Name: 本机配合物的净化对结构研究使用串联亲和标签法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学习串联亲和标签法纯化酿酒酵母天然大分子复合物用于结构生物学研究。本方案可在近生理条件下快速纯化并评估样品结构质量，确保复合物组成均一性，为生物物理学研究提供可靠方法。

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作者感谢 Nikolaus Grigorieff 提供的支持与建议。感谢 Anna Loveland、Axel Brilot、Chen Xu 和 Mike Rigney 在讨论及电镜技术方面给予的指导。本研究由美国国家科学基金会资助，项目编号 1157892。布兰迪斯大学电镜设施由美国国立卫生研究院资助项目 P01 GM62580 支持。

注意：以下方案设计用于从 4 L 细胞培养物（约 40 g 湿重细胞）中纯化复合物。所有缓冲液配制完成后应于 4 °C 保存，并在配制后一个月内使用。还原剂和蛋白酶抑制剂仅在使用前加入缓冲液中。
1. 用于串联亲和纯化的全细胞提取物的制备&#160;
<ol>
	<li>酿酒酵母（S. cerevisiae）细胞的培养
	<ol>
		<li>将所需TAP标签的S. cerevisiae菌株从保存状态（-80 °C）划线接种至酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）平板上。在30 °C条件下培养3至5天，直至酵母菌落呈现白色且呈绒毛状。</li>
		<li>从平板上取约2 mm2的新鲜菌落，接种至装有10 ml YPD培养基的50 ml圆锥形聚丙烯离心管中。于180转/分钟（rpm）振荡培养过夜（30 °C）。</li>
		<li>按每升YPD培养基加入2 ml过夜培养物的比例，接种至2 L锥形瓶或三角烧瓶中。于180 rpm、30 °C条件下振荡培养。监测细胞在600 nm波长下的光密度（OD600），直至进入对数生长后期，OD600达到1.8至2.0，通常需20至24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集S. cerevisiae细胞
	<ol>
		<li>在4 °C条件下，以5,400 × g离心15分钟收集细胞。</li>
		<li>迅速倒去上清液，将细胞置于4 °C或冰上保存。</li>
		<li>每升细胞沉淀加入2 ml预冷的裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0；300 mM NaCl；10 mM KCl；0.2 mM EDTA，pH 8.0；5 mM咪唑，pH 8.0；10%甘油；0.1% v/v NP-40）。通过轻轻旋转或使用10 ml移液管反复吹打使细胞重悬。 
		注：NP-40在复合物质量和纯化后分析中的重要性将在下文讨论。</li>
		<li>将细胞悬液转移至预先置于冰上的空50 ml圆锥形聚丙烯离心管中。用额外2 ml预冷裂解缓冲液冲洗原离心瓶，并将冲洗液一并加入50 ml离心管中的细胞悬液中。</li>
		<li>通过称量离心管总重并减去空管重量及所加裂解缓冲液的重量，计算细胞沉淀的湿重。 
		注：1升OD600为1.8的细胞培养液所得细胞湿重约为10 g。</li>
		<li>在50 ml圆锥形聚丙烯离心管中制备液氮浴。用5 ml注射器吸取细胞悬液，连接16号针头。通过推动注射器使细胞悬液经针头滴入液氮中，形成细胞&#34;液滴&#34;，实现快速冷冻。冷冻速率应控制在约1分钟/毫升。</li>
		<li>将冷冻的细胞液滴于-80 °C保存，或直接进行下一步裂解操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解与裂解液澄清
	<ol>
		<li>使用咖啡研磨机裂解酵母细胞。每次研磨25秒，共研磨8至9次，过程中持续摇动研磨机。使用前需用液氮预冷研磨机。每研磨两次后，向研磨腔内加入少量液氮，待其完全蒸发后再继续。</li>
		<li>根据需要使用经液氮预冷的刮刀搅拌，防止细胞结块。注意避免细胞解冻，否则易导致结块。裂解完成后，细胞应呈细腻的白色粉末状。单次处理量最多可为4 L酵母培养物所得细胞沉淀（约40 g）。 
		注：关于裂解方法的观察将在下文讨论。</li>
