Name: 试验样品为优化风暴超高分辨率显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 52 s
Description: 学习制备STORM超分辨率显微镜的荧光标记测试样品，使用Alexa 647染料和切换缓冲液获取30-50纳米分辨率的原始数据，并通过Rainstorm软件重建图像。该方法可优化成像条件并避免漂移等常见问题。

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我们感谢英国国家计量办公室化学与生物计量项目提供的经费支持。感谢Sebastian van de Linde、Miklos Erdelyi和Eric Rees在技术方面提供的建议和指导。感谢Miklos Erdelyi、Eric Rees和Max Ryadnov对本稿件提出的有益评论和讨论。

注意：在本实验方案中，某些步骤后附有提示和建议。标注“*1”表示注释1与该特定步骤相关，依此类推。
1. 玻璃的荧光葡聚糖包被
<ol>
	<li>向8孔盖玻片的每个孔中加入200 μl 0.01%的多聚-L-赖氨酸溶液，孵育10分钟。用移液器吸除液体，确保无残留液体。</li>
	<li>根据制造商说明重悬葡聚糖-Alexa 647*1，配制浓度为2 mg/ml的储备液。取该储备液0.25 μl加入25 μl去离子水中，稀释成20 μg/ml的溶液。</li>
	<li>为制备高密度的葡聚糖-Alexa 647包被溶液，取20 μl 20 μg/ml的溶液，用去离子水定容至200 μl。中等密度溶液则取2 μl 20 μg/ml溶液加入200 μl去离子水中（相当于原始储备液1:10,000稀释）。低密度溶液取0.2 μl 20 μg/ml溶液加入200 μl去离子水中（相当于原始储备液1:100,000稀释）。</li>
	<li>向每个孔中加入200 μl稀释后的葡聚糖-Alexa 647溶液，孵育10分钟。可延长孵育时间，以获得更密集的葡聚糖包被。孵育后吸除溶液，并用H2O洗涤三次*2。</li>
</ol>
注1：可使用其他葡聚糖-染料偶联物。若所需组合未商业化供应，也可自行将未偶联的葡聚糖与染料进行偶联。
注意2：相同的葡聚糖小室可在数周内重复成像，尽管荧光的均匀性可能会降低。建议在4 °C下无缓冲液保存。
2. 玻璃上的荧光肌动蛋白丝
<ol>
	<li>向每个孔中加入 200 μl 的 0.01% 多聚-L-赖氨酸溶液，孵育 10 分钟*3。用移液器吸除液体，确保无残留。</li>
	<li>向每个孔中加入 90 μl 通用肌动蛋白缓冲液（按制造商说明重新配制）。加入 10 μl 10 μM 预形成的肌动蛋白丝溶液和 1 μl 鬼笔环肽-Alexa 647（0.2 单位，按制造商说明溶于 1.5 ml 甲醇中），轻轻吹打混匀。孵育 30 分钟*4。</li>
</ol>
注意3：增加腔室内丝状溶液的体积会导致更少的丝状物结合到聚-L-赖氨酸包被的玻璃上。
注意 4：在 4 °C 下孵育时间长达 48 小时已测试并获得良好结果。一旦样品腔暴露于切换缓冲液中，肌动蛋白丝的成像质量会下降，因此不建议将同一样品使用超过一天。
3. 微球荧光珠作为定位标记
<ol>
	<li>将1 μl TetraSpeck微球稀释至200 μl PBS中并混匀。</li>
	<li>将稀释后的微球加入成像腔室，静置15分钟*5。成像前弃去溶液，并用PBS洗涤3次。</li>
</ol>
注意5——可调整稀释倍数和孵育时间以获得不同密度的微珠。本方案通常在20.5 μm × 20.5 μm的视野范围内产生3至10个微珠。
4. 表皮生长因子细胞染色
<ol>
	<li>在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中，添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素溶液，将 HeLa 细胞接种于成像培养皿中，培养至约 80% 汇合度。</li>
	<li>移除培养基，并用 PBS 洗涤。随后加入 500 μl 4% 多聚甲醛溶液（由 4 ml 10% 多聚甲醛溶液、1 ml 10X PBS 和 5 ml 水配制）固定 10 分钟。移除多聚甲醛溶液后，用 PBS 洗涤 3 次。操作过程中切勿让细胞干燥，并始终使用 PBS 缓冲液，以避免低渗应激。</li>
</ol>
警告——甲醛具有极高毒性。务必佩戴适当的手套、护目镜并穿上实验服。请查阅当地关于甲醛处置的相关规定。
<ol start="3">
	<li>根据制造商说明，将 EGF-Alexa 647 重悬，配制为 50 μg/ml 的储存液。取 2 μl 该储存液加入 200 μl 的 0.1% BSA 溶液（溶于 PBS）中。吸除细胞中的 PBS，加入 EGF 溶液，孵育 30 分钟。</li>
	<li>吸除溶液，用 PBS 洗涤 3 次，然后加入含 0.1% BSA（溶于 PBS）的封闭液，孵育 15 分钟。吸除封闭液，再用 PBS 洗涤 3 次，随后进行成像。</li>
</ol>
5. 换液缓冲液的制备
<ol>
	<li>配制酶储存液（A）：取10 μl过氧化氢酶（20 μg/ml）、20 μl 1 M Tris(2-羧乙基)磷酸盐盐酸盐（4 mM）、2.5 ml甘油（50%）、125 μl 1 M KCl（25 mM）、100 μl 1 M pH 7.5 Tris-HCl（20 mM）、5 mg葡萄糖氧化酶（1 mg/ml），用去离子水定容至5 ml。该溶液可分装为100份，每份50 μl，于-20 °C保存，可使用长达1年。</li>
