试验样品为优化风暴超高分辨率显微镜

此过程的总体目标是演示如何获取高质量的风暴超分辨率图像。这是通过首先制备荧光标记的测试样品来完成的。第二步是准备切换缓冲液，然后将缓冲液填充成像室。

接下来，在 Storm 显微镜上采集原始数据。最后一步是使用暴雨处理软件从原始数据中重建超分辨率图像。最终，测试样品用于展示如何获取高质量的原始数据，然后对其进行处理以在细胞中生成分辨率在 30 到 50 纳米之间的风暴超分辨率图像，这比传统的荧光显微镜技术（包括 Turf 和 Cofocal）的分辨率提高了 5 到 10 倍。

通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为他们没有意识到收集大量高质量稀疏链接的重要性。通过在正确的切换缓冲液中使用 Alexa 6 4 7 染料，这变得更加容易。该技术的直观演示至关重要，因为获取高质量的原始数据对于生成 SPR 分辨率图像至关重要。

该技术的原始视频序列看起来与任何其他形式的荧光显微镜检查完全不同。开始用 200 微升 0.01% 聚赖氨酸溶液的荧光糊精涂布玻璃到八室盖玻片的每个孔中，并孵育 10 分钟。10 分钟后，用移液管去除聚赖氨酸溶液，确保没有液体保持稀释状态。

0.25 微升每毫升 2 毫克的糊精储备液。将 Alexa 6 47 加入 25 微升去离子水中，形成每毫升 20 微克的溶液，形成高密度的糊精涂层。Alexa 6 47 解决方案。

将 20 微升/毫升 20 微克溶液稀释到总共 200 微升的去离子水中。对于中等密度溶液，在 200 μL 去离子水中稀释 2 μL。对于低密度溶液，稀释 0.2 μL。

在 200 μL 去离子水中，向每个孔中加入 200 μL 稀释的糊精 Alexis X 47 溶液，并孵育 10 分钟。可以使用更长的孵育时间，这可能会导致更致密的糊精涂层。最后，去除 Dexter Xis X 47 溶液并用水洗涤 3 次。

要首先在玻璃上制备荧光肌动蛋白丝，向八室的每个孔中加入 200 微升 0.01% 聚赖氨酸溶液。盖上玻璃杯并孵育 10 分钟。用移液管取出，确保没有液体残留。

向每个腔室中加入 90 微升先前根据制造商的说明重构的通用肌动蛋白缓冲液。然后加入 10 微升 10 微摩尔预制肌动蛋白丝溶液和 1 微升 foid 和 Alexa 6 47，轻轻上下吹打混合，在室温下孵育 30 分钟，制备微球荧光珠作为基准标记物，将 1 微升 tepec 珠稀释到 200 微升 PBS 中并混合。将稀释的微珠加入成像室中，等待 15 分钟。

15 分钟后，去除溶液并用 PBS 洗涤 3 次，然后成像 he 一个培养至约 80% co fluly 的细胞在本实验中使用。去除培养基并用 PBS 洗涤。然后加入 500 微升 4% 甲醛溶液 10 分钟。

去除甲醛并用 PBS 洗涤 3 次。不要让细胞保持干燥，并始终使用 PBS 缓冲溶液。为避免低渗应激，加入 2 微升每毫升 50 微克的 EGF Alexa 储备溶液、6 47 至 200 微升 0.1% BSA 溶液，然后将该溶液添加到 hela 细胞中。

在室温下孵育 30 分钟。取出溶液并用 PBS 洗涤 3 次。加入 0.1% BSA 的封闭溶液，在室温下放置 15 分钟。

之后，去除封闭溶液并在成像前用 PBS 再洗涤 3 次。在成像之前，通过将葡萄糖酶和还原剂储备溶液混合在一起来制备转换缓冲液以 50 微升、400 微升和 100 微升的比例，加入 PBS 以将最终体积补足至 1 毫升。从成像室中取出 PBS，然后用切换缓冲液填充到顶部。