		<li>使用血细胞计数板或其他细胞计数方法评估细胞裂解程度。为获得充分分析结果，应采集以下样品：（1）裂解前；（2）四轮裂解后；（3）裂解完成后。取样时，用经液氮冷却的刮刀取少量细胞，置于1.5 ml离心管中。</li>
		<li>待细胞完全解冻后，取5 µl细胞悬液与495 µl水混合。若观察到40%至60%的细胞裂解率，即可进入下一步操作。 
		注：关于长时间裂解影响的观察将在下文讨论。</li>
		<li>当确认达到充分裂解后，可将裂解后的细胞粉末于-80 °C保存，或直接进入下一步。</li>
		<li>准备两个50 ml圆锥形聚丙烯离心管，每管加入15 ml裂解缓冲液，并添加1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）、1 mM二硫苏糖醇（DTT）以及市售的蛋白酶抑制剂混合物。 
		注：若观察到明显的蛋白降解现象，建议使用蛋白酶缺陷型菌株。</li>
		<li>使用经液氮冷却的刮刀，将冷冻的裂解细胞粉末分批加入上述已准备好的50 ml离心管中。逐步将细胞粉末加入含有还原剂和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。</li>
		<li>在室温下轻轻旋转50 ml离心管，使细胞逐渐解冻并溶解，同时避免产生气泡。随着细胞粉末的溶解，继续添加剩余的细胞固体。</li>
		<li>向两个50 ml离心管中分别添加细胞粉末，直至每管细胞量约达20 g或全部加完。持续旋转至50 ml管中无可见冷冻细胞团块，整个过程约需50分钟。</li>
		<li>将细胞裂解液在4 °C条件下以25,000 × g离心20分钟。充分裂解的样品可能出现少量黑色沉淀。</li>
		<li>将50 ml上清液转移至聚碳酸酯超速离心管（使用26.3 ml规格），每满管加入10 µl 200 mM PMSF。</li>
		<li>在4 °C条件下以100,000 × g离心1小时。离心后应可见四层，自下而上分别为：（1）坚硬透明的沉淀层，含核糖体复合物；（2）柔软富含脂质的沉淀层；（3）大量透明微黄色层，含细胞中大多数可溶性蛋白及复合物；（4）顶部呈“鳞片状”的脂质层。</li>
		<li>所有后续操作均应在4 °C冷室中进行。使用1 ml移液器尽可能去除顶部“鳞片状”脂质层并弃去。用10 ml移液管回收大部分黄色透明层。</li>
		<li>使用1 ml移液器回收该层最后几毫升液体，以避免扰动底部两层。从40 g湿重细胞沉淀中，通常可回收约48 ml中间层液体，并去除/弃去约8 ml脂质层。 
		注：脂质的存在会显著阻碍层析纯化流程，并可能影响复合物质量，下文将进一步讨论。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 柱纯化步骤 1：IgG 层析
<ol>
	<li>树脂平衡与结合
	<ol>
		<li>为每40 g细胞沉淀准备300 µl IgG Sepharose悬浊液。将1 ml移液枪头末端剪去，以便吸取悬浊液。用IgGD150缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0；150 mM NaCl；150 mM KCl；1 mM MgCl2；5 mM 咪唑，pH 8；0.1% v/v NP-40；1 mM DTT；每50 ml缓冲液加入一片蛋白酶抑制剂片剂）洗涤/平衡IgG树脂三次，每次5 ml。
		<ol>
			<li>每次洗涤间以160 × g离心（4°C）使树脂沉淀，并弃去上清液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将IgG树脂与中层上清液以及每40 g细胞加入两片小型蛋白酶抑制剂片剂，在适当旋转仪上于4°C旋转孵育2小时。此即为IgG批次溶液。</li>
		<li>通过将柱子末端剪成平口，准备两个10 ml聚丙烯柱用于后续操作。为加快重力流下的装柱和洗涤过程，每个10 ml柱中装入的树脂体积不超过200 µl（压紧后）或约25 ml IgG批次溶液。</li>
		<li>将IgG批次溶液倒入柱中，静置使其依靠重力沉降。若沉降时间超过30分钟，则很可能在从离心管中回收中层相时存在脂质污染。</li>