	<li>配制葡萄糖储备液（B）：称取4 g葡萄糖（100 mg/ml），加入4 ml甘油（10%）和36 ml去离子水。该溶液可分装为100份，每份400 μl，于-20 °C保存，可使用长达1年。</li>
	<li>配制还原剂储存液（C）：称取113.6 mg MEA-HCl（1 M）并溶于1 ml去离子水20. 使用新鲜溶液或制备10份每份100 μl的等分试样，可于-20 °C保存并使用长达1个月（切勿重新冷冻等分试样）。</li>
	<li>成像前，将酶（A）、葡萄糖（B）和还原剂（C）的储备液按50 μl、400 μl、100 μl的比例混合，并用PBS定容至1 ml*6该缓冲液将清除氧气并形成还原性环境（100 mM MEA-HCl）*7最终pH值应在6.0 - 8.5范围内（通常无需调节）。*8.</li>
</ol>
注意 6 - 该缓冲液适用于碳菁类染料，如 Cy5 和 Alexa 647。
注7 - 最终酶浓度为50 μg/ml（5 单位/ml）的葡萄糖氧化酶和1 μg/ml（40-60 单位/ml）的过氧化氢酶。酶活性（单位）由供应商提供，可能存在差异。过氧化氢酶的计算假设在步骤5.4之后最终浓度为1 μg/ml时含有50单位的酶。包含类似除氧组分的各种缓冲液组成可参见文献21,30,40。有关缓冲液与染料组合的综述，请参见文献28,29。甘油和TCEP是-20 °C长期保存所必需的。
注意 8 - 若对肌动蛋白丝进行成像，需加入 2 mM MgCl2 和 0.2 mM ATP 以帮助稳定丝状结构。
6. 使用 Alexa 647 染料进行 STORM 数据的显微镜采集
<ol>
	<li>打开STORM/PALM显微镜，最好在成像前至少3小时开启，以使其达到热平衡。在此之前进行成像更容易出现漂移。</li>
	<li>将成像腔室插入显微镜载物台的样品 holder 中。确保样品牢固地固定在 holder 内，并且保持平整。</li>
	<li>从成像腔室中移除PBS，然后用开关缓冲液（switching buffer）加满至顶部。小心地将盖玻片覆盖在腔室上方，确保完全无气泡，并且整个腔室均被覆盖。若发现有气泡，需补充额外的缓冲液或PBS，否则缓冲液性能可能下降。</li>
</ol>
注意——为尽量减少样品相对于物镜发生侧向和轴向漂移的可能性，建议在成像前将样品和缓冲液在室温下平衡至少15分钟。
<ol start="4">
	<li>找到待成像的感兴趣荧光结构。选择所需的照明角度，此处推荐使用全内反射荧光（TIRF）或高度倾斜照明角度，因为这可通过减少离焦光来提高信噪比，尤其适用于细胞样本。在进行STORM成像前，先对该结构拍摄一幅衍射极限分辨率的参考图像。</li>
	<li>提高激发激光功率（激发波长约为640 nm），至约2 kW/cm2，同时采用相机设置：曝光时间为10毫秒，循环时间为约50 Hz（每秒帧数）。当荧光分子转变为稀疏闪烁模式后（大多数样本通常在10秒内达到），连续采集10,000帧图像*9。</li>
</ol>
注意：10,000 帧适用于本文所述的样品，但对于其他样品，可能需要将帧数增加至 50,000 或更多。
7. 使用 rainSTORM 从原始数据重建超分辨率图像
<ol>
	<li>在 MATLAB 中打开 rainSTORM.m 文件并运行（图 1A）。</li>
	<li>在 rainSTORM 窗口（图 1B）中，使用浏览按钮选择要分析的图像文件。该文件应为 .tif 格式（可使用 ImageJ 将其他文件类型转换为 tif 格式）。根据采集数据所用显微镜系统的原始数据调整像素宽度*10。其余参数保持默认值。</li>
</ol>
注10 - 典型的EMCCD相机像素尺寸为16 μm，因此在使用100倍物镜的系统中，图像上的像素尺寸为160 nm。在商用系统中，像素尺寸通常会在软件中显示。大多数定位显微镜的像素尺寸在100 nm至160 nm之间。
<ol start="3">
	<li>点击“处理图像”按钮，等待初步图像出现。处理所需时间取决于文件大小、计算机配置以及原始数据中候选眨眼信号的数量*11。</li>
</ol>
注11 - 使用配备Intel Xeon E5420 CPU的PC处理肌动蛋白和EGF数据的10,000帧序列分别耗时23秒和25秒。在相同计算机上若未使用MATLAB的并行处理工具箱，或使用不具备多核处理能力的计算机，则耗时分别为66秒和81秒。
<ol start="4">
	<li>要生成更新的超分辨率图像，请点击“Open Reviewer”按钮，此时将出现第二个窗口（图1C）。点击“Adjust Contrast”按钮，按需调整图像显示效果（图1D）。在某些图像较暗的情况下，应降低最大值。</li>
	<li>使用审阅窗口（图1C）生成有用的图像质量评估指标，并进一步优化超分辨率图像。将前三个质量控制参数分别设置为 4,000、0.1 和 0.8–2.0*12。更新每光子计数值，该值应基于光子校准测量结果，或采用相机制造商针对特定EM增益设置提供的光子校准曲线数值。这对于获得准确的精度和分辨率测量结果至关重要*13。</li>
</ol>
注意 12 - 信号计数根据亮度标准排除闪烁信号。该值越高，闪烁信号必须越亮才能被最终图像接受为一个定位点。该参数可能需要根据染料的光子输出量、曝光时间以及相机的灵敏度进行调整。容差参数会在信号与拟合的高斯分布之间存在显著平方误差时（例如双峰）排除闪烁信号。点扩散函数（PSF）宽度范围会在拟合的PSF宽度超出此范围时排除闪烁信号，即使用较窄的范围可排除失焦信号和大面积的荧光聚集物。使用较宽的范围可能导致最终图像中出现定位错误的伪影。实践中，建议首先使用定位精度截断参数进行初步质量控制。
