用于局部组织病理学分析的视网膜假体植入眼组织处理技术：第2部分 带视网膜固定钉的上视网膜植入物

带有硬质金属部件的视网膜假体与传统的组织学处理流程不兼容。本文介绍了一种用于评估固定在视网膜表面并由金属T形片固定的视网膜植入物邻近眼部组织健康状况的技术。该方法首先根据配套视频中描述的方案对眼球进行成核和固定，然后解剖获取包含植入物及视网膜T形片的组织样本。第二步是逐步对组织样本进行脱水，随后采用两步包埋法将样本以理想方向包埋于环氧树脂中。接下来，将最终的树脂块安装至特制夹具中，并逐步研磨，直至在理想层面暴露出穿过植入物及其周围眼组织的横截面。

最后一步是对暴露的组织进行表面染色，然后使用高倍解剖显微镜成像并拍照，以观察植入假体邻近区域的细胞结构。根据需要，这些步骤可重复多次。最终获得一系列穿过组织样本的横截面图像，包括原位植入物，可用于优化器械或手术的设计，并有助于评估特定假体的安全性。

与传统的基于刀片切割的组织学方法相比，该技术的主要优势在于，包括金属部件在内的植入心脏的物体可在手术过程中保留在原位，从而能够实现对植入物与组织界面的可视化观察。该方法可解答视网膜假体领域中的关键问题，例如评估植入式视网膜假体附近脆弱眼组织的结构完整性。在按照配套的 JoVE 视频所述完成眼球摘除和固定后，观察植入物及其固定于眼球外部的位置。

使用15度刀片，进行环形角膜切口，并移除角膜瓣以暴露眼球内部。注意，晶状体已在之前的晶状体切除术和玻璃体切除术中被移除，这是该视网膜上植入物手术过程的一部分。

然后进行消毒，插入虹膜及晶状体残留的Z纤维，以暴露后房内的视网膜上植入物及原位金属T。根据所使用的植入物及正在进行的研究，可在进一步解剖前移除不必要的组件。在本示例中，所评估的视网膜上电极阵列包含一个原型密封结构，其内含金刚石电极和电子元件，封装于一个贴合型硅胶载体中。

仔细解剖包含缝合钉及周围组织的样本，并保持所需的取向。使用精细解剖剪从眼球后部切取包含巩膜、脉络膜和视网膜的全层条状组织。在此处，使用手术刀通过精细解剖小心地取出钻石电极封装。

保留植入物的硅胶主体、视网膜固定钉以及铂金导线的残留部分。取样时应获得固定钉的纵向横截面，以显示与固定钉相邻的所有视网膜层次。然后将样品放回70%乙醇中。

在三天内通过逐步增加乙醇浓度的方式对样品进行脱水。首先，将样品在70%乙醇中脱水两次，每次两小时。接着，将样品在80%乙醇中脱水两次，每次两小时，然后第二天过夜，在90%乙醇中脱水两次，每次两小时。随后，将样品在100%乙醇中脱水两次，每次两小时，并再次过夜。

最后，用100%丙酮脱水处理样品，每次两小时，共两次。将样品从丙酮中取出，在室温下自然风干，并在光学显微镜下观察。软组织中的液体被去除后，会导致细胞塌陷和收缩。

在样品开始卷曲和塌陷之前，立即将其转移至环氧树脂中。何时发生组织卷曲和塌陷需通过经验来判断。为了将样品包埋于透明环氧树脂中，需将眼组织浸入适当可密封容器中的液化环氧树脂内。

将环氧树脂在真空腔中轻轻脱气，并在室温下静置过夜使其固化。使用带锯和刮刀通过修整固化后的环氧树脂块和样品，使样品以所需的方向包埋；将含有眼组织的修整后样品块置于新鲜液化的环氧树脂中，确保钉子的长轴与模具底部平行。使用少量瞬干胶将修整后的样品固定在样品 holder 底部。

将液态环氧树脂填充至样品 holder 中，如前所述进行脱气处理，然后静置过夜使其固化。接着将树脂嵌入研磨样品 holder 中，在开启水流的条件下，使用碳化硅砂纸以 230 至 250 转/分钟的手动速度对样品进行研磨。染色时，将研磨后的表面浸入甲苯蓝染液中 3 至 5 分钟，或直至染色显现。

用自来水冲洗样品后，使用较高倍率的解剖显微镜对样本的切面进行成像。为了观察视网膜的细胞层，可在环氧树脂顶部靠近样本上方的位置滴加一滴蒸馏水，以减少空气与环氧树脂界面处的衍射现象。

使用光纤鹅颈灯源照射样品。每次研磨去除预设厚度的样品后，重复进行研磨和成像步骤。样品台可实现的最小精确且可重复的研磨增量为 20 微米。

此过程逐步重复，直至在所需深度暴露出穿过植入物及周围眼组织的横截面。图中显示了在研磨过程中的不同阶段，紧邻钛金属视网膜固定钉的视网膜组织的示例图像。这些图像展示了固定钉纵向穿过眼球、穿透巩膜并邻接硅胶的切面，以及经甲苯胺蓝染色和未染色的视网膜组织。

在低倍和高倍镜下，硅油两侧均可观察到非人为因素导致的视网膜脱离和皱褶。缝合钉的杆部可见嵌入硅油中，其头部已穿透视网膜和巩膜。此处可以明显看到，在未染色的视网膜上，硅油两侧均存在非人为因素导致的视网膜脱离，且在低倍和高倍镜下均可观察到。

该示例显示，在固定钉附近存在视网膜结构紊乱，并因倾斜插入角度导致一侧视网膜受压。在进行此操作时，必须注意仔细包埋、定位和修整样本，以确保最终磨出的表面位于期望的平面上。此外，应在每个研磨阶段采集多张照片，因为今日无法恢复已研磨的样本。

该方法可用于研究视网膜假体的组织学特征，也可应用于其他使用硬质植入部件的系统中，以可视化装置与组织界面的情况，例如深部脑刺激植入物、血管支架或骨科假体。