		<li>用IgGD150缓冲液以每次10 ml连续洗涤装好的柱子四次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>柱上TEV蛋白酶切割
	<ol>
		<li>封闭柱子底部，加入1 ml IgGD150缓冲液和100 µl TEV蛋白酶（0.6 mg/ml储存液，实验室自制的S219V突变型TEV蛋白酶）。封闭柱子顶部，使用温控混合仪在18°C、750 rpm条件下混合20分钟。重新悬浮树脂后再次混合20分钟，重复一次，总共孵育1小时。 
		注意：必须将孵育时间控制在最低限度。</li>
		<li>将柱子放回4°C，依靠重力洗脱蛋白/复合物。再用额外200 μl IgGD150缓冲液洗脱柱内死体积。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 柱层析纯化步骤2：钙调蛋白亲和层析
<ol>
	<li>树脂平衡与结合
	<ol>
		<li>每40 g细胞沉淀准备200 µl钙调蛋白亲和树脂。用5 ml钙调蛋白结合缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0；150 mM NaCl；10 mM KCl；1 mM MgCl2；5 mM 咪唑，pH 8；2 mM CaCl2；0.1% v/v NP-40；10 mM β-巯基乙醇）洗涤树脂三次，每次洗涤后在160 × g（4 °C）离心收集树脂。</li>
		<li>向每1 ml IgG洗脱液中加入3体积的钙调蛋白结合缓冲液。为维持钙离子浓度恒定，需补充CaCl2和β-巯基乙醇，以弥补IgG洗脱液中这些成分的缺失。最终浓度应为2 mM CaCl2和10 mM β-巯基乙醇。</li>
		<li>将样品加入钙调蛋白树脂中，使用试管旋转仪在4 °C下孵育1小时进行结合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>钙调蛋白树脂的装柱与洗脱
	<ol>
		<li>每100 µl钙调蛋白浆液准备一个2 ml聚丙烯柱，通过剪切柱底端形成平整开口。每根柱子装载不超过100 µl钙调蛋白浆液，以尽量减少样品在洗脱过程中与树脂的接触量。</li>
		<li>依靠重力装填柱子，并用5 ml钙调蛋白结合缓冲液洗涤柱内树脂三次。</li>
		<li>加入200 µl钙调蛋白洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0；150 mM NaCl；10 mM KCl；1 mM MgCl2；5 mM 咪唑，pH 8.0；4 mM EGTA，pH 8.0；0.08% v/v NP-40；10 mM β-巯基乙醇）进行蛋白洗脱。重复加入200 µl钙调蛋白洗脱缓冲液共六次。</li>
		<li>对于第1至第3次洗脱，将洗脱液体积加入柱子后立即收集洗脱液。对于第4次洗脱，封闭柱子底部，与洗脱缓冲液孵育2.5分钟，然后打开并让其依靠重力洗脱。对于第5次洗脱，孵育5分钟后打开并洗脱。对于第6次洗脱，孵育10分钟后打开并洗脱。 
		注意：复合物的完整性可能在不同洗脱组分间有所差异（参见代表性结果部分）。</li>
		<li>使用适当的微量透析方法，分别对第2至第6次洗脱液进行过夜透析。将各组分在透析缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0；150 mM NaCl；10 mM KCl；1 mM MgCl2；5 mM 咪唑，pH 8；10 mM β-巯基乙醇）中透析。 
		注意：NP-40几乎不会或完全不会透过透析膜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 评估复合物质量的纯化后分析
<ol>
	<li>天然凝胶电泳与银染
	<ol>
		<li>按照制造商说明，制备用于分析复合物的4 - 16%预制天然凝胶。使用适当的分子量蛋白标准品，并将每种透析后的钙调蛋白洗脱组分/级分各15 µl上样至凝胶中。</li>
		<li>在150 V条件下电泳约3小时（4 °C）。</li>
		<li>对凝胶进行银染以评估六个洗脱组分的质量。或者，可使用灵敏度相当的商用荧光染料。在此阶段，复合物的浓度极有可能低于考马斯亮蓝染色的检测限。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>其他凝胶分析方法
	<ol>