注释13 - 有关分辨率度量的更多内容，请参见参考文献23,27。简而言之，通过了解每次闪烁产生的光子数量，可以计算每次定位的定位精度，从而推导出整幅图像的总体平均精度估计值。使用增益设置为200的Andor iXON DU-897E相机时，每光子计数值（Counts per Photon）为9.04。
<ol start="6">
	<li>调整定位精度截断值（图1C），以在最终图像中优化平均定位精度与定位数量之间进行权衡。根据数据质量和样本情况，建议取值为30–50 nm。可结合直方图和info.txt文件中的信息来做出此决策（图1F和图1G）。</li>
	<li>重构缩放因子（图1C）默认值为5，假设原始图像中像素宽度为160 nm，则将生成32 nm的超分辨率像素。若原始图像的像素大小为100 nm，则生成的超分辨率图像像素为20 nm。增大缩放因子可使最终图像中的超分辨率像素更小*14。</li>
</ol>
注14 - 定位显微镜的分辨率取决于可视化所需的平滑程度（例如，简单直方图重建的像素大小）以及定位精度。在实际操作中，重建像素大小通常应小于定位精度（参见信息文本文件中的“平均精度估计”指标 - 步骤6.11和6.12）。在这种情况下，由重建像素大小引起的分辨率损失将很小23,27。例如，图4E中行方向和列方向的平均精度估计值分别为16.1 nm和16.2 nm。本示例中采用16 nm的像素大小来可视化该数据（原始像素宽度为160 nm，重建缩放因子为10）。
<ol start="8">
	<li>修改限制帧范围（图1C），以将重建限制在原始数据的子集范围内，例如 [2001-inf] 将排除前 2,000 帧原始数据。</li>
	<li>按下“运行审阅器”按钮（图1C），以生成更新后的超分辨率图像（图1E）。</li>
	<li>按下“查看直方图”按钮（图1C），以显示图像质量指标（图1F）*15。</li>
</ol>
备注 15 - 右上角显示被接受的定位数量与相机帧编号关系的图表，以及右下角的汤普森定位精度直方图（图 1F），可用于指导定位精度截断值的审查选择。例如，采用 50 nm 的截断值将排除所有精度较差的定位，使其不被纳入最终的超分辨率图像中。
<ol start="11">
	<li>点击审阅器中的“保存图像”按钮（图1C），以保存所有这些数据*16。</li>
</ol>
注意 16 - 根据所选选项（总和图像、STORMdataImage、STORMprocessed、信息与直方图），可保存 3 至 5 个文件，参见 图 1G。STORM 处理后的图像以调整后的对比度和颜色映射显示。STORMdataImage 为灰度图像，其中每个像素的灰度值等于在该像素内识别出的定位点数量。
<ol start="12">
	<li>在检查数据后（例如 Info.txt 文件和直方图）后，如有需要，返回步骤 7.6，并使用不同的评审参数重复后续步骤。在步骤 7.11 中按下“保存图像”将覆盖先前保存的数据。</li>
</ol>
8. 盒子追踪与漂移校正（使用 rainSTORM）
<ol>
	<li>按照步骤 7.1 - 7.9 以常规方式生成图像。</li>
	<li>在审阅器中按下“Box Tracking”按钮（图 1C），然后在待审阅图像上的定位标记或感兴趣结构上点击并拖拽绘制一个方框。</li>
	<li>等待新图像出现，该图像将显示“Boxed Positions”（示例见 图 6B、6C 和 6F）。如需，可保存此图像。</li>
	<li>如果感兴趣对象为定位标记，则可通过点击“Set Anchor”按钮，随后点击“Subtract Drift”按钮来执行漂移校正。最后再次点击“Run Reviewer”以生成一幅新的 STORM 图像，该图像中所有定位点将根据定位标记的位置进行校正。最终审阅图像中的微珠位置将被删除。</li>
	<li>如果在最终的漂移校正图像中仍存在其他定位标记，可多次重复点击“Box Tracking”、“Delete Boxed”和“Run Reviewer”按钮以将其移除。</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

我们通过一些简单的测试样品以及免费提供的处理软件rainSTORM，展示了优化STORM超分辨率成像的可能性。这些工具和方法将为新用户提供有用的起点，并帮助有经验的用户增强对其显微镜系统及其在研究生物与细胞结构中应用的信心，从而实现前所未有的细节观察。通过结合具有已知或明确结构的样品与能够生成多种有用图像质量指标的算法（例如平均定位精度估计、定位数量以及直方图），可以改善图像质量，并提高对STORM成像过程的信心。由于存在多种商用和自行搭建的显微镜配置，数据采集并无统一适用的方法。此外，许多样品制备和图像采集步骤都可能影响最终图像，因此拥有软件工具和测试样品对于理解并优化STORM图像质量至关重要。
此外，这些方案可为排查可能出现的问题提供有用且更明确的方法。例如，葡聚糖样品是一种识别激光束是否错位或样品照明不均匀的有效手段。如果怀疑交换缓冲液可能失效，可通过一个非常简单的视觉检测方法来观察是否存在“闪烁”现象以进行判断。肌动蛋白丝可通过半高全宽（FWHM）比较来测量分辨率，同时有助于揭示漂移和定位错误等伪影。然而需要注意的是，基于定位的超分辨率方法对荧光分子密度较为敏感，尽管还存在其他影响因素，如曝光时间、帧率、激光功率以及图像处理方式，因此无法为某一台显微镜指定一个固定分辨率并假设所有图像都能达到该分辨率。但可以做到的是测量分辨率的多个方面，例如平均定位精度、定位数量和漂移27。即使无法在每次实验中都引入基准标记物，它们至少可用于表征显微镜系统及其环境，并更好地理解操作中的相关因素，例如开机后需要多长时间才能达到热平衡状态。除了校正横向漂移外，基准标记物还可用于表征和校正轴向漂移，但这需要使用像散透镜以及反馈机制，在图像采集过程中实时调整样品位置43。商用超分辨率系统通常会配备某种稳定性控制或焦点锁定机制，这可能是校正焦点漂移更为实用的解决方案。
