优化STORM超分辨率显微镜的测试样品

本实验的总体目标是演示如何获取高质量的STORM超分辨率图像。首先，制备荧光标记的测试样品；其次，配制开关缓冲液，并将成像室用该缓冲液充满。

接下来，在STORM显微镜上获取原始数据。最后一步是使用RAINSTORM处理软件从原始数据中重建超分辨率图像。最终，通过测试样品展示如何获得高质量的原始数据，这些数据可进一步处理，以在细胞中生成分辨率为30至50纳米的STORM超分辨率图像，相较于包括TIRF和共聚焦在内的传统荧光显微技术，分辨率提高了5到10倍。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为他们尚未意识到收集大量高质量稀疏连接的重要性。通过在正确的切换缓冲液中使用 Alexa 647 染料，这一过程将变得容易得多。该技术的可视化演示至关重要，因为获取高质量的原始数据对于生成 SPR 分辨率图像极为关键。

该技术的原始视频序列看起来与其他任何形式的荧光显微镜完全不同。开始操作前，需对玻璃进行荧光葡聚糖包被：向八孔盖玻片的每个孔中加入200 µL的0.01%多聚赖氨酸溶液，孵育10分钟。10分钟后，用移液器移除多聚赖氨酸溶液，确保无残留液体稀释。

将0.25微升浓度为2毫克/毫升的右旋糖酐Alexa 647储备液加入25微升去离子水中，配制成20微克/毫升的溶液，以制备高密度的右旋糖酐Alexa 647包被溶液。

将20微升的20微克/毫升溶液用去离子水稀释至总体积为200微升。对于中等浓度溶液，将2微升溶液稀释至200微升去离子水中。对于低浓度溶液，稀释0.2微升。

在200微升去离子水中，向每个孔中加入200微升稀释的Dextrin Alexis X 47溶液，孵育10分钟。可使用更长的孵育时间，这可能导致葡聚糖涂层更致密。最后，移除Dexter Xis X 47溶液，并用水洗涤三次。

首先，在八孔板的每个孔中加入 200 微升 0.01% 多聚赖氨酸溶液，以制备玻璃上的荧光肌动蛋白丝。盖上盖玻片，孵育 10 分钟。用移液器吸除液体，确保无残留液体。

向每个腔室中加入 90 微升按照制造商说明预先配制好的通用肌动蛋白缓冲液。然后加入 10 微升 10 微摩尔的预形成肌动蛋白丝溶液以及 1 微升 foid 和 Alexa 647，轻轻吹打混匀，室温孵育 30 分钟，以制备作为基准标记物的微球荧光珠。将 1 微升 tepec 珠稀释至 200 微升 PBS 中并混匀。将稀释后的珠液加入成像腔室，静置 15 分钟。

孵育15分钟后，移除溶液，并在成像前用PBS洗涤三次。本实验使用培养至约80%融合度的细胞。移除培养基后，用PBS洗涤，然后加入500微升4%多聚甲醛溶液，固定10分钟。

去除甲醛，并用 PBS 洗涤三次。切勿让细胞干燥，始终使用 PBS 缓冲溶液。为避免低渗应激，向 200 微升 0.1% BSA 溶液中加入两微升浓度为 50 微克/毫升的 EGF Alexa 647 储存液，然后将该溶液加入 HeLa 细胞中。

室温孵育30分钟。移除溶液，用PBS洗涤3次。加入0.1% BSA封闭液，室温放置15分钟。

随后，移除封闭液，并用 PBS 再洗涤三次，然后进行成像。成像前，通过将葡萄糖氧化酶和还原剂储存液按 50 微升、400 微升和 100 微升的比例混合来配制切换缓冲液，再加入 PBS 至终体积为 1 毫升。移除成像腔中的 PBS，然后用切换缓冲液加满至顶部。

将盖玻片小心地覆盖在腔室顶部，确保完全无气泡且整个腔室均被覆盖。若发现气泡，需补充额外缓冲液或 PBS。否则，缓冲液性能可能下降。

采集高质量的稀疏连接数据对于本实验的成功至关重要，因此请确保显微镜正确聚焦，并使用正确的成像参数。找到需要成像的感兴趣荧光结构。选择所需的照明角度。

在这种情况下，建议采用平铺式或高度倾斜的角度，因为这可以通过减少失焦光线来提高信噪比，对细胞样品尤其有利。在进行STORM成像之前，先获取该结构的衍射极限参考图像。成像时，将激发激光增加至高功率，约为2千瓦/平方厘米，同时将相机设置为10毫秒曝光时间，循环时间约为50赫兹（即每秒50帧）。