		<li>若需通过Western blot检测蛋白，可采用SDS-PAGE或天然PAGE分离复合物，随后按照制造商说明，使用TAP标签抗体探测钙调蛋白结合肽（CBP）表位。</li>
		<li>使用特异性荧光染料，确认TAP纯化复合物中蛋白和/或核酸的存在及其完整性。注意避免这些染料之间的光谱重叠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>负染电子显微镜观察
	<ol>
		<li>使用在-15 mA条件下辉光放电30秒的连续碳膜载网，并在复合物加样前30分钟内使用。</li>
		<li>将3 µl TAP纯化的复合物（通常浓度为1 nM）加至载网上，孵育1分钟。从载网侧面吸去多余缓冲液。</li>
		<li>用20 µl去离子水液滴洗涤两次，每次洗涤之间从侧面吸液。</li>
		<li>将载网置于50 µl负染液滴上，孵育1分钟。推荐使用2%醋酸铀酰或0.75%甲酸铀酰进行染色。 
		注意：铀盐及其溶液具有弱放射性并含有重金属，应小心操作；所有接触过此类溶液的材料均须按照机构推荐的废弃物处理指南进行处置。</li>
		<li>将载网转移至新鲜的50 µl负染液滴上，不吸液，孵育1分钟后从侧面吸液，最后空气干燥并进行观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冷冻电子显微镜（cryo-EM）观察
	<ol>
		<li>对TAP纯化的复合物进行冷冻电镜分析，但可能需要根据制造商方案进行优化。 
		注：高浓度去垢剂的存在可能会影响实验进展，相关内容将在下文讨论。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 复合物储存
<ol>
	<li>准备复合物以供储存
	<ol>
		<li>如有需要，使用具有合适分子量截留值的离心过滤器浓缩复合物。以14,000 × g离心，每次1分钟，直至达到所需浓度。 
		注意：在浓缩过程中，NP-40的浓度会随之升高，因其无法通过滤膜或透析膜。</li>
		<li>将复合物分装为30 µl每份，于液氮或干冰冷却的乙醇浴中快速冷冻，随后保存于-80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选：纯化后去除去垢剂</li>
</ol>
注意：某些应用中，去垢剂（如 NP-40）的存在及其浓度高于临界胶束浓度时，可能会阻碍或抑制实验进程。下文将讨论从方案中去除 NP-40 或以其他添加剂或共溶剂替代所带来的影响。若不希望使用 NP-40，可选择使用市售的去除产品，例如 Bio-beads。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>使用透析缓冲液预平衡市售的去垢剂吸附珠。每 30 μl 复合物（通常浓度为 10 nM）加入五个吸附珠，充分混匀。</li>
	<li>将步骤 5.2.1 中已平衡的吸附珠与 TAP 纯化的复合物在冰上孵育 15 分钟。去除去垢剂后，应在数小时内使用该复合物。</li>
</ol>

<ol><li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

TAP 方法利用两种标签，在实现与亲和树脂紧密且特异性结合的同时，尽可能维持接近生理状态的溶液条件。这种平衡有助于在纯化后保持标签蛋白与其相互作用因子之间稳定结合，以便进行后续表征。此外，目前可从商业渠道获得单个 TAP 标签标记的开放阅读框（ORF），因此研究者可以获得任意含有标签蛋白的酵母菌株，用于研究任何酵母复合物。保持复合物完整性，以及能够利用资源测试复合物中不同亚基的标签蛋白在纯化中的应用，是采用 TAP 方法纯化天然复合物的两大优势。然而，原始的 TAP 方法实验流程并未设计用于确保所纯化的复合物在组成和结构上的均一性。因此，如上所述，TAP 方法已进行了相应的改进，以实现这一目标。
在TAP方法中，对多个步骤进行了评估，以确定纯化组成和结构均一复合物的最佳方法和条件。早期关键步骤之一是细胞裂解。该步骤需要在追求高产量（即最大程度裂解）与确保所获得复合物的高质量（即均一性）之间取得平衡。例如，探索了多种裂解酵母细胞的方法，包括使用珠磨仪、高剪切流体处理器和球磨机。使用成本较低的咖啡研磨机效率低于其他方法（裂解率为40 - 60%），但所分离和纯化的复合...