除了使用葡聚糖非特异性地包被玻璃表面外，还可采用直接使用染料或其他偶联分子（如二抗）的方法。这些方法的局限性在于，无法确定结合到玻璃表面的分子数量。已有研究使用其他丝状结构，包括微管28和DNA21。然而，肌动蛋白因其尺寸极小且具有便捷的商品化试剂，成为一种颇具吸引力的替代选择，特别是当分叉或分支丝状结构之间的分离距离也可作为系统性能的有效测量指标时27。
尽管该领域近年来已取得进展，但在测试样品的开发方面仍有进一步提升的空间28,29,46,47。特别是多色成像在成像的三个主要方面——样品标记、图像采集（硬件）和软件（图像处理与对齐）——均面临诸多挑战。已有大量文献针对这些方面进行了探讨4-6，因此显然，合适的测试样品和方法对于生成并可靠地解读此类图像至关重要。事实上，最近有研究显示，dSTORM可用于对核孔复合体的高度对称结构进行双色成像和分辨，作者建议这将是评估色差校正性能的理想方法45。另一种有趣的方法是利用DNA折纸技术构建纳米标尺，从而实现荧光分子在特定亚衍射距离上的精确定位46，这为分辨率评估和距离测量提供了可行途径。然而，最终目标是将这些超分辨率技术应用于非理想化的样品，例如作为复杂三维结构的细胞。在此情况下，结合对技术更深入的理解、有助于用户采集数据、以适当方式处理数据并提供图像度量指标的软件工具，可能是最终的解决方案28,29,47,48。

近年来，一系列光学显微技术相继发展起来，通常被称为超分辨率显微技术或纳米显微技术，这些技术能够突破衍射极限，获得分辨率达100 nm甚至更高的图像1,2。自从2008年超分辨率显微技术被《自然-方法学》评为年度方法以来，基于定位的显微镜技术得到了迅速发展。例如，已开发出多色成像应用3-6、三维成像实现方案7-12，甚至实现了活细胞成像应用5,13-17。此外，随着这些系统逐步实现商业化，并逐渐从光学实验室走向细胞生物学家的实验台，其在生物医学问题研究中的使用和应用范围有望进一步扩大。
该家族的一个分支是基于定位的方法，其原理是通过逐个分子构建图像。为了实现这一点，必须将样品中大多数荧光分子关闭，使得在任意时刻仅有少数空间分离的分子处于激活状态。随后，这些分子被快速地反复开关，并采集大量图像，从而对分子群体的大部分进行成像，以亚衍射精度反映其底层结构。已有多种方法被报道，包括GSDIM18、PALM19、fPALM20、STORM21和RESOLFT22。通过使用可测定单分子检测位置的算法，例如采用高斯拟合23，能够以优于20 nm的精度确定分子的实际位置，相关算法包括rapidSTORM24,25、QuickPALM26、palm3d12和rainSTORM27。在对细胞或其他生物样品成像时，由于分子密度较高，因此必须采集数千帧这种闪烁且空间分离的信号图像，才能对相当比例的标记分子进行成像。
随机光学重建显微镜（STORM）以及高度相关的dSTORM和GSDIM方法属于基于定位的超分辨率成像技术，已证明可与商业化有机染料配合使用21。此后研究发现该技术适用于多种不同染料28-30，这使得该方法极具吸引力，原因在于荧光显微镜常用的免疫标记方法具有高度特异性和相对便捷的操作优势。因此，可方便地获得多种染料-抗体和染料-生物分子偶联物，这些偶联物有望用于基于定位的超分辨率成像。尽管STORM及其类似方法的基本原理相对简单，且从表面上看硬件配置和样品制备也较为直接，但在实际操作过程中仍有多步关键环节，对获得高质量、无伪影的超分辨率图像至关重要。
与所有显微技术一样，该过程可分为三个主要步骤：首先，样品制备；其次，图像采集；最后，图像处理和/或图像分析与解释。基于定位的超分辨率成像方法虽然提高了分辨能力，但也带来了一些新的问题和注意事项31-33。从样品制备开始，在进行免疫标记时，特别是使用一抗和二抗组合的间接免疫荧光标记，需注意荧光染料可能距离目标分子最远可达20 nm。以微管为例，这会导致观测到的微管直径为35–50 nm，而预期的真实直径为25 nm28,30。此外，标记密度应满足奈奎斯特采样标准，以获得高质量图像14。例如，若预期沿丝状结构的成像分辨率为20 nm，则每10 nm内至少应有一个染料分子27。尽管已有多种染料被报道可用于基于定位的成像方法，但染料的整体性能取决于至少四个关键因素：每次开关事件中检测到的光子数（即每次“闪烁”的亮度——越亮越好）、开关循环中的明暗平衡（染料在暗态与亮态之间的对比度——通常暗态比例越高越好）、存活比例（漂白率越低越好）以及开关循环次数（每个荧光分子的闪烁次数——对于高分辨率而言越多越好，但若用于分子计数，则每个荧光分子仅闪烁一次反而具有优势）。此外，任何特定染料的这些特性可能随缓冲体系条件和激光功率的变化而改变，使情况更加复杂28,29。同时，除了这些STORM特有的考虑因素外，还可通过优化样品制备来提高图像质量，方法与传统荧光显微技术类似，例如通过调整固定条件并使用淬灭试剂以减少自发荧光。此外，减少非特异性结合的荧光分子也至关重要，可通过调节标记物浓度、孵育时间以及封闭和洗涤步骤来实现。
图像采集的第二步同样至关重要。显微镜的最佳设置取决于染料种类、缓冲条件、标记密度以及样品类型，例如玻璃上的单层样品、细胞或组织样本。主要考虑因素包括相机曝光时间、帧数、照明角度（TIRF、HILO、Epi）和激光功率。目标是尽可能快速地采集到大量明亮且空间分离的闪烁信号。如果背景信号过高或闪烁信号不够明亮，即信噪比较差，重构算法将无法准确确定分子位置。除了提高定位精度（即每个分子位置的测量准确度）外，图像质量还依赖于足够多的定位事件。如果目标分子成像数量不足，原因可能是标记效率低、光漂白过度或采集帧数不足，则最终的超分辨率图像将呈现为点状且不连续，因为未满足奈奎斯特采样准则14,27。