当荧光点阵列转变为稀疏闪烁模式后，采集 10,000 帧图像以开始重建。在 MATLAB 中打开 RAINSTORM M 文件，并在 rainstorm 窗口中运行该文件。

使用浏览按钮选择要分析的图像文件。该文件应为 TIF 格式。调整像素宽度，以匹配用于获取数据的显微镜系统的原始数据。

其他参数保留默认设置。点击“处理图像”按钮，等待初步图像出现。处理所需时间取决于文件大小、计算机配置以及原始数据中候选链接的数量。

要生成更新的超分辨率图像，请按下“打开审阅器”按钮，此时将出现第二个窗口。按下“调整对比度”按钮，以按需更改图像显示效果。在某些图像非常暗的情况下，应降低最大值。

使用审阅窗口生成有用的图像质量指标，并进一步优化超分辨率图像。将前三个质量控制参数保留默认值，分别为 5,000、0.1 和 0.8 到 3.5。更新每光子计数值。

调整定位精度截断值，以在优化平均定位精度与定位数量之间进行权衡。在最终图像中，建议根据数据质量和样本情况选择30至50纳米的数值。重建缩放因子默认值为5，假设原始图像中的像素为160纳米，则会生成32纳米的超分辨率像素。

如果原始图像的像素尺寸为100纳米，则将生成像素为20纳米的超分辨率图像。增加缩放因子可生成更小的超分辨率像素。在最终图像中，按下运行审阅者按钮以生成更新后的超分辨率图像。

按下“查看直方图”按钮以显示图像质量指标。最后，在审阅器中按下“保存图像”按钮以保存所有这些数据。首先，以与之前演示相同的方式生成一幅图像，开始此操作流程。

在审阅器中按下框选跟踪按钮，然后在审阅的图像上的定位标记上点击并拖动以绘制一个方框。等待新图像出现，新图像将显示框选的位置。如果感兴趣的对象是定位标记，可根据需要保存此图像。

与本例相同，通过单击“设置锚点”按钮，然后单击“减去漂移”按钮来执行漂移校正。最后，再次单击运行审阅器以生成新的STORM图像。成功包被葡聚糖后应产生荧光单层，本图展示了典型的葡聚糖数据。

衍射极限下的图像显示了在进行STORM成像前不同浓度的糊精。超分辨率重建图像的像素大小为25纳米。共采集了10,000张图像，帧尺寸为128×128像素，并展示了该序列中的单帧图像。

在高浓度右旋糖酐条件下，荧光单分子层应呈现相对均匀的状态，如这些图像和视频片段所示。在较低浓度下，闪烁点将显得更稀疏且更清晰可见。

在恒定激光照射下的图像采集阶段，由于无明显背景信号，随着成像时间的延长，闪烁点数量将逐渐减少，这可通过高密度样品中第2000帧与第8000帧的对比得到说明。高、中、低浓度葡聚糖样品的超分辨图像之间的主要差异在于定位点数量的递减。该图展示了每种葡聚糖浓度下三次10000帧序列的平均结果，误差线表示标准差。

然而，荧光分子浓度、原始数据中的闪烁次数与定位点数量之间的比例关系并非简单的线性关系，如每帧接受的定位点数量的图表所示。在分子密度极高的情况下，使用滚动的100帧平均值时，无论成像何种样品，软件均无法成功地对分子进行定位。一个常见问题是在成像过程中，由于荧光物质在介质中扩散，导致图像上出现明亮但失焦的荧光晕染。

通过在添加切换缓冲液之前增加使用 PBS 的洗涤步骤次数，或向腔室中添加新鲜的切换缓冲液，可以防止或去除这些游离的荧光分子。对每组图像序列的数据进行处理和比较，会得到截然不同的超分辨率图像。图 C 和图 D 分别是对应于图 A 和图 B 所采集数据构建的超分辨率图像。该图显示了每帧中被接受的定位分子数量，采用滚动平均法计算连续 100 帧的平均值。