许多重要的细胞过程由大型蛋白质复合物及蛋白质-RNA复合物完成1进行此类复合物的生物物理和结构研究时，一个重要的瓶颈是难以获得质量合适的样品即，均一性）并达到适当浓度。从天然来源分离复合物具有诸多优势，包括保留亚基相关的转录后和/或翻译后修饰，以及确保复合物正确组装。然而，大型细胞复合物在细胞中通常拷贝数较低，因此纯化过程必须具有高效率，并在接近生理条件下进行，以维持复合物的完整性。从真核生物来源纯化复合物尤其具有挑战性，且可能带来高昂的成本。因此，高效并能获得均一复合物的策略或方法备受期待。
一种成功用于从真核细胞中纯化天然复合物以进行初步表征的策略是串联亲和纯化（Tandem Affinity Purification, TAP）方法2,3。TAP方法最初设计用于从芽殖酵母（S. cerevisiae）中纯化与相互作用因子形成复合物的天然蛋白质2。该方法利用两个标签，这两个标签以串联方式融合至同一蛋白编码基因序列。所选标签旨在平衡与亲和树脂紧密结合和选择性结合的需求，同时尽可能维持接近生理状态的溶液条件。这种平衡有助于在纯化后保持标记蛋白与其相互作用因子之间的稳定相互作用，以便进一步表征。基因组整合的TAP标签被置于蛋白编码基因的末端（C端），包含一段编码钙调蛋白结合肽（Calmodulin Binding Peptide, CBP）的序列，后接蛋白A（Protein A），使标记蛋白分子量增加略超过20 kDa。CBP较短，仅含26个氨基酸，在钙离子存在下可被约17 kDa的钙调蛋白（Calmodulin, CaM）识别，解离常数KD约为10-9 M4。蛋白A标签较大，由两个58个残基的重复序列组成，其间含有一段短连接肽。每个58氨基酸重复序列均可被免疫球蛋白G（IgG）识别，解离常数KD ~ 10-8 M5。在这两个标签之间插入了烟草蚀刻病毒（Tobacco Etch Virus）来源的内切蛋白酶TEV的识别位点6,7。如图1所示，在该方法的第一步亲和纯化中，TAP标记蛋白通过蛋白A部分与IgG树脂结合。随后加入TEV蛋白酶，在柱上特异性切割两个标签之间的位点，从而洗脱目标蛋白。此步骤至关重要，因为IgG与蛋白A之间的相互作用非常强，只能在变性溶液条件下才能有效破坏。去除蛋白A标签后，目标蛋白可在钙离子存在下与钙调蛋白（CaM）树脂结合，并通过加入金属离子螯合剂EGTA（乙二醇四乙酸）从树脂上洗脱（图1）。
TAP 方法一经推出，便被应用于一项大规模研究，以绘制出复杂相互作用的“图谱” S. cerevisiae8重要的是，由于此项工作的成果，已获得一个完整的酵母TAP标签开放阅读框（ORF）文库以及多个单独的TAP标签ORF9 可从商业来源获得。因此，可以获取任意含有标记蛋白的酵母菌株，用于研究任何酵母复合物。TAP方法还推动了TAP标签的多种改进或变体，包括：将其应用于从其他真核细胞以及细菌细胞中纯化复合物10,11；一种设计 &#34;分裂标签&#34;，其中蛋白质A和CBP被置于不同的蛋白质上12；并且改变了标签，以满足研究者的需求，例如该复合物对 Ca 的敏感性2+ 或 EGTA13.