小心地将盖玻片放在腔室顶部，确保根本没有气泡并且整个腔室都被覆盖。如果看到任何气泡，请加注额外的缓冲液或 PBS。否则，缓冲区性能可能会下降。

收集高质量、稀疏链接数据对于此程序的成功至关重要，因此请确保显微镜正确聚焦并使用正确的采集设置。找到要成像的感兴趣荧光结构。选择所需的照明角度。

在这种情况下，建议使用草皮或高度倾斜的角度，因为这可以通过最大限度地减少离焦光来提高信噪比，这对细胞样品特别有益。在风暴成像之前参考结构的分数限制图像。将激发激光增加到相当于每平方厘米约 2 千瓦的高功率，同时以 10 毫秒曝光的相机设置和大约 50 赫兹或每秒帧数的循环时间进行成像。

一旦 flora fours 转变为稀疏闪烁的模式，收集 10， 000 帧。开始这种重建。从 MATLAB 中打开 RAINSTORM M 文件，然后在 rainstorm 窗口中运行它。

使用浏览按钮选择要分析的图像文件。这应该是一个 TIF 文件。更改像素宽度以匹配用于采集数据的显微镜系统的原始数据。

将其他值保留为默认值。按 Process images 按钮并等待初步图像出现。处理的持续时间将取决于文件大小、计算机规格和原始数据中候选链接的数量。

要生成更新的超分辨率图像，请按打开检查器按钮，将出现第二个窗口。按调整对比度按钮可根据需要更改图像显示。在图像非常暗的某些情况下，应减小最大值。

使用 reviewer 窗口生成有用的图像质量指标并进一步优化超分辨率影像。将前三个质量控制参数保留为默认值 5、000、0.1 和 0.8 到 3.5。更新每个光子的计数值。

更改定位精度截止值，以便在优化平均定位、精度与定位数字之间进行权衡。在最终图像中，根据数据和样品的质量，建议使用 30 到 50 纳米的值。重建比例因子默认为 5，这将生成 32 纳米的超分辨率像素，假设原始图像中的像素为 160 纳米。

如果 Raw 图像的像素大小为 100 纳米，则将生成像素为 20 纳米的超分辨率图像。增加缩放因子以生成更小的超分辨率像素。在最终图像中，按 run reviewer 按钮以生成更新的超分辨率图像。

按 view histograms 按钮以显示图像质量指标。最后，按 reviewer 中的 save image 按钮以保存所有这些数据。通过以与前面演示相同的方式生成映像来开始此过程。

按检查器中的框跟踪按钮，然后单击并拖动一个框到已审阅图像上的基准标记上。等待新图像出现，该图像将显示框内位置。如果需要，如果感兴趣的对象是基准标记，请保存此图像。

与此处的情况一样，通过单击 set anchor 按钮，然后单击 subtract drift 按钮来执行漂移校正。最后，再次单击 run reviewer 以生成新的 storm 图像。成功的糊精包被应产生荧光单层，典型的糊精数据如图所示。

衍射极限图像显示暴风成像前不同浓度的糊精。超分辨率重建的像素尺寸为 25 纳米。以 1 28 x 1 28 像素的帧大小收集了 10， 000 张图像，并显示了该序列中的单个帧。

在高糊精浓度下。荧光单层应显得相对均匀，如这些图像和此视频片段所示。在较低浓度下，闪烁会显得更稀疏且清晰。

在恒定的激光照明下，由于在此图像采集阶段没有明显的背景，闪烁次数将随着时间的推移而减少，如高密度样品中第 2000 帧和第 8， 000 帧之间的比较所示。高、中、低糊精浓度的超分辨率图像之间的主要区别在于定位数量的减少。该图显示了每种糊精浓度的三个 10， 000 帧序列的平均值，其中误差线表示标准偏差。

然而，原始数据中荧光分子浓度的闪烁次数与定位次数之间的这种比例关系并不是一个简单的线性关系，如每帧接受的定位次数图所示。在非常高的分子密度下使用 100 帧滚动平均值，该软件在对任何样品进行成像时无法成功定位分子。一个常见的问题可能是由于荧光力通过介质扩散而导致图像中出现明亮但未聚焦的荧光雾霾。

通过在添加切换缓冲液之前增加 PBS 的洗涤步骤数，或者通过在腔室处理中加入新的切换缓冲液来防止或去除这些分离的荧光分子，并比较来自每个图像序列的数据，从而产生非常不同的超分辨率图像。面板 C 和 D 是超分辨率影像结构，分别对应于面板 A 和 B 中收集的数据。此图使用滚动 100 帧平均值绘制每帧接受的本地化数量。

