发生变化，建议更改重力柱的树脂和缓冲液体积以应对变化。用不超过 100 μL 的钙调蛋白浆液填充色谱柱，并在重力作用下，使用 5 mL 钙调蛋白结合缓冲液洗涤填料 3 次。使用 200 μL 钙调蛋白洗脱缓冲液，洗脱蛋白质 3 次。
然后，密封色谱柱底部，加入 20 μL 洗脱缓冲液并孵育 2.5 分钟，然后松开密封，让蛋白质在重力作用下洗脱。再次密封层析柱底部，加入 200 μL 洗脱缓冲液，然后孵育 5 分钟。然后，解封色谱柱底部并洗脱溶液。
对于第六次也是最后一次洗脱，密封色谱柱底部并与洗脱缓冲液孵育 10 分钟。然后，解封并洗脱。进行纯化后分析并根据文本方案储存样品。
如图所示，按照已发表的方案对复合物进行初始 TAP 纯化，得到的复合物在银染凝胶上迁移为三个条带。TAP 方法的多轮优化为我们提供了一个复合物，该复合物在天然凝胶上迁移为单个条带，表明组装更均匀。与天然凝胶结果一致，使用针对复合物的 TAP 抗体进行蛋白质印迹，根据已发布的方案纯化，检测到 TAP 标记蛋白 SNU-71 的蛋白水解。
TAP 方法的修改显着降低了蛋白水解量，因为 U1 snRNP 复合物中的几乎所有 17 种蛋白质都通过 SDS-PAGE 分离并通过多质谱法进行阳性鉴定。负染色电子显微镜显示 TAP 第一步和第二步后成功纯化的单分散颗粒。相反，当纯化不成功时，没有观察到正确大小的颗粒。
在纯化颗粒的草坪上评估最终的复合物质量，如图所示，这些颗粒在负染 EM 原始图像中显示为单分散。此外，颗粒的类平均值揭示了明显的特征，表明样品可能适合进行结构研究。一旦掌握，该方案可以在解冻冷冻裂解细胞粉末后 10 至 12 小时内完成。
在遵循此方案时，重要的是要确保所有溶液都不含蛋白酶和核酸酶，并快速发挥作用以防止复合物聚集或解离。观看此视频后，您应该了解如何纯化具有合适质量的天然复合物以进行结构研究，以及如何评估是否已实现。
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概述
本协议概述了一种优化的串联亲和纯化（TAP）方法，用于从细胞提取物中分离天然大分子复合物。它强调评估纯化样品的结构质量对于生物物理研究的重要性。
关键研究组成部分
科学领域
- 蛋白质组学
- 结构生物学
- 生物物理研究
背景
- TAP广泛用于从真核细胞中分离天然复合物。
- 该方法在纯化过程中确保了组成的均一性。
- 纯化在近生理缓冲条件下进行。
- 结构质量评估是该协议的组成部分。
研究目的
- 为结构分析纯化天然大分子复合物。
- 提供纯化过程中评估样品质量的详细指南。
- 实现快速和简单的纯化过程。
使用的方法
- S. cerevisiae细胞的离心。
- 使用冷却的裂解缓冲液进行细胞悬浮。
- 将细胞悬浮液转移到锥形离心管中。
- 用裂解缓冲液清洗离心瓶。
主要结果
- 成功纯化天然复合物。
- 在整个过程中维持样品的结构完整性。
- 展示了纯化复合物的组成均一性。
- 为生物物理研究提供了可靠的方法。
结论
- TAP方法有效用于分离天然复合物。
- 结构质量评估对于成功纯化至关重要。
- 该协议可以增强对大分子结构的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Purifying native macromolecular complexes with compositional and structural homogeneity is critical for advancing structural biology and biophysical studies in drug discovery. The optimized Tandem Affinity Purification (TAP) method enables reliable isolation of large assemblies suitable for high-resolution electron microscopy, directly impacting early discovery and target validation. This capability supports predictive confidence and de-risks structural characterization at key inflection points in the biopharma pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables isolation of native complexes under near-physiological conditions for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by ensuring structural and compositional homogeneity of assemblies.
- Facilitates predictive confidence in downstream structural and functional studies.
Screening & Assay Development
- Prepares structurally validated complexes for use in biophysical and screening assays.
- Improves assay reproducibility by providing homogeneous and concentrated samples.
- Enables quantitative assessment of complex integrity for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural quality control with requirements for electron microscopy-based studies.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by ensuring sample suitability for advanced structural analysis.
- Reduces risk of late-stage failure due to sample heterogeneity or instability.
Pipeline & Workflow Integration
This TAP-based purification method integrates at the interface of early discovery and structural biology, enabling transition from target identification to lead characterization and preclinical research.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing and pathway clarification through isolation of intact native complexes.
- Screening: Delivers reproducible, homogeneous samples for assay development and compound screening.
- Analytics: Supplies quantitative readouts via gel electrophoresis, western blotting, and electron microscopy to compare sample quality.
- Translational Research: Ensures structural integrity for studies bridging discovery and preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol adaptable to diverse macromolecular assemblies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of complex purification workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by ensuring sample quality early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification and structural biology techniques.
- Demands access to centrifugation, affinity chromatography, and electron microscopy infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of buffer conditions and handling protocols.
- Adaptable to various model systems with protocol modifications for complex-specific requirements.
- Dependent on rapid processing and protease/nuclease-free conditions to maintain sample integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Harvesting S. cerevisiae Cells
1:44
Lyse Cells and Lysate Clarification
4:43
Resin Equilibration and Binding and On Column TEV Cleavage
6:47
Packing and Eluting from Calmodulin Resin
8:20
Results: TAP Purification of U1 snRNP Complex in S. cerevisiae
9:55
Conclusion