近年来，仪器设备和实验方法的不断进步显著推动了电子显微镜（EM）在结构解析中的应用，使得大分子复合物的近原子分辨率成像成为可能14。然而，通过电子显微镜所能达到的分辨率仍取决于所研究复合物的质量。本研究采用TAP标签方法，从S. cerevisiae中纯化了U1 snRNP——一种由18个亚基组成（约0.8 MDa）、拷贝数较低、属于剪接体的核糖核蛋白复合物15,16。为获得均一且浓度足够的该复合物，已采取多个纯化步骤。文中描述了在纯化过程中各个阶段可能遇到的问题，并重点介绍了克服这些挑战的策略。通过对纯化各步骤进行细致评估与优化，最终获得的U1 snRNP在质量和数量上均适用于负染及冷冻电子显微镜（cryo-EM）研究。本文详细描述了一种用于结构研究中天然复合物纯化的优化TAP方法流程。

<table><tbody><tr><td>酿酒酵母TAP标签菌株</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1177</td><td>这是用于开发TAP实验方案的主要酵母菌株。其遗传背景为S288C: ATCC 201388: MATa, his3&amp;Delta;1, leu2&amp;Delta;0, met15&amp;Delta;0, ura3&amp;Delta;0, SNU71::TAP::HIS3MX6</td></tr><tr><td>咖啡研磨机</td><td>Mr. Coffee</td><td>IDS77</td><td>用于细胞裂解</td></tr><tr><td>血细胞计数板，Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td>用于评估细胞裂解程度</td></tr><tr><td>JA 9.100离心转子&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>用于收集酵母细胞</td></tr><tr><td>JA 20固定角转子</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>用于去除细胞提取物中的不溶性细胞成分</td></tr><tr><td>Ti 60固定角转子</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>用于进一步澄清可溶性细胞提取物</td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>R5355</td><td>温度可控的振荡器</td></tr><tr><td>Novex凝胶电泳系统</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgG树脂</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td>Sepharose 6 fast flow</td></tr><tr><td>钙调蛋白树脂</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>214303</td><td>亲和树脂</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物，迷你片剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>589297</td><td>mini cOmplete ultra EDTA-free片剂</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物，大号片剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5892953</td><td>cOmplete ultra EDTA-free片剂</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td></td><td></td><td>溶于异丙醇</td></tr><tr><td>2 ml Bio-spin层析柱</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7326008</td><td>用于填充和洗涤钙调蛋白树脂</td></tr><tr><td>10 ml poly-prep层析柱</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7311550</td><td>用于填充和洗涤IgG树脂</td></tr><tr><td>预制天然PAGE Bis-Tris凝胶</td><td>Life Technologies</td><td>BN1002</td><td>Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% 预制聚丙烯酰胺凝胶</td></tr><tr><td>NativeMark蛋白标准品</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC0725</td><td>用于天然PAGE的未染色蛋白标准品。银染凝胶加样7.5 &amp;mu;l，SYPRO Ruby染色凝胶加样5 &amp;mu;l</td></tr><tr><td>预制SDS-PAGE Bis-Tris凝胶</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td>Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% 预制聚丙烯酰胺凝胶&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PageRuler蛋白标准品</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>用于Western blotting的未染色蛋白标准品</td></tr><tr><td>SDS电泳缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td>1x NuPAGE MOPS SDS缓冲液</td></tr><tr><td>TAP抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAB1001</td><td>针对CBP标签的一抗</td></tr><tr><td>二抗</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31341</td><td>碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34042</td><td>5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/硝基蓝四氮唑&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>透析装置</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88401</td><td>Slide-A-Lyzer迷你透析装置</td></tr><tr><td>离心滤过装置，100 kDa截留分子量</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC5100008</td><td>Amicon Ultra-0.5 离心滤过装置，含Ultracel-100膜</td></tr><tr><td>去垢剂吸附珠</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>1523920</td><td>Bio-bead SM-2吸附剂</td></tr><tr><td>SYBR Green II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-7564</td><td>核酸染色用荧光染料。当与SYPRO Ruby共存检测时，激发波长为488 nm，发射波长为532 nm</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby</td><td>Molecular Probes</td><td>S-12000</td><td>蛋白染色用荧光染料。当与SYBR Green II共存检测时，激发波长为457 nm，发射波长为670 nm</td></tr><tr><td>铜网</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>G400-CP</td><td></td></tr></tbody></table>

使用串联亲和标签法纯化用于结构研究的天然复合物

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

亲和纯化方法已成功用于分离天然复合物以进行蛋白质组学表征。复合物的结构异质性和一定程度的组成异质性通常不会阻碍此类研究的进展。相比之下，用于结构表征的复合物应以组成和结构均一的状态进行纯化，且所需浓度高于蛋白质组学分析的要求。近年来，在利用电子显微镜解析大分子复合物结构方面取得了显著进展，这使得人们对纯化适用于电子显微镜结构解析的高质量和高产量天然复合物的方法产生了更高的兴趣。串联亲和纯化（TAP）方法已被优化，可用于从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中提取和纯化一个由18个亚基组成、分子量约为0.8 MDa的核糖核蛋白复合物，该复合物适用于负染和冷冻电子显微镜分析。本文详细介绍了对TAP方法所做的改进、进行这些修改的依据，以及评估复合物在组成和结构上均一性的相关策略。

采用改进的TAP方法从小鼠酵母（S. cerevisiae）中纯化了U1 snRNP，这是一种由18个亚基组成的核糖核蛋白复合物。按照已发表的方案2,3 进行初始TAP纯化后，所得复合物表现出异质性，在银染的天然聚丙烯酰胺凝胶上呈现三条条带（图2A）。经过多轮TAP方法优化，最终获得的复合物在天然凝胶上主要以单一一条带迁移，表明其组装更为均一（图2A）。通过使用荧光染料分别对蛋白质和核酸进行染色，证实所纯化的复合物中同时存在这两类生物大分子（图2B）。
通过SDS-PAGE和TAP标签抗体的Western印迹分析纯化的复合物（图3A）。与天然凝胶结果一致，按照已发表方案纯化的复合物显示出TAP标签蛋白（Snu71）发生蛋白水解。然而，对TAP方法进行改进后，蛋白水解程度显著降低。...