红线对应于背景较高的风暴序列 A 和 C，蓝线对应于背景较低的 B 和 D。第二个图表中显示了对应于高背景数据和低背景数据的图像的接受本地化编号。这三个衍射极限图像显示了在添加切换缓冲液和风暴成像之前粘附在玻璃表面的预制肌动蛋白丝的典型数据。

可以看到不同长度的细丝。非常亮的细丝通常是几根缠结在一起的细丝。在采集阶段，选择单个相对较亮的细丝而不是缠结区域可以获得更好的图像质量。

沿着灯丝的长度应该可以看到明亮的焦点闪烁。在采集阶段和随后的工艺数据中应看到稀疏闪烁。在每帧的定位中应该有一根细的连续细丝，应该显示逐渐下降。

通常，通过使用图像 J 中的绘图剖面功能绘制一条穿过肌动蛋白丝放大区域的直线，然后执行高斯拟合，将细丝的全半最大值或 FWHM 作为分辨率的经验估计给出。FWHM 计算为 43.2 纳米。通过处理帧子集并比较前 5， 000 帧和后 5， 000 帧，当许多肌动蛋白丝分枝和/或相互交叉时，可能会出现错误定位问题。

在超分辨率图像中使用前 5， 000 帧生成不同的图像。在图像中间可以看到许多定位。然而，当使用最后 5， 000 帧时，这些定位中很少有明显的，并且由于图像中的定位数量较少，只留下细丝，尽管有些连续。

如果怀疑闪烁密度过高，则将图像与每帧数据的定位进行比较可以强烈表明此问题发生在第一组帧期间。每帧的平均本地化数超过 10 个，而上一组帧约为 4 个。风暴显微镜中的另一个潜在问题是漂移，当样品相对于物镜移动时就会发生漂移。在数据采集阶段，虽然在图像采集阶段很难检测到，但可以在已知结构（如肌动蛋白丝）的超分辨率图像中检测到漂移。

可能发生横向漂移的第一个迹象是结构比预期的要大。例如，与暴雨的精度极限数据相比，一个相对较大的全半最大值，在本例中为 90 纳米与 67 纳米。检测漂移的更好方法是将定位作为时间 IE 的函数进行比较，查看与早期帧中的定位相比，后面的帧中的定位是否被移位。

当使用颜色代码显示时，在肌动蛋白丝的情况下可以清楚地看到这一点。如面板 B 和 C 所示，在暴雨中使用框跟踪功能，定位以与获取时的帧号相对应的颜色显示。例如，客户采集序列中早期的本地化为蓝色，而客户采集序列中后期的本地化为红色。

移位的颜色表示已发生漂移，以便进行测量和校正。对于漂移，直径为 100 纳米的荧光珠可用作基准标记，编号 1 到 4 分别显示裁剪和缩放的珠子。在采集阶段的 3 分 10 秒内出现大约 100 纳米的相对严重的漂移的例子中，可以使用相同的框跟踪功能对漂移进行颜色编码并确认漂移的发生，因为本例中的所有四个磁珠都显示几乎相同的漂移，可以选择其中一个，在本例中为磁珠 2 用作参考并减去漂移从其他珠子中。

与图 E 的比较表明，横向漂移已得到纠正。最后，表皮生长因子染色的 heela 细胞可用于给出图像分辨率的真实示例。在单元中，面板 A 显示了聚焦在基底细胞表面的 hela 细胞部分的衍射极限图像，其中黄色框表示放大的感兴趣区域，如图 B 和 C 所示，而衍射极限图像中模糊的放大感兴趣区域。

超分辨率图像应显示偶尔孤立的单个像素的群集混合。这些簇的直径约为 100 纳米，可能对应于形成的凹坑和囊泡。图 G 显示了 EGF 主要下调的途径和来自图 D 的每帧数据的内吞定位.观看此视频后，您应该对如何制作一些简单的测试样本、获取数据和重建高质量风暴有很好的了解，参见分辨率图像。

这些方法将有助于避免一些常见的拟合陷阱，例如漂移，并有助于优化您的 Storm。请参阅分辨率实验。