最后，与标准的荧光显微技术相比，第三步——图像处理——尤为关键。目前有多种免费和商业化的算法可供选择，这在提供丰富选择的同时也带来了一定的困扰，即难以判断哪种算法最为适用。例如，如果原始数据中的闪烁信号在空间上分布清晰且彼此分离，则单分子拟合算法可以实现高精度和高效率，例如 rainSTORM27、rapidSTORM24,25、palm3d12 和 QuickPALM26 软件中提供的稀疏拟合算法。如果原始数据包含大量重叠信号，则可能更适用的算法包括 DAOSTORM34、3B35 和 deconSTORM36。此外，这些算法包含多种判定阈值，例如信号计数或每次闪烁的光子数，同时也提供多种不同的图像显示选项，例如采用平滑高斯函数可视化，或以像素网格直方图形式呈现，其中超分辨率图像的像素尺寸可由用户自行选定。所有这些选项都会影响最终图像的呈现效果，并对图像的解读与分析产生重要影响。
因此，我们提供了3个测试样本，旨在为初学者进行基于染料的定位型超分辨率实验（为简洁起见，下文统称为STORM）提供入门起点，同时也为经验丰富的用户提供进一步优化实验的参考。首先，可以在玻璃表面涂覆一层荧光标记的葡聚糖-染料偶联物。这种方法可快速简便地验证显微镜系统、染料及缓冲液是否能够正常产生闪烁荧光信号。随后，可通过rainSTORM分析平均定位精度及数量指标，比较不同缓冲条件、图像采集参数或测试不同染料的效果，从而进一步优化实验条件。其次，我们提供了一种在玻璃上制备肌动蛋白丝的简单方案，该结构可方便地使用鬼笔环肽-染料偶联物进行标记。这类结构非常适合用于分辨率测量27，通常以肌动蛋白丝的半高全宽（FWHM）作为分辨率的经验估计值37。需要注意的是，由于定位型超分辨率显微技术的分辨率取决于荧光分子亮度、背景噪声和定位密度27，而这些因素在不同样本之间以及同一样本内的不同图像之间并不恒定，因此分辨率会存在差异。肌动蛋白丝可用于演示潜在的伪影现象，例如错位定位和漂移，并展示如何利用rainSTORM软件功能识别这些问题。此外，我们还描述了如何使用荧光基准标记物来测量并校正漂移。第三，我们介绍了使用表皮生长因子（EGF）-染料偶联物对细胞进行染色的方法。EGF是评估超分辨率成像性能的有效指标，因为细胞膜表面的一部分受体会通过内吞作用进入细胞，形成直径约为50–150 nm的囊泡，这类结构属于亚衍射极限尺寸的结构27,38,39。

<table><tbody><tr><td>Labtek 成像腔室玻璃</td><td>Fisher</td><td>CBR-166-390E</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>倒置显微镜 </td><td>奥林巴斯</td><td>IX71</td><td>* 替代方案见下文</td></tr><tr><td>100 X TIRF物镜</td><td>奥林巴斯</td><td>UAPON 100XOTIRF</td><td>* 替代方案见下文</td></tr><tr><td>EMCCD相机</td><td>安道尔</td><td>iXon 897</td><td>* 替代方案见下文</td></tr><tr><td>640 nm 激光器</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td>*150 mW — 用于成像 Alexa 647 或 Cy5 染料</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>国家仪器公司</td><td></td><td>采集软件（控制硬件）</td></tr><tr><td>PC </td><td>戴尔</td><td></td><td>Windows XP（64 位），Intel Xeon E5420 CPU，16 GB RAM *仪器控制与图像处理</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>图像分析与处理 &lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij&quot; 目标=&quot;_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>rainSTORM</td><td>剑桥激光分析小组软件</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/资源&quot; 目标=&quot;_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>运行 rainSTORM</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/&quot; 目标=&quot;_blank">http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>*自建STORM/PALM显微镜示例</td><td></td><td></td><td>另见参考文献29 &lt;a href=&quot;http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope&quot; 目标=&quot;_blank">http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>*商用STORM/PALM超分辨率显微镜</td><td></td><td></td><td>Leica SR GSD、Nikon N-STORM、Vutara SR-200、Zeiss Elyra P.1、DeltaVision OMX Blaze（Monet 定位）—— 自建显微镜的替代方案</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;表1.