串联亲和纯化（TAP）方法已广泛用于从细胞提取物（主要是真核细胞）中分离天然复合物，以进行蛋白质组学研究。本文介绍了一种经过优化的TAP方法实验方案，适用于为结构研究纯化天然复合物。

亲和纯化方法已成功用于分离天然复合物以进行蛋白质组学表征。结构异质性及一定程度……

本方案的总体目标是纯化出适合进行生物物理研究的高质量天然大分子复合物。该方案不仅提供了一种纯化复合物的方法，还详细指导了在纯化过程中如何评估样品的结构质量。本方案的主要优势在于，能够在接近生理条件的缓冲体系中，简单而快速地纯化出天然组装的复合物，从而确保其组成均一性。按照文本方案，将酿酒酵母（S.cerevisiae）细胞离心并倾去上清液后，加入2 mL预冷的裂解缓冲液，轻轻涡旋或使用10 mL血清移液管吹打重悬沉淀。将细胞悬液转移至预先置于冰上的空的50 mL圆锥形聚丙烯离心管中。然后用额外的2 mL预冷裂解缓冲液冲洗每个离心瓶，并将冲洗液一并加入50 mL离心管中。在测定细胞沉淀的湿重后，于一个50毫升的圆锥形聚丙烯离心管内及周围制备液氮浴。接着，将悬浮细胞吸入一支5毫升注射器中，并在注射器上连接一根16号针头。然后，以大约每分钟1毫升的速度将细胞悬液通过注射器和针头滴入液氮浴中，使悬液形成液滴并迅速冷冻。为了裂解酵母细胞，首先使用液氮预冷一台咖啡研磨机。然后加入最多40克酵母细胞，研磨25秒，重复研磨八到九次。建议每次纯化不要超过10升的细胞培养物。这可以最大限度缩短纯化时间，并确保复合物的结构完整性得以维持。每研磨两轮后，向研钵中加入一层少量液氮，待其完全蒸发。为防止细胞结团，需使用经液氮预冷的刮勺不断搅拌细胞，避免细胞解冻。裂解后，细胞应呈现为细小的白色粉末状。根据文本方案，在检查细胞裂解情况并配制含有PMSF、DTT和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液后，使用经液氮冷却的刮勺，逐步将冷冻的裂解细胞粉末舀入已准备好的50毫升缓冲液离心管中。每次加入粉末后，轻轻旋转50毫升离心管（室温下操作），以使细胞逐渐解冻并溶解，同时防止气泡产生。随着细胞溶解，继续添加更多细胞粉末。待所有细胞加入后，持续解冻并溶解细胞，直至试管中观察不到任何冻存的细胞团块。此过程大约需要50分钟。接下来，将细胞裂解液在 25,000 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟。细胞裂解并完成离心后，可能在不溶性沉淀中观察到一层少量深色物质。将上清液转移至聚碳酸酯超速离心管中，并向每根装满的离心管中加入 10 µL 的 200 mM PMSF。在 100,000 × g 和 4 °C 条件下离心样品 1 小时。离心结束后，应可见四层：一个坚硬透明的沉淀，主要含有核糖体复合物；一个柔软、富含脂质的沉淀；一个较大、透明且略带黄色的层，含有细胞中大多数可溶性蛋白质和复合物；以及一个由脂质组成的片状顶层。在4摄氏度的低温室中，使用1毫升移液器尽可能去除上层鳞状脂质层，并弃去。使用10毫升血清移液器回收大部分澄清的黄色层。然后，使用1毫升移液器避免扰动底部两层，回收该层最后的几毫升液体。从40克湿菌体沉淀中，通常可回收约48毫升中间层。根据文本方案制备IgG Sepharose后，将IGG树脂与中间相上清液以及每40克细胞加入两片迷你蛋白酶抑制剂片剂混合，然后在4°C下置于旋转仪上孵育两小时。