红线对应于背景较高的 A 和 C 风暴序列，蓝线对应于背景较低的 B 和 D 序列。第二幅图显示了与高背景和低背景数据相对应图像中被接受的定位数量。这三幅衍射受限图像展示了在加入切换缓冲液和进行风暴成像之前，附着在玻璃表面的预先形成的肌动蛋白丝的典型数据。

可见不同长度的丝状结构。非常明亮的丝状结构通常是由多根丝状物缠绕在一起形成的。在采集阶段，选择单根且相对较亮的丝状结构，而非缠绕区域，可获得更高质量的图像。

在细丝的整个长度上应观察到明亮且聚焦清晰的闪烁点。在采集阶段及后续的数据处理过程中，应观察到稀疏的闪烁现象。每帧的定位图像中应呈现一条细长且连续的细丝，并显示出逐渐减弱的趋势。

通常，通过在 ImageJ 中使用“剖面分析”功能，对肌动蛋白丝的放大区域绘制一条直线，随后进行高斯拟合，以此将丝状结构的半高全宽（FWHM）作为分辨率的经验估计值。此处计算得到的 FWHM 为 43.2 纳米。当多个肌动蛋白丝出现分支或相互交叉时，可能会产生定位偏差问题，可通过处理帧的子集并比较前 5,000 帧和后 5,000 帧来识别该问题。

使用前 5,000 帧生成的超分辨率图像呈现出不同的结果。图像中心可见大量定位点。然而，当使用后 5,000 帧时，这些定位点几乎不明显，仅剩下丝状结构，但由于图像中定位点数量较少，丝状结构呈现为一定程度的连续形态。

如果怀疑密度过高导致闪烁，通过将图像与每帧的定位数据进行比较，可以强烈提示该问题发生在前几组帧中。前几组帧的平均每帧定位数超过10个，而最后几组帧的平均每帧定位数约为4个。STORM显微成像中的另一个潜在问题是漂移，即样品相对于物镜发生移动。尽管在图像采集阶段很难察觉，但在已知结构（如肌动蛋白丝）的超分辨率图像中可以检测到漂移现象。

侧向漂移发生的首个迹象可能是结构尺寸大于预期。例如，与暴雨条件下的精度极限数据相比，半高全宽值相对较大：本例中为90纳米，而精度极限为67纳米。检测漂移更有效的方法是将定位结果作为时间的函数进行比较，即观察后期帧中的定位位置是否相对于早期帧发生了位移。

这一点在使用颜色编码显示肌动蛋白丝时尤为明显。如图 B 和 c 所示，利用 RainSTORM 中的盒跟踪功能，定位点会根据其采集时所在的帧数以对应颜色显示。例如，采集序列早期的定位点为蓝色，而采集序列后期的定位点为红色。

颜色的偏移表明已发生漂移，以便进行测量和校正。可使用直径为100纳米的荧光微球作为基准标记，编号一至四分别显示了单独裁剪并放大的微球图像。在一个示例中，在采集阶段的三分钟十秒内发生了约100纳米的相对严重漂移，此时可使用相同的框追踪功能对漂移进行颜色编码并确认其发生；在此示例中，四个微球显示出几乎相同的漂移行为，因此可以选择其中一个（此处为微球二）作为参考，并从其他微球中减去该漂移量。

与图E对比显示，横向漂移已被校正。最后，使用表皮生长因子标记的HeLa细胞可提供一个关于图像分辨率的真实示例。在细胞中，图A显示了聚焦于细胞基底表面的HeLa细胞部分的衍射受限图像，其中黄色框标示了在图B和图C中放大的感兴趣区域，相比之下，衍射受限图像中的放大感兴趣区域则模糊不清。

超分辨图像应显示簇状结构与偶尔孤立的单个像素的混合。这些簇状结构的直径约为100纳米，可能对应于正在形成的凹陷和囊泡。EGF主要通过该途径被下调并内吞，每帧的内吞定位数据如图D所示，并在图G中以图表形式呈现。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备一些简单的测试样品、采集数据以及重建高质量的STORM（随机光学重建显微镜）超分辨图像。

这些方法将有助于避免一些常见的拟合陷阱（例如漂移），并帮助优化您的风暴实验。参见分辨率实验。