&lt;/strong&gt; 材料 &amp;与设备 </td></tr><tr><td colspan="4">[页眉]</td></tr><tr><td>PBS（10倍浓缩液）</td><td>Fisher</td><td>VX70013065</td><td>1; 2; 3; 4</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td>1.1; 2.1</td></tr><tr><td>葡聚糖-Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>D-22914</td><td>1.2</td></tr><tr><td>通用肌动蛋白缓冲液</td><td>Cytoskeleton公司</td><td>BSA01</td><td>2.2</td></tr><tr><td>预先形成的肌动蛋白丝</td><td>Cytoskeleton公司</td><td>AKF99</td><td>2.2</td></tr><tr><td>鬼笔环肽-Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>2.2</td></tr><tr><td>TetraSpeck 微球（0.1 微米）</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>3.1</td></tr><tr><td>HeLa 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>4.1</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher</td><td>VX31966021</td><td>4.1</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>VX10500064</td><td>4.1</td></tr><tr><td>笔/步骤</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td>4.1</td></tr><tr><td>塑料培养皿</td><td>Invitrogen</td><td>734-0006</td><td>4.1</td></tr><tr><td>EGF - Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>E35351</td><td>4.3</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>4.3, 4.4</td></tr><tr><td>甲醛 - 10% 溶液，电子显微镜级</td><td>Polysciences</td><td>04018-1</td><td>4.2</td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma</td><td>C100</td><td>5.1</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>5.1</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>5.1</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>C4706</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>93352</td><td>5.1</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>C7528</td><td>5.2</td></tr><tr><td>MEA-HCl</td><td>Sigma</td><td>M6500</td><td>5.3</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G2289</td><td>5.1; 5.2</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;表2.&lt;/strong&gt; 试剂</td></tr></tbody></table>

优化storm超分辨率显微镜的测试样品

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM 是一种新近开发的超分辨率显微技术，其分辨率比标准荧光显微技术高出约10倍。然而，由于其成像方式与常规方法截然不同——通过逐个分子累积构建图像——用户在优化图像采集过程中面临一些显著挑战。为了帮助这一过程并加深对 STORM 工作原理的理解，本文介绍了三种测试样品的制备方法，以及获取和处理典型分辨率为30–50 nm的 STORM 超分辨率图像的技术流程。通过将这三种测试样品与免费提供的 rainSTORM 图像处理软件结合使用，可以获取大量有关图像质量和分辨率的信息。利用这些量化指标，即可从光学系统、样品制备、染料选择、缓冲液条件到图像采集参数等各个环节优化成像流程。我们还展示了若干导致图像质量下降的常见问题实例，例如样品在成像过程中发生移动所引起的侧向漂移，以及因标记密度问题导致的“定位错误”现象。