这是IgG批次溶液。通过剪切柱子的末端以形成一个平整的开口，制备两根10毫升的Polyprep柱。将24毫升悬浮的IgG树脂浆液或批次溶液倒入每根柱中，静置使其依靠重力沉降。这相当于200 µL的压紧IgG树脂。如果沉降时间超过30分钟，则中间相可能已被脂质污染。沉降完成后，用四份连续的10 mL IgG D150缓冲液洗涤压紧的柱子。为在柱上进行烟草蚀纹病毒（tobacco etch virus，TEV）蛋白酶切割，封闭柱的底部，加入1毫升IgG D150缓冲液和100微升TEV蛋白酶。封闭柱的顶部，使用热混仪在750 RPM转速和18摄氏度条件下混匀20分钟。重新悬浮树脂，并再次混匀20分钟。然后重新悬浮，并第三次重复20分钟的混合。将层析柱放回4摄氏度环境中，利用重力洗脱蛋白质复合物。接着，加入200微升IgG D150以洗脱死体积。根据文本方案制备钙调蛋白亲和树脂后，将钙调蛋白结合缓冲液和样品加入树脂中，并使用试管旋转仪在4 °C下孵育一小时。每100 µL钙调蛋白浆液准备一个2 mL多聚预装柱，通过切去柱子末端以形成平坦开口。该方案详细说明了特定的缓冲液体积和停留体积，旨在保持复合物的浓缩状态，并尽量减少其在树脂上的停留时间。如果改变了培养液体积，建议相应调整重力柱中的树脂和缓冲液体积以适应这一变化。使用不超过100 µL的钙调蛋白浆液装填层析柱，并通过重力作用，用5 mL钙调蛋白结合缓冲液洗涤树脂三次。每次使用200 µL钙调蛋白洗脱缓冲液，共洗脱蛋白质三次。然后，封闭层析柱底部，加入 20 微升洗脱缓冲液，孵育 2.5 分钟后打开封闭，使蛋白质在重力作用下洗脱。再次封闭层析柱底部，加入 200 微升洗脱缓冲液，孵育 5 分钟。随后，打开层析柱底部，洗脱溶液。第六次也是最后一次洗脱时，封闭柱子底部，用洗脱缓冲液孵育10分钟，然后解除封闭并进行洗脱。根据正文方案进行纯化后分析，并储存样品。如图所示，按照已发表的方案进行初步的TAP纯化后，该复合物在银染凝胶上呈现三条条带。经过多轮TAP方法优化后，我们获得的复合物在天然凝胶上仅显示一条条带，表明其组装更为均一。与天然凝胶结果一致，使用针对TAP标签蛋白SNU-71的TAP抗体进行蛋白质印迹检测发现，按照已发表方案纯化的复合物中存在TAP标签蛋白的蛋白水解现象。TAP方法的改进显著减少了蛋白水解的程度，U1 snRNP复合物中的17种蛋白质几乎全部通过SDS-PAGE分离，并通过多质谱技术被成功鉴定。负染电镜显示，在TAP方法的第一步和第二步纯化成功后，获得了单一分散的颗粒。相比之下，当纯化不成功时，则无法观察到正确大小的颗粒。最终复合物的质量通过纯化颗粒的菌苔进行评估，如图所示，这些颗粒在负染电镜原始图像中呈现单一分散状态。此外，颗粒的分类平均图像显示出清晰的特征，表明该样品可能适用于结构研究。一旦掌握该方案，在解冻冻存的裂解细胞粉末后，可在10至12小时内完成全部操作。在执行本方案时，必须确保所有溶液均不含蛋白酶和核酸酶，同时应迅速操作，以防止复合物发生聚集或解离。观看本视频后，您应掌握如何纯化出适合结构研究的高质量天然复合物，并了解如何评估纯化是否成功。

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