我们描述了三种测试样品的制备方法，以及如何利用它们优化和评估STORM显微镜的性能。通过这些示例，展示了如何采集原始数据，并进一步处理以获得分辨率为约30-50 nm的细胞超分辨率图像。

优化STORM超分辨率显微镜的测试样品

STORM 是一种新近开发的超分辨率显微技术，其分辨率比标准荧光显微镜高出近 10 倍。

本实验的总体目标是演示如何获取高质量的STORM超分辨率图像。首先，制备荧光标记的测试样品；其次，配制开关缓冲液，并将成像室用该缓冲液充满。接下来，在STORM显微镜上获取原始数据。最后一步是使用RAINSTORM处理软件从原始数据中重建超分辨率图像。最终，通过测试样品展示如何获得高质量的原始数据，这些数据可进一步处理，以在细胞中生成分辨率为30至50纳米的STORM超分辨率图像，相较于包括TIRF和共聚焦在内的传统荧光显微技术，分辨率提高了5到10倍。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为他们尚未意识到收集大量高质量稀疏连接的重要性。通过在正确的切换缓冲液中使用 Alexa 647 染料，这一过程将变得容易得多。该技术的可视化演示至关重要，因为获取高质量的原始数据对于生成 SPR 分辨率图像极为关键。该技术的原始视频序列看起来与其他任何形式的荧光显微镜完全不同。开始操作前，需对玻璃进行荧光葡聚糖包被：向八孔盖玻片的每个孔中加入200 µL的0.01%多聚赖氨酸溶液，孵育10分钟。10分钟后，用移液器移除多聚赖氨酸溶液，确保无残留液体稀释。将0.25微升浓度为2毫克/毫升的右旋糖酐Alexa 647储备液加入25微升去离子水中，配制成20微克/毫升的溶液，以制备高密度的右旋糖酐Alexa 647包被溶液。将20微升的20微克/毫升溶液用去离子水稀释至总体积为200微升。对于中等浓度溶液，将2微升溶液稀释至200微升去离子水中。对于低浓度溶液，稀释0.2微升。在200微升去离子水中，向每个孔中加入200微升稀释的Dextrin Alexis X 47溶液，孵育10分钟。可使用更长的孵育时间，这可能导致葡聚糖涂层更致密。最后，移除Dexter Xis X 47溶液，并用水洗涤三次。首先，在八孔板的每个孔中加入 200 微升 0.01% 多聚赖氨酸溶液，以制备玻璃上的荧光肌动蛋白丝。盖上盖玻片，孵育 10 分钟。用移液器吸除液体，确保无残留液体。向每个腔室中加入 90 微升按照制造商说明预先配制好的通用肌动蛋白缓冲液。然后加入 10 微升 10 微摩尔的预形成肌动蛋白丝溶液以及 1 微升 foid 和 Alexa 647，轻轻吹打混匀，室温孵育 30 分钟，以制备作为基准标记物的微球荧光珠。将 1 微升 tepec 珠稀释至 200 微升 PBS 中并混匀。将稀释后的珠液加入成像腔室，静置 15 分钟。孵育15分钟后，移除溶液，并在成像前用PBS洗涤三次。本实验使用培养至约80%融合度的细胞。移除培养基后，用PBS洗涤，然后加入500微升4%多聚甲醛溶液，固定10分钟。去除甲醛，并用 PBS 洗涤三次。切勿让细胞干燥，始终使用 PBS 缓冲溶液。为避免低渗应激，向 200 微升 0.1% BSA 溶液中加入两微升浓度为 50 微克/毫升的 EGF Alexa 647 储存液，然后将该溶液加入 HeLa 细胞中。室温孵育30分钟。移除溶液，用PBS洗涤3次。加入0.1% BSA封闭液，室温放置15分钟。随后，移除封闭液，并用 PBS 再洗涤三次，然后进行成像。成像前，通过将葡萄糖氧化酶和还原剂储存液按 50 微升、400 微升和 100 微升的比例混合来配制切换缓冲液，再加入 PBS 至终体积为 1 毫升。移除成像腔中的 PBS，然后用切换缓冲液加满至顶部。将盖玻片小心地覆盖在腔室顶部，确保完全无气泡且整个腔室均被覆盖。若发现气泡，需补充额外缓冲液或 PBS。否则，缓冲液性能可能下降。采集高质量的稀疏连接数据对于本实验的成功至关重要，因此请确保显微镜正确聚焦，并使用正确的成像参数。找到需要成像的感兴趣荧光结构。选择所需的照明角度。在这种情况下，建议采用平铺式或高度倾斜的角度，因为这可以通过减少失焦光线来提高信噪比，对细胞样品尤其有利。在进行STORM成像之前，先获取该结构的衍射极限参考图像。成像时，将激发激光增加至高功率，约为2千瓦/平方厘米，同时将相机设置为10毫秒曝光时间，循环时间约为50赫兹（即每秒50帧）。当荧光点阵列转变为稀疏闪烁模式后，采集 10,000 帧图像以开始重建。在 MATLAB 中打开 RAINSTORM M 文件，并在 rainstorm 窗口中运行该文件。使用浏览按钮选择要分析的图像文件。该文件应为 TIF 格式。调整像素宽度，以匹配用于获取数据的显微镜系统的原始数据。其他参数保留默认设置。点击“处理图像”按钮，等待初步图像出现。处理所需时间取决于文件大小、计算机配置以及原始数据中候选链接的数量。要生成更新的超分辨率图像，请按下“打开审阅器”按钮，此时将出现第二个窗口。按下“调整对比度”按钮，以按需更改图像显示效果。在某些图像非常暗的情况下，应降低最大值。使用审阅窗口生成有用的图像质量指标，并进一步优化超分辨率图像。将前三个质量控制参数保留默认值，分别为 5,000、0.1 和 0.8 到 3.5。更新每光子计数值。调整定位精度截断值，以在优化平均定位精度与定位数量之间进行权衡。在最终图像中，建议根据数据质量和样本情况选择30至50纳米的数值。重建缩放因子默认值为5，假设原始图像中的像素为160纳米，则会生成32纳米的超分辨率像素。如果原始图像的像素尺寸为100纳米，则将生成像素为20纳米的超分辨率图像。增加缩放因子可生成更小的超分辨率像素。在最终图像中，按下运行审阅者按钮以生成更新后的超分辨率图像。按下“查看直方图”按钮以显示图像质量指标。最后，在审阅器中按下“保存图像”按钮以保存所有这些数据。首先，以与之前演示相同的方式生成一幅图像，开始此操作流程。在审阅器中按下框选跟踪按钮，然后在审阅的图像上的定位标记上点击并拖动以绘制一个方框。等待新图像出现，新图像将显示框选的位置。如果感兴趣的对象是定位标记，可根据需要保存此图像。与本例相同，通过单击“设置锚点”按钮，然后单击“减去漂移”按钮来执行漂移校正。最后，再次单击运行审阅器以生成新的STORM图像。成功包被葡聚糖后应产生荧光单层，本图展示了典型的葡聚糖数据。衍射极限下的图像显示了在进行STORM成像前不同浓度的糊精。超分辨率重建图像的像素大小为25纳米。共采集了10,000张图像，帧尺寸为128×128像素，并展示了该序列中的单帧图像。在高浓度右旋糖酐条件下，荧光单分子层应呈现相对均匀的状态，如这些图像和视频片段所示。在较低浓度下，闪烁点将显得更稀疏且更清晰可见。在恒定激光照射下的图像采集阶段，由于无明显背景信号，随着成像时间的延长，闪烁点数量将逐渐减少，这可通过高密度样品中第2000帧与第8000帧的对比得到说明。高、中、低浓度葡聚糖样品的超分辨图像之间的主要差异在于定位点数量的递减。该图展示了每种葡聚糖浓度下三次10000帧序列的平均结果，误差线表示标准差。然而，荧光分子浓度、原始数据中的闪烁次数与定位点数量之间的比例关系并非简单的线性关系，如每帧接受的定位点数量的图表所示。在分子密度极高的情况下，使用滚动的100帧平均值时，无论成像何种样品，软件均无法成功地对分子进行定位。一个常见问题是在成像过程中，由于荧光物质在介质中扩散，导致图像上出现明亮但失焦的荧光晕染。通过在添加切换缓冲液之前增加使用 PBS 的洗涤步骤次数，或向腔室中添加新鲜的切换缓冲液，可以防止或去除这些游离的荧光分子。对每组图像序列的数据进行处理和比较，会得到截然不同的超分辨率图像。图 C 和图 D 分别是对应于图 A 和图 B 所采集数据构建的超分辨率图像。该图显示了每帧中被接受的定位分子数量，采用滚动平均法计算连续 100 帧的平均值。红线对应于背景较高的 A 和 C 风暴序列，蓝线对应于背景较低的 B 和 D 序列。第二幅图显示了与高背景和低背景数据相对应图像中被接受的定位数量。这三幅衍射受限图像展示了在加入切换缓冲液和进行风暴成像之前，附着在玻璃表面的预先形成的肌动蛋白丝的典型数据。可见不同长度的丝状结构。非常明亮的丝状结构通常是由多根丝状物缠绕在一起形成的。在采集阶段，选择单根且相对较亮的丝状结构，而非缠绕区域，可获得更高质量的图像。在细丝的整个长度上应观察到明亮且聚焦清晰的闪烁点。在采集阶段及后续的数据处理过程中，应观察到稀疏的闪烁现象。每帧的定位图像中应呈现一条细长且连续的细丝，并显示出逐渐减弱的趋势。通常，通过在 ImageJ 中使用“剖面分析”功能，对肌动蛋白丝的放大区域绘制一条直线，随后进行高斯拟合，以此将丝状结构的半高全宽（FWHM）作为分辨率的经验估计值。此处计算得到的 FWHM 为 43.2 纳米。当多个肌动蛋白丝出现分支或相互交叉时，可能会产生定位偏差问题，可通过处理帧的子集并比较前 5,000 帧和后 5,000 帧来识别该问题。使用前 5,000 帧生成的超分辨率图像呈现出不同的结果。图像中心可见大量定位点。然而，当使用后 5,000 帧时，这些定位点几乎不明显，仅剩下丝状结构，但由于图像中定位点数量较少，丝状结构呈现为一定程度的连续形态。如果怀疑密度过高导致闪烁，通过将图像与每帧的定位数据进行比较，可以强烈提示该问题发生在前几组帧中。前几组帧的平均每帧定位数超过10个，而最后几组帧的平均每帧定位数约为4个。STORM显微成像中的另一个潜在问题是漂移，即样品相对于物镜发生移动。尽管在图像采集阶段很难察觉，但在已知结构（如肌动蛋白丝）的超分辨率图像中可以检测到漂移现象。侧向漂移发生的首个迹象可能是结构尺寸大于预期。例如，与暴雨条件下的精度极限数据相比，半高全宽值相对较大：本例中为90纳米，而精度极限为67纳米。检测漂移更有效的方法是将定位结果作为时间的函数进行比较，即观察后期帧中的定位位置是否相对于早期帧发生了位移。这一点在使用颜色编码显示肌动蛋白丝时尤为明显。如图 B 和 c 所示，利用 RainSTORM 中的盒跟踪功能，定位点会根据其采集时所在的帧数以对应颜色显示。例如，采集序列早期的定位点为蓝色，而采集序列后期的定位点为红色。颜色的偏移表明已发生漂移，以便进行测量和校正。可使用直径为100纳米的荧光微球作为基准标记，编号一至四分别显示了单独裁剪并放大的微球图像。在一个示例中，在采集阶段的三分钟十秒内发生了约100纳米的相对严重漂移，此时可使用相同的框追踪功能对漂移进行颜色编码并确认其发生；在此示例中，四个微球显示出几乎相同的漂移行为，因此可以选择其中一个（此处为微球二）作为参考，并从其他微球中减去该漂移量。与图E对比显示，横向漂移已被校正。最后，使用表皮生长因子标记的HeLa细胞可提供一个关于图像分辨率的真实示例。在细胞中，图A显示了聚焦于细胞基底表面的HeLa细胞部分的衍射受限图像，其中黄色框标示了在图B和图C中放大的感兴趣区域，相比之下，衍射受限图像中的放大感兴趣区域则模糊不清。超分辨图像应显示簇状结构与偶尔孤立的单个像素的混合。这些簇状结构的直径约为100纳米，可能对应于正在形成的凹陷和囊泡。EGF主要通过该途径被下调并内吞，每帧的内吞定位数据如图D所示，并在图G中以图表形式呈现。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备一些简单的测试样品、采集数据以及重建高质量的STORM（随机光学重建显微镜）超分辨图像。这些方法将有助于避免一些常见的拟合陷阱（例如漂移），并帮助优化您的风暴实验。参见分辨率实验。

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生物学

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